第三章

蛋白質(zhì)化學3.1

蛋白質(zhì)的重要性和一般組成Protein——來自希臘字母，意思是“頭等重要的，原始的”蛋白質(zhì)——來源于對蛋清（清蛋白）的研究分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。大事記：1833年1864年P(guān)ayen和Persoz分離出淀粉酶。Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，并將其制成結(jié)晶。19世紀末Fischer證明蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，并將氨基酸合成了多種短肽。1938年

德國化學家Gerardus

J.

Mulder引用“Protein”

一詞來描述蛋白質(zhì)。1951年

Pauling采用X（射）線晶體衍射發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)——α-螺旋(α-helix)。1953年1962年FrederickSanger完成胰島素一級序列測定。

John

Kendrew

和Max

Perutz確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。20世紀90年代以后

后基因組計劃。一、什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(amino

acids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。二、蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能

1）酶的生物催化作用2）調(diào)控作用參與基因調(diào)控：組蛋白、非組蛋白等參與代謝調(diào)控：如激素或生長因子等3）運動與支持機體的結(jié)構(gòu)蛋白：頭發(fā)、骨骼、牙齒、肌肉等4）參與運輸貯存的作用血紅蛋白——運輸氧銅藍蛋白——運輸銅鐵蛋白——貯存鐵5）免疫保護作用抗原抗體反應凝血機制6）參與細胞間信息傳遞信號傳導中的受體、信息分子等7）氧化供能三、蛋白質(zhì)的一般組成組成蛋白質(zhì)的元素主要元素組成50

~

55

%6

~

7

%19

~24

%13

~

19

%CHONS0

~

4

%有些蛋白質(zhì)還含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。

蛋白質(zhì)元素組成的特點各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。凱氏定氮法：由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=

每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1003.2

蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位—氨基酸（amino

acid）一、蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵與一般的酰胺鍵一樣可以被酸堿或蛋白酶催化水解，酸或堿能夠?qū)⒍嚯耐耆?，酶水解一般是部分水?完全水解得到各種氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各種氨基酸的混合物。

所以，氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元。大多數(shù)的蛋白質(zhì)都是由20種氨基酸組成。這20種氨基酸被稱為基本氨基酸。1、酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時。此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化，得到的是L-氨基酸。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；天門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。2、堿水解一般用5

mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化，其產(chǎn)物是D-型和L-型氨基酸的混合物。該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受破壞。3、酶水解目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。應用酶水解多肽不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。最常見的蛋白水解酶有以下幾種：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶。二、α

一氨基酸的一般結(jié)構(gòu)α

一氨基酸是一切蛋白質(zhì)的組成單位。氨基酸是羧酸分子中α－碳原子上的一個氫原子被氨基取代而成的化合物，故稱α

一氨基酸。例如丙酸的α－碳原子上的一個H被氨基取代即得丙氨酸。氨基酸有D-型及L-型氨基酸的D一型或L一型是以L一甘油醛或L一乳酸為參考的。三、氨基酸的分類（一）根據(jù)來源分：內(nèi)源氨基酸和外源氨基酸（二）從營養(yǎng)學角度分：必需氨基酸和非必需氨基酸Ile Met

Val

Leu

Trp

Phe

Thr

Lys—

家

寫

兩

三

本

書

來（三）根據(jù)是否組成蛋白質(zhì)來分：蛋白質(zhì)中常見氨基酸、蛋白質(zhì)中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸1、蛋白質(zhì)中常見氨基酸的結(jié)構(gòu)甘氨酸

GlycineGly

GOH2N

CH

C

OHH氨基乙酸脂肪族氨基酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

AlanineAla

A脂肪族氨基酸OH2N

CH

C

OHCH3a-氨基丙酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

ValineVal

V脂肪族氨基酸OH2N

CH

C

OHCH

CH3CH3a-氨基異戊酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

LeucineLeu

LOH2N

CH

C

OHCH2CH

CH3CH3脂肪族氨基酸a-氨基異己酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

IleucineIle

I脂肪族氨基酸a-氨基-b-甲基戊酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

Ileucine脯氨酸

ProlinePro

P亞氨基酸HNC

OOHb-吡咯烷基-a-羧酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸Valine亮氨酸Leucine異亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸MethionineMet

M含硫氨基酸OH2N

CH

C

OHCH

2CH

2SCH

3a

-氨基-g-甲硫基丁酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine纈氨酸

Valine亮氨酸

Leucine異亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Pralines甲硫氨酸

Methionine半胱氨酸

CysteineCys

C含硫氨基酸a

-氨基-b-巰基丙酸苯丙氨酸PhenylalaninePhe

F芳香族氨基酸H

2N

CH

C

OHCH

2Oa

-氨基-b-苯基丙酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸

TyrosineTyr

Y芳香族氨基酸H

2

N

CH

C

OHCH

2OOHa

-氨基-b-對羥苯基丙酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸

Tyrosine色氨酸

TryptophanTrp

W芳香族氨基酸H

2N

CH

C

OHCH

2OHNa

-氨基-b-吲哚基丙酸精氨酸

ArginineArg

R堿性氨基酸OH

2

N

CH

C

OHCH

2CH

2CH

2NHCNH

2NHa

-氨基-d-胍基戊酸精氨酸

Arginine賴氨酸

LysineLys

K堿性氨基酸OH2N

CH

C

OHCH2CH2CH2CH2NH2a，e-二氨基己酸精氨酸Arginine賴氨酸Lysine組氨酸HistidineHis

H堿性氨基酸OH2N

CH

C

OHCH2NNHa

-氨基-b-咪唑基丙酸天冬氨酸

AspartateAsp

D酸性氨基酸OH2N

CH

C

OHCH2C

OOHa

-氨基丁二酸天冬氨酸Aspartate谷氨酸

GlutamateGlu

E酸性氨基酸OH2N

CH

C

OHCH2CH2C

OOHa

-氨基戊二酸絲氨酸

SerineSer

S含羥基氨基酸OH2N

CH

C

OHCH2OHa

-氨基-b-羥基丙酸絲氨酸

Serine蘇氨酸

ThreonineThr

T含羥基氨基酸OH2N

CH

C

OHCH

OHCH3a

-氨基-b-羥基丁酸天冬酰胺

AsparagineAsn

N含酰胺氨基酸OH2N

CH

C

OHCH2C

ONH2天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺

GlutamineGln

Q含酰胺氨基酸OH2N

CH

C

OHCH

2CH

2C

ONH

2按R基極性分類20種常見氨基酸非極性R基團氨基酸：8種—Ala

Val

Leu

Ile

PhePro

Met

Trp極性不帶電荷R基團氨基酸：7種—Ser

Thr

AsnGln

Try

Cys

Gly帶負電荷R基團氨基酸：2種—Asp

Glu帶正電荷R基團氨基酸：3種—Lys

Arg

His硒代半胱氨酸：HSe-CH2-CH-COOHNH22.蛋白質(zhì)中幾種重要的稀有氨基酸NH在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由相應的基本氨基酸衍生而來的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)如下。HOCOOH4-羥羥羥羥羥H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羥羥羥羥羥CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOHNH26-N-甲羥羥羥羥HOIICH2CHCOOHNH23,5-二二二羥羥3.非蛋白氨基酸廣泛存在于各種細胞和組織中，呈游離或結(jié)合態(tài)，但并不存在蛋白質(zhì)中的一類氨基酸，大部分也是蛋白質(zhì)氨基酸的衍生物。H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOHb-丙氨酸g-氨基丁酸非蛋白氨基酸存在的意義：作為細菌細胞壁中肽聚糖的組分：D-Glu

D-Ala作為一些重要代謝物的前體或中間體:b-丙氨酸（VB3）、鳥氨酸（Orn）、胍氨酸（Cit）(尿素)作為神經(jīng)傳導的化學物質(zhì)：g-氨基丁酸有些氨基酸只作為一種N素的轉(zhuǎn)運和貯藏載體（刀豆氨酸）調(diào)節(jié)生長作用殺蟲防御作用絕大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。四、氨基酸的理化性質(zhì)（一）氨基酸的一般物理性質(zhì)1.氨基酸的旋光性除甘氨酸外，氨基酸含有一個手性a-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。2.氨基酸的光吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<200nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的lmax＝275nm，苯丙氨酸的lmax＝257nm，色氨酸的lmax＝280nm，高熔點一般均溶于水，溶于強酸、強堿；不溶于乙醚。氨基酸一般有味（二）氨基酸的兩性性質(zhì)和等電點1.氨基酸的兼性離子形式氨基酸的兩個重要性質(zhì)：氨基酸晶體的熔點高（?200

0C）；氨基酸使水的介電常數(shù)增高。HH3N+-C-COO-R2.氨基酸的兩性解離在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。H3N+COO-C

HRpK1'-H++H+H3N+COOHC

HR-H+pK2'+H+COO-H2N

C

HRpH1710凈電荷+1正離子0兩性離子-1負離子等電點pI氨基酸的等電點（isoeletric

point）及其計算氨基酸的等電點：當外液pH為某一pH值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。氨基酸等電點的計算：側(cè)鏈不含離解基團的中性氨基酸，其等電點是它的pK’1和pK’2的算術(shù)平均值：pI=(pK’1

+pK’2)/2同樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1

+pK’

R-COO-)/2堿性氨基酸：pI=

(pK’2

+pK’R-NH2

)/2谷氨酸的解離及等電點計算賴氨酸的解離及等電點計算小

結(jié)某氨基酸的等電點即為該氨基酸兩性離子兩邊的pK值和的一半。在氨基酸等電點以上任何pH，AA帶凈的負電荷，在電場中向陽極移動；在氨基酸等電點以下任何pH，AA帶凈的正電荷，在電場中向陰極移動。在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點愈遠，AA帶凈電荷愈多。（三）氨基酸的化學反應C

O

O

HH

2

N

C

HR亞硝酸鹽反應烴基化反應

?；磻摪被磻鞣饓A反應成鹽成酯反應成酰氯反應

脫羧基反應

疊氮反應側(cè)鏈反應1、α-氨基參與的反應（1）亞硝酸反應這是范斯來克（Van

Slyke）法測定氨基氮的基礎(chǔ)（2

）氨基酸的甲醛滴定pK'2H+COO-CH2NH2COO-CH2NH3++COO-CH2NHCH2OHHCHO羥甲基衍生物用途：可以用來直接測定氨基酸的濃度。（3）與2、4-二硝基氟苯反應（烴基化反應）AADNFB+

多肽蛋白弱堿DNP-AADNP-多肽

DNP-蛋白+

HF酸解DNP-AA（有機相）

+游離AA（水相）用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)N末端氨基酸.亦稱Sanger反應（黃色）（4）與苯異硫氰酸酯反應（烴基化反應）AAPITC+

多肽蛋白AAPTC—多肽蛋白弱堿無水甲酸或HFPTH-AA+少一個AA的多肽或蛋白（乙酸乙酯）用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)N末端氨基酸.亦稱Edman反應（5）與丹磺酰氯反應（?；磻〢A多肽蛋白DNS

+弱堿AADNS-多肽蛋白酸DNS-AA+游離AA（乙醚抽提，有熒光）用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)N末端氨基酸.N(CH3)2R

OH2N

CH

CR

OSO2

HN

CH

CN(CH3)2+水水N(CH3)2SO2R

OHN

CH

C

OH+羥羥羥SO2Cl丹丹丹丹多多N-端丹丹丹N-端羥羥羥丹丹丹羥羥羥（6）與芐氧酰氯反應（酰基化反應）（7）形成西佛堿反應2、α-羧基參與的反應疊氮反應用途：這是羧基活化的一個重要反應，常用于肽的人工合成成酰胺反應

脫羧反應3、α-氨基與α-羧基共同參加的反應（1）與茚三酮反應CCOC

OO茚三酮CCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮+NH3弱酸藍紫色化合物（570nm）用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。脯氨酸與茚三酮反應的產(chǎn)物：亮黃色化合物（440nm）（2）成肽反應2R1

OH

N

C

C

OHHR2H

N

C

COOHH

H+2H

OCOOH2R1

O

R2H

N

C

C

N

CH

H

H-多肽用途：是多肽和蛋白質(zhì)生物合成的基本反應。（4）由側(cè)鏈R基團產(chǎn)生的反應見P89表3-9五、氨基酸的分析分離為了測定蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成或從蛋白質(zhì)水解液中制取氨基酸，都需要對氨基酸混合物進行分析和分離工作。其方法較多，而目前使用較多的是層析法。（1）分配層析的一般原理：所有的層析系統(tǒng)都有兩個相組成，一個為固定相或靜相（stationaryphase），一個為流動相或動相（mobilephase）?；旌衔镌趦上嘀械姆蛛x決定于混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)（

partition

or

distribution

coefficient）來描述：當一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中進行分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（Kd）。用下式表示：CA

←

表示某一物質(zhì)在動相中的濃度Kd=———CB←表示某一物質(zhì)在靜相中的濃度物質(zhì)分配不僅可以在互不相溶的兩種溶劑即液相-液相系統(tǒng)中進行，也可在固相-液相或氣相-液相間發(fā)生。其系統(tǒng)中的靜相可以是固相、液相或固-液混合相（半液體相）；動相可以是液相或氣相，它充滿于靜相的空隙中，并能流過靜相。在實際層析時，其層析行為一般并不直接決定于它的分配系數(shù)，而是取決于有效分配系數(shù)Keffo：某一物質(zhì)在A相中的總量Keffo=—————————————某一物質(zhì)在B相中的總量對液相-液相層析系統(tǒng)來說：CA·VAKeffo

=

———

=

Kd·RVCB·VB這里，CA和CB的意義同前；VA和VB分別為A相B相的體積；RV為A、B兩相的體積比。由此可見，Keffo

是RV的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)整兩相的體積比而加以改變。利用層析法分離混合氨基酸，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異。一般差異越大，越容易分開。若是逆流分溶或逆流分配，當轉(zhuǎn)移n次后，某一物質(zhì)在（n+1）個管中分布的分數(shù)含量是（p+q)n=1展開式的相應項的值。這里p和q分別為某一物質(zhì)在靜相和動相中的分數(shù)含量，即

p+q=1。例如物質(zhì)Y的Kd=q(動相)/(靜相)p=1

即:

p+q=1/2+1/2=1轉(zhuǎn)移n次后,在第k號管中某一物質(zhì)的含量可由下式計算:n！·

pn-k+1

·

qk-1Tn,k=———————————（n-k+1）！·（k-1）！例題：當某一物質(zhì)在一個層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為3時，物質(zhì)被轉(zhuǎn)移4次后在第四管中的含量是多少？解：根據(jù)分配系數(shù)公式可知：p+q=1/4+3/4=1，即在靜相中的分數(shù)含量為1/4，在動相中的分數(shù)含量3/4，則可由上述公式計算如下：4！·1/4

·（3/4)3T4,4=—————————=27/643！假若該物質(zhì)的總量為96，則該管中的含量應為：（27/64）

·

96=40.5怎么辦？6461813123641216486481616161632329271688816逆流分溶原理分配系數(shù)為1上相為動相（A），下相為靜相（B）分配系數(shù)為33010Kd=1Kd=3管中物質(zhì)

20的總量2

4

6

8

10

12

14

16

管號分溶曲線結(jié)論：分配系數(shù)大的物質(zhì)沿一系列分溶管的移動速度快于分配系數(shù)小的物質(zhì)n=600相對濃度n=100n=10溶劑系統(tǒng)體積分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)（理論板數(shù)）的依賴關(guān)系(2)

分配柱層析層析柱中的填充劑或支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。支持劑表面附著一層不會流動的結(jié)合水作為固定相，沿固定相流過的與它互不相溶的溶劑（如苯酚、正丁醇等）是流動相。由填充劑構(gòu)成的柱床可以設(shè)想為由無數(shù)的連續(xù)的板層組成，每一板層起著微觀的“分溶管”作用。當用洗脫劑洗脫時，在柱上端的氨基酸混合物在兩相之間按不同的分配系數(shù)進行連續(xù)不斷的進行分配移動。分部收集層析柱下端的洗脫液，然后分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值20

40

60

80

100

120流出液（毫升）溶劑前沿濾紙層析中的Rf值，Rf

=X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水YX氨基酸的雙向濾紙層析圖譜（3）濾紙層析濾紙層析也是分配層析的一種。這里的濾紙纖維素吸附水作為固定相，展層用的溶劑是流動相。層析時，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。層析時，將樣品點在濾紙的一個角上，稱為原點。然后將其放入一個密閉的容器中，用一種溶劑系統(tǒng)進行展層，層析后烘干濾紙，再將其旋轉(zhuǎn)90度采用第二種溶劑系統(tǒng)進行第二相展層。由于各種氨基酸在兩個不同的溶劑系統(tǒng)中具有不同的遷移率（

Rf

），因此它們就會彼此分開，當用茚三酮顯色時，就會在濾紙上面出現(xiàn)各種氨基酸的斑點。當然，若氨基酸種類較少或一相就能分開，進行一相層析即可。層析缸薄層板（側(cè)面）溶劑薄層層析裝置（4）薄層層析（thin-layer

chromatography)：該層析分辨率高，需量極少，層析速度快，可使用的支持劑種類多，如纖維素粉、硅膠、氧化鋁等。其步驟大體如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成為一個均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進行展層，使樣品中各個成分分開，最后進行鑒定和定量分析。蓋子（5）離子交換層析（ion-exchange

column

chromatography)這是一種用離子交換樹脂作支持劑的層析法。離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進行聚合和交聯(lián)反應生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹脂的基質(zhì)，帶電基團是通過后來的反應引入基質(zhì)的，樹脂一般都制成球形顆粒?！狢H2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—SO3——CH

—CH2—CH2—CH—苯環(huán)—SO3—有氫型和鈉型H+或Na+H+或Na+樹脂分陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂含有的酸性基團如—SO3H（強酸型）或—COOH（弱酸型）可解離出

H+離子，當溶液中含有其它陽離子時，例如酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子，它們可以和H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。同樣地，陰離子交換樹脂含有的堿性基團如—N（CH3）3OH（強堿型）或—NH3OH（弱堿型）可解離出OH-，它能和溶液中的陰離子如堿型環(huán)境中的氨基酸陰離子發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。氨基酸在樹脂上結(jié)合的牢固程度即氨基酸與樹脂的親和力，主要決定于：它們之間的靜電引力；氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用。在pH為3左右時，氨基酸與陽離子交換樹脂之間的靜電引力的大小次序是堿性氨基酸（R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型氨基酸（R0）。因此，氨基酸的洗脫順序大體上是酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸。但有時并不是這樣，這是因為某些氨基酸和樹脂之間還存在著疏水作用。為了使氨基酸從樹脂上洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度（離子強度），這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。氣相色譜當層析系統(tǒng)的流動相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體時，此層析技術(shù)稱為氣-液色譜（gas-liquidchromatography）或簡稱為氣相色譜。它是利用樣品組分在流動的氣相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同而達到分離組分的目的。氣相色譜需要氣相色譜儀進行。氣相色譜具有微量快速的優(yōu)點。高效液相色譜（high

performance

liquidchromatography，簡稱HPLC）：這是近十幾年來發(fā)展起來的一種快速、靈敏、高效的分離技術(shù)。HPLC的特點是：使用的固定相支持劑顆粒很細，因而表面積很大；溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。因此多種類型的柱層析都可用HPLC來代替，例如分配層析、離子交換層析、吸附層析以及凝膠過濾等。一、肽、肽鍵與肽平面一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。3.3

肽肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。0.127nm鍵長=0.132nm0.149nm肽鍵（peptide

bond）：肽鍵肽鍵中的C-N鍵具有部分

雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。肽單位多肽鏈是由許多氨基酸殘基通過肽鍵彼此連接而成的。多肽鏈主鏈骨架的重復單位就是肽單位，它是由肽鍵的4個原子與相連的兩個α－碳原子組成的基團。肽單位結(jié)構(gòu)基本上是固定的，有下列特征：1.肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵中的C-N鍵的鍵長為0.132nm，比大多數(shù)其他化合物的C-N單鍵（0.149nm）短，比C=N雙鍵（0.127nm）又長些。因此，肽鍵具有部分（約40％）雙鍵性質(zhì)；具有剛性，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽單位是剛性平面結(jié)構(gòu)。即肽單位的6個原子都位于同一個剛性平面上，又稱肽平面或酞胺平面。肽單位中，C=O與N-H或兩個α－碳原子呈反式排布。這是因為反式構(gòu)型的能量比順式構(gòu)型的能量低。肽單位平面結(jié)構(gòu)有一定的鍵長和鍵角。二、肽鏈中AA的排列順序和命名CH2CHCH2CH2OHCO2HCH2CONH2OHH3N+OOOHHHHHHHHSerHValTyrAspGlnCH3

CH3N-端OC

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

COO-CH2

C-端多肽在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈主鏈的一端含有一個游離的氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的羧基，稱為羧基端或C-端。如果多肽鏈主鏈末端的氨基和羧基連接起來，則稱環(huán)狀肽或環(huán)肽。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。肽的命名是根據(jù)參與其組成的氨基酸殘基來確定的，規(guī)定從肽鏈的NH2末端氨基酸殘基開始，稱某氨基酰某氨基?！嘲被帷Ｈ缟鲜鑫咫目杀硎緸椋篠er-Val-Tyr-Asp-Gln絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰氨四肽的結(jié)構(gòu)三、肽的重要理化性質(zhì)熔點高。這說明它和氨基酸一樣，是以偶極離子形式形成離子晶格而存在的。具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點。肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端a-NH2和游離末端a-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團。每一種肽都有其相應的等電點。具有旋光性。這是由于肽中有不對稱C原子存在。一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和。但是較長的肽，其旋光度則不等于其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。具雙縮脲反應。這是肽和蛋自質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物與CuSO4堿性溶液都能發(fā)生雙縮脲反應而生成紫紅色或藍紫色的復合物，利用此反應借助分光光度法可測定肽或蛋白質(zhì)含量具紫外吸收。如果肽中存在有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，則在280nm處有最大吸收峰。利用這個特性可對肽類進行定量測定。其他反應。由于肽中存在游離的a-NH2和游離a-COOH，所以能進行茚三酮反應、?；磻?、酯化反應等許多反應。肽的顏色反應多肽可與多種化合物作用，產(chǎn)生不同的顏色反應。這些顯色反應，可用于多肽的定性或定量鑒定。如黃色反應，是由硝酸與氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反應生成二硝基苯衍生物而顯黃色。多肽的雙縮脲反應是多肽特有的顏色反應;雙縮脲（H2N—-CO-NH-CO-NH2）是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。雙縮脲能夠與堿性硫酸銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應。含有兩個以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點，也能發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色或藍紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測定的重要反應。肽的兩性解離和等電點在給定的pH下，根據(jù)Henderson－Hasselbalch方程不難確定出每個側(cè)鏈占優(yōu)勢的電離態(tài)。我們只需掌握這樣一個規(guī)則：當溶液pH大于解離側(cè)鏈的pKa值，占優(yōu)勢的離子形式是該側(cè)鏈的共軛堿，當溶液的pH小于解離側(cè)鏈的pKa值，占優(yōu)勢的離子形式是它的共軛酸，即：四、天然存在的重要多肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，生物體也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽（activepeptide）。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。NHOHHN

CH

CC

OCH

NHHONH

CH3CH

CHCH2CH3C

OOCH3

CH

CH2OHCH

O2ONH

CH

C

NH

CH2

CCH2O

SO

CH

OC

CH2

NH

C

CH

NH

C

CH2

NHOHO鵝膏覃堿的化學結(jié)構(gòu)與真核生物的RNA聚合酶I和I牢固結(jié)合+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-腦啡肽CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGly

NH2SS牛催產(chǎn)素SSCysTyrPheGlnAsnCysProArgGly

NH2牛加壓素L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val‰L-Orn‰‰L-Orn‰L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短桿菌肽S(環(huán)十肽)由細菌分泌的多肽，有時也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（Ornithine,

縮寫為Orn）。2COOHSHa

CHNHgCH2b

CH2CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2

谷胱甘肽—存在與動、植物及微生物中：1.參與體內(nèi)氧化還原反應2.作為輔酶參與氧化還原反應保護巰基酶或含Cys的蛋白質(zhì)中

SH的還原性防止氧化物積累2GSHGS-SG五、.肽的人工合成（一）液相合成法A.基團保護氨基保護：芐氧甲?；捎么呋託浠蜮c在液氨中除去。其他有三苯甲基（trityl）、叔丁氧甲?；╰ertiary）、對甲苯磺?；╰osyl）等，它們可用HBr/CH3COOH在室溫下除去。羧基保護：一般以鹽或酯的形式，常用鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽、三丁胺鹽等；酯是甲酯（OMe）、乙酯（OEt）、芐酯（OBzl）、叔丁酯（OBut），芐酯可用H2/Pd或金屬鈉-液氨法除去，叔丁酯在溫和條件下用酸除去。甲酯和乙酯易引起氨基酸消旋，可用皂化法除去。側(cè)鏈保護：種類很多，常見的需要保護的如下：Cys的SH：常用芐基（Bzl，用鈉-氨液除去）或?qū)籽跗S基（MBzl，用氟化氫0℃30min除去）保護，須在合成結(jié)束時除去保護。Lys的ε-NH2：用Tosyl保護，在合成結(jié)束時在在鈉-氨液中除去。

Asp的β-羧基和Glu的γ-羧基：Asp（OBzl）、Glu（OMe）Ser（Bzl）、Thr（Bzl）、Tyr（Bzl）、Arg（Nε-TosylB.羧基活化疊氮azide：小肽進一步縮合成大肽時常用疊氮法，此法不消旋，因此光學純度高?；罨ctiveester：氨基被保護、羧基被對-硝基苯酯活化時，與另一個氨基酸縮合形成多肽時作用溫和，產(chǎn)出率較高?；旌纤狒鹠ixedanhydride：氨基被保護的氨基酸，其羧基在低溫且有叔氨（NR3）存在下與氯甲酸乙酯活化形成混合酸酐，與另一種氨基酸縮合形成肽，但此法易消旋，在無水溶劑中消旋的水平較低。C.縮合接肽羧基活化是在形成肽之前進行，活化后形成肽鍵。此外可用接肽縮合劑，它可以直接與一個羧基被保護的氨基酸和一個氨基被保護的氨基酸一起反應形成肽。有效的接肽縮合劑是N,N-二環(huán)己基二亞胺（N,N-dicyclohexylcarbodiimide,shorted

by

DDC），DDC從兩個氨基酸殘基中取一分子H2O，自身轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌艿腘,N-二環(huán)己基脲（N,N-dicyclohexylurea）而從反應液中沉淀出來，而且也可以應用在固相多肽合成中。（二）固相肽合成Solid-phase

peptide

synthesisMerrifield（1963）首創(chuàng)，用取代的樹脂作固相載體合成多肽?；驹硎菍ⅵ?氨基酸的N端與一端固定在固相支持物上的已知序列肽段連接。肽段逐步合成，液體試劑可

在每步反應后用過濾或清洗的方從肽-固相支持物上洗脫下來。所需的氨基酸合成后，肽段可以從多聚支持物上移下。DNA固相合成法的基本原理與多肽固相合成法相似。先將目標DNA

鏈3'-端核苷上的3'-OH

與樹脂(固相)共價相連，然后將經(jīng)過活化的單體核苷酸(不參加反應基團必須保護),按設(shè)計的順序依次加上去。3.4

蛋白質(zhì)的分類分類原則：按分子形狀、分子組成、溶解度、生物功能一、按分子形狀：球狀蛋白和纖維狀蛋白；二、按分子組成：簡單蛋白和結(jié)合蛋白；分子組成簡單蛋白（按溶解度）結(jié)合蛋白（按輔基）清蛋白

球蛋白

醇溶蛋白谷蛋白

精蛋白

組蛋白

硬蛋白核蛋白糖蛋白與蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白三、按溶解度：清蛋白、精蛋白、組蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白等。四、按生物功能活性蛋白質(zhì):包括在生命過程中一切有活性的蛋白質(zhì)及其前體。如:激素蛋白質(zhì)、運輸?shù)鞍踪|(zhì)、保護或防御蛋白質(zhì)、毒蛋白質(zhì)等。非活性蛋白質(zhì)：這類型蛋白質(zhì)對生物體起保護或支持作用。如：硬蛋白、角蛋白3.5

蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的近代概念蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。（一）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（四）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)示例二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法（參看P104）三、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（一）

定義——

1969年，國際純化學與應用化學委員會（IUPAC）規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。（二）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。1

、測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的要求a、樣品必需純（>97%以上）；b、知道蛋白質(zhì)的分子量；c、知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；2、 測定步驟A.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。B.多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。C.二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？?/p>

在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的b-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（如，ICH2COOH）保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。SH-CH2-CH2-OH可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵。ssHcoooH

SO3HSO3H作用：這些反應可用于巰基的保護。-OOC2CHCH

SH3NH

+OCH2OCC-lOOC2CHCH2

SOCCH2NH3+

OCHCH2SCHNH3+CH2Cl-OOCOICH2CNH2-OOCCHCH2SCH2CNH2ONH3+巰基（-SH）的保護SSSS胰島素SHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00H

SCH2C00HSCH2C00H

SCH2C00HICH2COOHHO-CH2-CH2-bS-H巰基乙醇二硫鍵的斷裂巰基（-SH）的保護D.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽或DNP-蛋白質(zhì)）。DNP-多肽在酸性條件下水解，只有N-末端氨基酸為黃色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游離氨基酸。只要鑒別所生成的DNP-氨基酸，就可得知N-末端氨基酸。該產(chǎn)物能夠用有機溶劑（如乙醚、乙酸乙酯）抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。N-末端基氨基酸測定二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2R

O+

H2N

CH

CR

O

HN

CH

CO2NH+H2OO2NR

O

HN

CH

C

OH+羥羥羥DNFBN-端羥羥羥NO2DNP衍衍衍NO2DNP-羥羥羥在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以與

N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到1·10-9mol，比DNFB法高100倍。DNS-氨基酸不需要抽提，可直接用紙電泳或者薄層層析加以鑒定。N-末端基氨基酸測定丹磺酰氯法N(CH3)2N(CH3)2R

O+

H2N

CH

C水水N(CH3)2SO2R

OHN

CH

C

OH+羥羥羥SO2Cl丹丹丹丹多多N-端R

OSO2

HN

CH

C丹丹丹N-端羥羥羥丹丹丹羥羥羥多肽或蛋白質(zhì)的末端氨基也和氨基酸的α-氨基一樣能與PITC（Edman試劑）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質(zhì)，簡稱PTC-多肽或PTC-蛋白質(zhì)。后者在酸性有機溶劑中加熱時，N一末端的PTC一氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物并從肽鏈上掉下來，除去N-末端氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的，因為PTC基的引入只使第一個肽鍵的穩(wěn)定性降低。反應液中代表N-末端殘基的PTH-氨基酸，經(jīng)有機溶劑抽提干燥后，可用薄層層折、氣相色譜和HPLC等進行鑒定。此方法還可以用來測定氨基酸序列。N-末端基氨基酸測定氨肽酶是一類肽鏈外切酶或叫外肽酶，它們能從多肽鏈的N－末端逐個地向里切。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和殘基釋放量作動力學曲線，就能知道該蛋白質(zhì)的N-末端殘基序列。實際上此法用于測定N一末端和末端殘基序列有許多圍難，困為酶對各種肽鍵敏感性不一樣，常常難以判斷哪個殘基在前，哪個殘基在后。

最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（LAP），亮氨酸氨肽酶不是只能水解以Leu為N-末端殘基的肽鍵，只是水解以Leu為N-末端的肽鍵速度為最大。?氨肽酶法N-末端基氨基酸測定在蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列測定中，經(jīng)常會碰到N－末端殘基的氨基被封閉。因此下能與Edman降解試劑（PITC）發(fā)生作用。N-末端殘基受封閉的種類很多例如焦谷氨酰環(huán)化、乙酰化以及某些環(huán)狀肽（如短桿菌肽S）N一末端和C一末端連接成環(huán)等。如果遇上肽鏈N-末端是焦谷氨酸殘基時，可以使用焦谷氨酸氨肽酶處理，它是專門裂解焦谷氨酸N－末端的外肽酶。其裂解反應如下：N-末端基氨基酸測定此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。游離的C-端氨基酸可用

FDNB法或DNS法及層析技術(shù)進行鑒定。肼解過程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破壞不易測出，C-末端的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸。肼解法C-末端基氨基酸測定還原法C-末端基氨基酸測定肽鏈C一末端氨基酸也可用硼氫化鋰還原成相應的α-氨基醇。肽鏈完全水解后，代表原來C-末端氨基酸的α-氨基醇，可用層析法加以鑒別。羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的

C-端逐個的水解AA。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。C-末端基氨基酸測定羧肽酶(carboxypeptidase)法目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解

Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。羧肽酶(carboxypeptidase)法C-末端基氨基酸測定E.多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定多肽鏈斷裂法：酶解法和化學法酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶。又叫肽鏈內(nèi)切酶或內(nèi)肽酶。多肽鏈的選擇性降解Trypsinase：R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。O

O

O

ONH

CH

C

NH

CH

C NH

CH

C NH

CH

CR1

R2

R3

R4肽鏈水解位點胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2有時待測的多肽鏈中賴氨酸殘基和（或）精氨酸殘基的數(shù)量較多，為了減少胰蛋白酶的作用位點，可以通過化學修飾將其側(cè)鏈基團保護起來。例如用馬來酸酐（即順丁烯二酸酐）可以保護Lys殘基側(cè)鏈上的ε-NH2，這樣胰蛋白酶就不會水解Lys殘基的羧基端肽鍵，只能斷裂

Arg殘基羧基端的肽鍵。反之，如果用1，2-環(huán)己二酮修飾Arg的胍基，則胰蛋白酶只能斷裂

Lys殘基羧基端的肽鍵。如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶斷裂點，可以用氮丙啶處理多肽鏈樣品，這對Cys殘基側(cè)鏈被修飾成類似Lys的側(cè)鏈，也具有ε-NH2

。這樣，胰蛋白酶便能斷裂Cys殘基羧基端的肽鍵。胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。O

O

O

ONH

CH

C

NH

CH

C NH

CH

C NH

CH

CR1

R2

R3

R4肽鏈水解位點糜蛋白酶Pepsin：R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro不水解。O

O

O

ONH

CH

C

NH

CH

C NH

CH

C NH

CH

CR1

R2

R3

R4肽鏈水解位點胃蛋白酶thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。OOOONHCH

C

NH

CHCNHCHCNHCHCR1

水解位點R2肽R鏈3R4嗜熱菌蛋白酶O

O

O

ONH

CH

C

NH

CH

C NH

CH

C NH

CH

CR1

R2

R3

R4R1=Arg或Lys木瓜蛋白酶化學法：可獲得較大的肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。多肽鏈的選擇性降解化學法：可獲得較大的肽段羥胺（NH2OH）：專一性斷裂-Asn-Gly-之間的肽鍵。也能部分裂解-Asn-Leu-之間的肽鍵以及-Asn-Ala-之間的肽鍵。多肽鏈的選擇性降解F.分離肽段,測定每個肽段的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行解離。Edman氨基酸順序分析法Edman氨基酸順序分析法Edman氨基酸順序分析法Edman降解法現(xiàn)在已有多種改進形式。例如DNS－Edman測序法，它是用前述的DNS法測定肽鏈的N一末端賤基，用Edman降解法提供逐次減少一個殘基的肽鏈樣品。此外為提高檢出被釋放殘基（PTH一氨基酸）的靈敏度，采用熒光基團或有色基團等標記的PITC試劑，如4一N，N一二甲氨基偶氮苯－4，－異硫氰酸酯縮寫為DABITC）就是改進的有色

Edman降解試劑。測定每條多肽鏈的氨基酸組成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定G.確定肽段在多肽鏈中的次序。利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定A法水解得到四個小肽：A1 Ala-PheA2

Gly-Lys-Asn-TyrA3

Arg-TyrA4

His-ValB法水解得到四個小肽：B1

Ala-Phe-Gly-LysB2

Asn-Tyr-ArgB3

Tyr-

His-Val示例(十肽的水解)N-末端殘基HC-末端殘基S第一套肽段

OUSPSEOVERLAHOWT第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO氨基酸順序怎樣排列？H.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定采用胃蛋白酶水解：切點多，二硫鍵穩(wěn)定+-+-第二向ab第一向Brown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段?的多發(fā)生交?ay的?較，一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵肽鏈(切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵換)。將所得的肽段利用Brown及Hartl對角線電泳技術(shù)進行分離。然后同其它方法分析的肽段進行比確定二硫鍵的位置。二硫鍵位置的確定無法顯示該圖片。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)3.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)舉例（1）胰島素（Insulin）SSSSSS胰島素A鏈B鏈A鏈21個aa殘基B鏈30個aa殘基一個鏈內(nèi)二硫鍵和兩個鏈間二硫鍵，分子量5700（2）牛胰核糖核酸酶（RNase）

一條多肽鏈，124AA殘基組成，四個鏈內(nèi)二硫鍵，分子量12600.它是測出一級結(jié)構(gòu)的第一個酶分子。測定1種細菌七肽的氨基酸順序。經(jīng)分析，它的氨基酸組成是：Lys1、Pro1、Arg1、Phe1、Ala1、Tyr1

和Ser1。在胰凝乳蛋白酶作用前，此肽不與DNFB反應。經(jīng)胰凝乳蛋白酶作用后，此肽水解為2個肽A和B，A肽的氨基酸組成為Ala、Tyr、Ser；B肽為Phe、Lys、Arg、Pro。A肽和B肽分別與DNFB反應產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。此七肽與胰蛋白酶反應，同樣能生成2個肽。它們的氨基酸組成分別為Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。寫出該七肽的氨基酸順序。-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-蛋白質(zhì)的二級(Secondary)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的主鏈本身在空間的排列、或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。主要有a-螺旋、b-折疊、b-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。其中a-螺旋是蛋白質(zhì)中最常見，含量最豐富的二級結(jié)構(gòu)。四、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（一）構(gòu)型與構(gòu)象構(gòu)型（configuration）：指在立體異構(gòu)體中取代原子或基團在空間的取向。兩種構(gòu)型間的轉(zhuǎn)變需要共價鍵的斷裂和重組。COOH

COOHH2N

C

H

H

C

NH2R

R構(gòu)象（conformation）:指取代原子或基團當單鍵旋轉(zhuǎn)時可能形成的不同立體結(jié)構(gòu)。這種空間位置的改變不涉及共價鍵的斷裂。HHHHHHHHHHHH紐曼透視結(jié)構(gòu)式（二）蛋白質(zhì)的構(gòu)象一個蛋白質(zhì)的多肽鏈在生物體正常的溫度和pH條件下，只有一種或很少幾種構(gòu)象。這種天然構(gòu)象保證了它的生物學活性，并且相當穩(wěn)定。這一事實說明了天然蛋白質(zhì)主鏈上的單鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。蛋白質(zhì)多肽鏈空間折疊的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射線衍射技術(shù)研究多肽鏈結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)：1.肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)；2.肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn)；3.組成肽鍵的四個原子和與之相連的兩個a碳原子（Ca）都處于同一個平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面叫肽平面（peptide

plane）或酰胺平面（amide

plane）。4.二面角所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個相鄰肽單位中，非鍵合原子之間的接近有無阻礙。蛋白質(zhì)中非鍵合原子之間的最小接觸距離(A)?CNOHC3.20(3.00)2.9(2.80)2.8(2.70)2.4(2.20)N2.7(2.60)2.7(2.60)2.4(2.20)O2.7(2.60)2.4(2.20)H2.00(1.90)oRamachandran構(gòu)象圖Ramachandran構(gòu)象圖實驗測得8種蛋白質(zhì)多肽鏈二面角f、y值在構(gòu)象圖上的分布多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為

0.15nm;a-螺旋的穩(wěn)定性是靠鏈內(nèi)氫鍵維持的，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個氨基酸殘基的

N-H氫形成氫鍵。a-螺旋中氨基酸殘基的側(cè)鏈伸向外側(cè)，a-螺旋有左手螺旋和右手螺旋，但天然蛋白質(zhì)中的

a-螺旋幾乎都是右手螺旋。（三）

a-螺旋及結(jié)構(gòu)特點（四）

b-折疊（b-pleated

sheet）

b-折疊或b

-折疊片也稱b

-結(jié)構(gòu)或b

-構(gòu)象，它是蛋白質(zhì)中第二種最常見的二級結(jié)構(gòu)。

b-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內(nèi)的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象（1）b-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。b-折疊的特點（2）b-折疊有兩種類型：一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。從能量的角度來說，反平行式更為穩(wěn)定。b-折疊中重復周期（肽鏈同側(cè)兩個相近

的同一基團之間的距離）為0.7nm（反平行式）或0.65nm（平行式）。肽鏈中氨基酸殘基的側(cè)鏈R基團垂直于折疊片的平面，并交替地從平面上下兩側(cè)伸出。（五）b-轉(zhuǎn)角(b-turn)亦稱：b-reverse

turn,b-bend在b-轉(zhuǎn)角部分，由四個氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。小片的非重復結(jié)構(gòu)。大部分存在于反平行b-折疊片中。（六）無規(guī)卷曲或自由回轉(zhuǎn)（nonregular

coil）指無一定規(guī)律的松散盤曲的肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的功能部位常包含此構(gòu)象，靈活易變。五、 蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)

在蛋白質(zhì)中，特別是球狀蛋白質(zhì)中，若 干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元（α-helix.β-tructure.Β-

turn）組合在一起。彼此相互作用，形成有規(guī)則， 在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體充當三級結(jié)構(gòu)的構(gòu) 體，稱為超二級結(jié)構(gòu)。特點：在結(jié)構(gòu)的組織層次上高于二級結(jié)構(gòu)，但沒有構(gòu)成完整的結(jié)構(gòu)域。超二級結(jié)構(gòu)的基本類型：aa、bab、bb（1）

aa特點：①由兩股或三股右手α－h(huán)elix彼此纏繞而成的左手超螺旋，重復距離約為14nm。②是纖維蛋白質(zhì)如α－角蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等中的主要結(jié)構(gòu)元件，也存在于球狀蛋白質(zhì)中。③每圈螺旋為3.5個殘基，重復0.51nm。④單個的α－h(huán)elix每隔7個殘基重復一次。⑤穩(wěn)定因素是非極性側(cè)鏈間的范德華力。（2）

bab①由二段平行式的β－鏈（單胺的β－structure

）和一段連接鏈組成，此超二級結(jié)構(gòu)稱β×β－單位。②連接鏈α－h(huán)elix大體上反平行于β－鏈，連接鏈也可以是無規(guī)則卷曲。③

最常見的β×β組合是由三段平行式的β－鏈和二段α－h(huán)elix鏈構(gòu)成，此超二級結(jié)構(gòu)稱Rossman-折疊

。④幾乎所有的實例（兩個例外）中連接都是以右手交叉連接方式處于β－折疊的一側(cè)。（3）

bbβ－曲折和回形拓撲結(jié)構(gòu)（βββ）組合的二種超二級結(jié)構(gòu)

a.β－曲折（超二級結(jié)構(gòu)）由在一級結(jié)構(gòu)上連續(xù)，在β－折疊中相鄰的三條反平行式，

β－鏈通過緊湊的β－轉(zhuǎn)角連接而成，β－曲折含有與α－h(huán)elix相近數(shù)目的H鍵。b.回形拓撲結(jié)構(gòu)

―――反平行式β－折疊片中常出現(xiàn)的一種超二級結(jié)構(gòu)。有兩種可能的回旋方向，但實際上只存在一種。六、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)1.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(Tertiary

Structure)是指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，進一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu)。纖維狀蛋白纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)廣泛地分布于脊椎和無脊椎動物體內(nèi)，它是動物體的基本支架和外表保護成分，占脊椎動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的一半或一半以上。這類蛋白質(zhì)外形呈纖維狀或細棒狀，分子軸比(長軸／短軸)大于10(小于10的為球狀蛋白質(zhì))。分子是有規(guī)則的線型結(jié)構(gòu)，這與其多肽鏈的有規(guī)則二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，而有規(guī)則的線型二級結(jié)構(gòu)是它們的氨基酸順序的規(guī)則性反映。纖維狀蛋白質(zhì)的類型

纖維狀蛋白質(zhì)可分為不溶性(硬蛋白)和可溶性兩類，前者有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白等；后者有肌球蛋白和纖維蛋白原等，但不包括微管(microtubule)和肌動蛋白細絲(actin

filament)，它們是球狀蛋白質(zhì)的長向聚集體(aggregate)。角蛋白Keratin角蛋白廣泛存在于動物的皮膚及皮膚的衍生物，如毛發(fā)、甲、角、鱗和羽等，屬于結(jié)構(gòu)蛋白。角蛋白中主要的是a-角蛋白(二硫鍵是穩(wěn)定力，根據(jù)含硫量大小分：硬角蛋白，存在于蹄、爪、角等中；軟角蛋白，存在于皮膚等）。a-角蛋白主要由a-螺旋構(gòu)象的多肽鏈組成。一般是由三條右手a-螺旋肽鏈形成一個原纖維（向左纏繞），原纖維的肽鏈之間有二硫鍵交聯(lián)以維持其穩(wěn)定性例如毛發(fā)的纖維是由多個原纖維平行排列，并由氫鍵和二硫鍵作為交聯(lián)鍵將它們聚集成不溶性的蛋白質(zhì)。a-角蛋白的伸縮性能很好，當a-角蛋白被過度拉伸時，則氫鍵被破壞而不能復原。此時a-角蛋白轉(zhuǎn)變成b-折

疊結(jié)構(gòu)，稱為b-角蛋白。毛發(fā)的結(jié)構(gòu)

一根毛發(fā)周圍是一層鱗狀細胞(scaIecell)，中間為皮層細胞(corticalcelI)。皮層細胞橫截面直徑約為

20mm。在這些細胞中，大纖維沿軸向排列。所以一根毛發(fā)具有高度有序的結(jié)構(gòu)。毛發(fā)性能就決定于a—螺旋結(jié)構(gòu)以及這樣的組織方式。三股右手α-helix向左纏繞↓原纖維(αα組合的超二級結(jié)構(gòu))↓再排列成"9+2"電纜式結(jié)構(gòu)"微纖維"↓幾百根微纖維結(jié)合成不規(guī)則角蛋白分子中的二硫鍵卷發(fā)(燙發(fā))的生物化學基礎(chǔ)永久性卷發(fā)(燙發(fā))是一項生物化學工程

(biochemicalengineering),a—角蛋白在濕熱條件下可以伸展轉(zhuǎn)變?yōu)閎—構(gòu)象，但在冷卻干燥時又可自發(fā)地恢復原狀。這是因為a—角蛋白的側(cè)鏈R基一般都比較大，不適于處在b—構(gòu)象狀態(tài)，此外a—角蛋白中的螺旋多肽鏈間有著很多的二硫鍵交聯(lián)，這些交聯(lián)鍵也是當外力解除后使肽鏈恢復原狀(a—螺旋構(gòu)象)的重要力量。這就是卷發(fā)行業(yè)的生化基礎(chǔ)。（2）b-角蛋白絲心蛋白(fibroin)：這是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質(zhì)。絲心蛋白具有抗張強度高，質(zhì)地柔軟的特性，但不能拉伸。絲心蛋白是典型的