黃苓昔對黑質(zhì)內(nèi)注射三氯化鐵所致中

腦損毀的保護(hù)作用【摘要】目的探討黑質(zhì)部位注射FeCl3制備帕金森病模型的可行性，并觀察黃苓昔的保護(hù)作用。方法雄性Wistar大鼠，黃苓昔組術(shù)前灌胃黃苓昔(78mg?kg??1?d-1)1周；模型組和黃苓昔組均單側(cè)黑質(zhì)定向注射FeCl3(40ug)造摸，術(shù)后第5周中腦黑質(zhì)病理切片行免疫組化分析酪氨酸羥化酶(TH)；鐵染色觀察中腦黑質(zhì)鐵含量。結(jié)果①造模后2?3d,動物頭、身體向注射對側(cè)傾斜，部分動物自發(fā)向注射對側(cè)旋轉(zhuǎn)，有些伴有抽搐和強(qiáng)直。術(shù)后7d尚見有不同程度類帕金森病表現(xiàn)，震顫、弓背；黃苓昔組死亡率(模型組46%，黃苓昔組36%)降低。②注射側(cè)中腦見明顯的鐵沉積，腦組織損毀嚴(yán)重。而黃苓昔組未見這一現(xiàn)象。③注射側(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞明顯缺失。黃苓昔預(yù)防給藥1周沒能阻止這種損傷。結(jié)論鐵劑黑質(zhì)注射造成的中腦損毀嚴(yán)重，動物有類帕金森病表現(xiàn)。黃苓昔能阻止鐵在中腦沉積及所造成的損毀，顯示明顯的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】三氯化鐵；帕金森?。慌两鹕Ｐ?；黃苓昔ChinaAbstract：ObjectiveToexplorethefeasibilityofdevelopingParkinson'sdiseasemodelinducedbyinjectingFeCl3intonigrostriatum，andtoobservetheprotectiveeffectofbaicalinonthemodel.MethodsTheWistarratsofdrug??groupwereadministeredbaicalin(78mg?kg—1?d—1)byoralfor1week.TheFeCl3(40ug)wasinjectedintotheunilateralsubstantianigra(SN)onallrats.Thedopamineneuronsatthemesencephalonnigrawereobservedbytyrosinehydroxylase(TH)immunohistochemistryinthe5thweekafterinjection.Theironcontentsweremeasuredbyironstain.Results①Theheadandbodyofanimalswasgradienttowardsideoftheoppositeinjectedmesencephalonafteroperatedfor2??3days，spontaneousrotationbehaviorstowardtheoppositesideofinjectedsideandconvuisionandtetanyforsomerats.SomesimilarParkinson'sdiseasebehaviorappeared，suchasthrill，hunchbackonthe7thdayafterinjection，mortalitywerereducedinratsofBaicalin??grouprats.②Irondepositinthenigrostriatumandlesionsofthemesencephalonappearedoninjectedsideinthemodel??group，butitweren'tinratsofBaicalin??group.③TheNigrostriataldopaminergicneuronsweredecreasedoninjectedsideandthisdecreasecouldnotbepreventedbyBaicalintreatmentprior1week.ConclusionThelesionofthemesencephaloninducedbyFeCl3injectionissevere，andsomesimilarParkinson'sdiseasebehaviorscanappeare.TheresultswereporthereofferedsupportthattheprotectiveeffectofbaicalinonIrongatherandmesencephlalonlesioninducedFeCl3injectioninrats.Keywords：Parkinson'sdisease；Parkinson'sdiseasemodel；Baicalin帕金森病（Parkinson'sdisease，PD）是常見的神經(jīng)退行性疾病。研究證明PD患者黑質(zhì)內(nèi)鐵含量異常升高是帕金森病一個共有而不變的特征；不僅腦內(nèi)鐵代謝紊亂，流行病學(xué)調(diào)查還顯示其全身鐵代謝也遭到破壞［1］。研究提示鐵直接參與PD的神經(jīng)變性改變。鐵代謝紊亂、鐵誘導(dǎo)的氧應(yīng)激自由基生成增加是PD發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)，與導(dǎo)致PD患者氧化應(yīng)激狀態(tài)及黑質(zhì)損傷密切有關(guān)。鐵螯合劑在動物實驗中顯示出顯著的療效，動物在用6??OHDA處理之前給予鐵螯合劑去鐵胺可明顯減輕6??OHDA誘發(fā)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)變性】2］。鐵螯合劑在治療PD中的潛能使它已成為尋找抗PD新藥關(guān)注的方向之一。黃苓苷是中藥黃苓中提取的黃酮類有效成分。體內(nèi)外的實驗都證明它有顯著的抗氧化性，減輕腦組織和心肌組織的缺血再灌注損傷】3］；能減少谷氨酸和過氧化氫對離體神經(jīng)細(xì)胞的損害】4］；對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能有保護(hù)作用［5］。黃苓苷結(jié)構(gòu)的特殊性使它能和金屬離子產(chǎn)生強(qiáng)烈的螯合作用［6］。本研究探討腦內(nèi)注射鐵劑制備帕金森病模型的可行性，同時觀察黃苓苷對黑質(zhì)部位注射鐵劑所造成損毀的保護(hù)作用。1材料與方法1.1實驗動物分組、給藥及處理健康雄性Wistar大鼠［購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2007??0001］26只，體質(zhì)量250?300g，隨機(jī)分為3組，模型組13只，黃苓苷組11只，該組手術(shù)前灌胃黃苓苷（78mg?kg-1?d-1［7］，四川廣漢市本草植化有限公司產(chǎn)品，批號：030812）1周。2只為假手術(shù)對照。模型組和黃苓苷組均施予FeCl3腦內(nèi)定位注射，假手術(shù)組除注射外均與其他組相同處理。各組手術(shù)后飼養(yǎng)5周，期間記錄大鼠行為學(xué)變化并拍攝攝像，實驗結(jié)束時各組取2只做病理的動物麻醉后開胸，行多聚甲醛心臟灌注固定，24h內(nèi)制作中腦黑質(zhì)部位冰凍切片（片厚50um），以備做免疫組化分析和鐵染色。其余動物斷頭處死，迅速冰盤上分離紋狀體、中腦黑質(zhì)、海馬、大腦皮層及其余腦組織置-80°C保存。1.2黑質(zhì)內(nèi)定向注射FeCl3［2］大鼠用10%水合氯醛麻醉（0.35ml/100g）后固定于立體定位儀上，按照下列坐標(biāo)將無菌FeCl3溶液（20mg/ml），分為兩點(diǎn)（每點(diǎn)1Ul）緩慢注射至左側(cè)黑質(zhì)中：作標(biāo)為①門齒棒上2.4mm，前囟下4.4mm，中線旁開1.1mm，顱骨下7.9mm:②門齒棒下3.4mm，前囟下4.0mm，中線旁開0.8mm，顱骨下8.1mm。大鼠鐵劑總量為40Ug。1.3黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化染色各組做病理的大鼠腦切片在0.01mol/LPBS液中浸洗2minX3次；室溫入1N鹽酸抗原修復(fù)30min,蒸餾水浸洗3minX3次；再入3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性10min，蒸餾水浸洗3次，0.01mol/LPBST浸洗0.5minX2次；入5%正常羊血清封閉30min，傾去血清后直入適當(dāng)稀釋的I抗（大鼠單克隆TH抗體，sigma）室溫過夜；0.01mol/LPBS液中浸洗2minX3次；入1：300生物素標(biāo)記的II抗（羊抗小鼠IgG,北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）室溫2??3h,0.01MPBS液中浸洗2minX3次。入1:300辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（III抗）2?3h，再入0.01mol/LPBS液中浸洗2minX3次，每次；DAB顯色10?30min。然后入水充分浸洗。裱片，自然干燥。1.4鐵染色［7］腦切片置于含4%多聚甲醛的PB液中5min，蒸餾水沖洗30s，新鮮配置的2%HCl與2%亞鐵氤化鉀等體積混合液30min，PBS沖洗5minX2次，1%H2O2?布狀既芤?20min，PBS沖洗5minX2次，DAB顯色，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。1.5病理分析每只動物的多張腦切片，Nikon顯微鏡（ECLIPSE80i）下取3?4個黑質(zhì)區(qū)域用NIS??Elements病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用土s表示，統(tǒng)計分析采用SPSS11.5進(jìn)行，PV0.05則具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1行為學(xué)觀察術(shù)后2?3d，動物表現(xiàn)為頭、身體向右側(cè)傾斜，豎毛，有些出現(xiàn)對側(cè)旋轉(zhuǎn)或同側(cè)旋轉(zhuǎn)。有些伴有抽搐，進(jìn)食和飲水減少，體重明顯下降，當(dāng)握住鼠尾提起時出現(xiàn)大鼠頭朝向?qū)?cè)彎曲身體。術(shù)后7d左右，模型組的動物有不同程度的類帕金森病癥狀表現(xiàn)，震顫、弓背、身體向一側(cè)傾斜，旋轉(zhuǎn)，不能走直線；而黃苓苷組的動物較之模型組，以上癥狀均較輕。術(shù)后2?5周，各組動物均可以自主進(jìn)食飲水，體重基本恢復(fù)到術(shù)前水平，身體仍向右側(cè)傾斜，有些仍有弓背并不時伴有抽搐。黃苓苷組黑質(zhì)注射鐵劑后的死亡率降低（黃苓苷組36.36%，模型組46.15%）動物整體的狀況有所改善。2.2鐵染色結(jié)果模型組注射側(cè)中腦見到明顯的鐵沉積，針孔周圍腦組織損毀嚴(yán)重（見圖4與圖6比較），黑質(zhì)部位注射側(cè)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對側(cè)（見表1），甚至有些部位可見注射側(cè)中腦結(jié)構(gòu)塌陷（見圖1），應(yīng)是鐵的毒性所造成的腦組織破壞所致。而黃苓苷組未見到中腦鐵的沉積，也未見到組織損毀（見圖5），黑質(zhì)部位注射側(cè)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對側(cè)（見表1）。提示黃苓苷能夠通過某種途徑對抗、阻止注射的鐵在中腦的沉積及所造成的損傷。2.3TH染色結(jié)果有些切片見注射側(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞明顯出現(xiàn)缺失（見圖1），對側(cè)較注射側(cè)明顯減輕（圖2與圖3比較），但各組多張切片的圖象分析結(jié)果顯示注射側(cè)TH染色陽性細(xì)胞與未注射側(cè)沒有明顯差別。見表1。表1各組黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）染色和鐵染色圖象分析（略）3討論P(yáng)D患者黑質(zhì)鐵含量升高的原因以及鐵超載在發(fā)病過程中的作用尚未完全闡明。目前的看法認(rèn)為黑質(zhì)內(nèi)過量的活性鐵可作為一種神經(jīng)毒素通過多種途徑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，生成細(xì)胞毒性的羥自由基，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，損傷神經(jīng)細(xì)胞而最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡】8］。有關(guān)鐵促進(jìn)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性的證據(jù)大多是間接的，有報道指出】9］，PD患者血液及腦脊液中的游離鐵含量并未升高，血液中的鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及乳鐵蛋白與對照人群比較亦無顯著差異。有研究發(fā)現(xiàn)患者黑質(zhì)乳鐵蛋白及其受體選擇性增加，提示局部鐵代謝異?？赡芘c黑質(zhì)鐵增高有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為黑質(zhì)鐵含量增加可能只是神經(jīng)變性的一種繼發(fā)性改變，鐵超載不可能是PD發(fā)病始動因素】10］。但鐵作為一種強(qiáng)力自由基生成催化劑可能在DA能神經(jīng)元變性某些中間環(huán)節(jié)起重要作用。以往的研究證實鐵劑可導(dǎo)致大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性丟失，紋狀體多巴胺含量選擇性降低】11?13］本研究也觀察到大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性丟失，但腦內(nèi)注射鐵劑造成的損傷影響到中腦較多的區(qū)域。我們注意到，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是劇烈而廣泛的，行為學(xué)表現(xiàn)復(fù)雜，有些動物存在抽搐、強(qiáng)直等類癲癇發(fā)作癥狀，這證明鐵離子在中樞神經(jīng)內(nèi)的大量增加所引起的損害涉及到的區(qū)域較廣，選擇性低。本研究中黃苓苷口服顯示出對抗、阻止鐵在中腦沉積的保護(hù)作用，動物行為學(xué)表現(xiàn)也顯示改善，推測黃苓苷體內(nèi)對鐵離子可能有直接的螯合作用，我們在體外曾觀察到黃苓苷能顯著抑制Fe2+?舶腚裝彼嵋?起的小鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，當(dāng)體系中鐵離子濃度增加時抑制作用減弱，證明黃苓苷與鐵離子的相互作用能影響脂質(zhì)過氧化的水平［14］。本研究的結(jié)果從整體水平證實黃苓苷對腦內(nèi)鐵損毀的保護(hù)作用，為其可能作為鐵螯合劑輔助治療PD的價值提供了初步的實驗依據(jù)。參考文獻(xiàn)1]王俊，姜宏，謝俊霞.中樞神經(jīng)系統(tǒng)鐵代謝與帕金森病的關(guān)系[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2003，34(1):67.姜宏，陳文芳，謝俊霞.帕金森病模型大鼠腦內(nèi)多巴胺與鐵含量的關(guān)系[J].生理學(xué)報，2001，53(5):334.Bonuccelli，V.，DelDP.NewpharmacologyhorizonsinthetreatmentofParkinsondisease[J].Neurology，2006，67(7):530.FahnS，CohenG.TheOxidantstresshypothesisinParkinson'sdisease:evidencesupportingit[J].AnnNeurol，1992，32(6):804.AcunaCD.MelatoninisprotectiveagainstMPTPinducedStriatalandhippocampallesions[J].LifSci,1997,60(2):23.趙保路.氧自由基和天然抗氧化劑，第1版】M].北京：科學(xué)出版社，1999:250.陳忻，董曉丹，張楠，等.黃苓苷對局灶性腦缺