第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

1醫(yī)學資源

一、生物材料的選擇：

1．生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)

2．生物材料的采集與質(zhì)控

（1）品種鑒定；（2）防止污染與感染；（3）選擇富集目的物材料；（4）冷凍保存

第一節(jié)生物藥物提取、分離、純化技術(shù)基礎(chǔ)2醫(yī)學資源

二、生物活性物質(zhì)物質(zhì)常用的提取方法與優(yōu)化

（一）幾種常用提取方法

1．酸、堿、鹽水溶液提取方法

2．表面活性劑提取方法與反膠束提取方法

3．有機溶劑提取

4.雙水相萃取法

5．超臨界萃取法

3醫(yī)學資源（二）提取方法與優(yōu)化

1.溶劑選擇

2.選擇添加劑①保護劑；②酶抑制劑

3.提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑4醫(yī)學資源三．濃縮與干燥1.濃縮方法：①鹽析；②有機溶劑沉淀；③高分子脫水④超濾；⑤真空濃縮或薄膜濃縮；

（書P45頁）5醫(yī)學資源6醫(yī)學資源2.干燥：①低溫真空干燥；②噴霧干燥；③冷凍干燥

（書P47頁）7醫(yī)學資源8醫(yī)學資源9醫(yī)學資源四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點:(1)生物材料組成復雜

(2)目的物含量低

(3)易變性、失活

(4)分離方法有很大經(jīng)驗成分

(5)步驟多，逐級分離

(6)產(chǎn)品驗證與化學上純度概念不完全相同(書P49頁)10醫(yī)學資源2.分離純化原理

P49頁

(1)根據(jù)分子形狀與分子大小

(2)根據(jù)電荷差異

(3)根據(jù)分子極性與溶解度大小

(4)根據(jù)吸附特性

(5)根據(jù)生物配基特性11醫(yī)學資源3.選擇原則（1）粗品分離：大處理量,相對低分辨率鹽析，分級沉淀，萃取，超濾（2）精制：高分辨率多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦12醫(yī)學資源

第二節(jié)微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

一、菌種的選育與保藏1．自然選育依據(jù)自發(fā)突變原理，通過不斷分離篩選，除去衰變菌落，選擇高產(chǎn)菌，達到強化、復壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的。方法：（1）平板劃線法（2）稀釋平板法13醫(yī)學資源2．誘變育種（1）出發(fā)菌株的選擇①:穩(wěn)定性;②:具備某種優(yōu)良性狀的菌株③:對誘變劑敏感;④:生理狀態(tài)及生長時間（2）誘變處理:①化學誘變；②物理誘變;③生物誘變（3）篩選：①隨機篩選；②半理性化篩選14醫(yī)學資源突變株篩選一般進程如圖所示

第三第四輪同第二輪第三第四輪同第二輪15醫(yī)學資源3、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)①：雜交育種②：原生質(zhì)體融合③：基因工程技術(shù)

(P55頁)16醫(yī)學資源3．菌種保存（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法①防止基因突變：如低溫保藏②采用雙重缺陷型③制作平行的菌種斜面，少傳代④分離單菌落，自然篩選⑤選擇培養(yǎng)條件17醫(yī)學資源（4）菌種保藏方法：①斜面低溫保存②液體石蠟封藏法③甘油冷凍法④冷凍干燥法⑤液氮保藏法18醫(yī)學資源二、發(fā)酵工程技術(shù)基礎(chǔ)

發(fā)酵工程：單細胞純培養(yǎng)工業(yè)化過程，以產(chǎn)生大量目的物。

1．液體培養(yǎng)——深層發(fā)酵

2．固體培養(yǎng)——淺盤培養(yǎng)發(fā)酵設備：空壓機、種子罐、發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器、空氣過濾器、離心機及多種參數(shù)控制與檢測設備，以L-Lys生產(chǎn)設備為例，見圖1所示。

19醫(yī)學資源圖1L-Lys生產(chǎn)過程工藝設備圖20醫(yī)學資源

第三節(jié)生物技術(shù)藥物制造技術(shù)基礎(chǔ)

一、重組DNA技術(shù)原理1．基因工程操作過程：

（1）獲得目的基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導入宿主細胞；（4）工程菌的克隆與鑒定；（5）目的基因擴增與蛋白表達。

21醫(yī)學資源2．基因工程藥物制造過程22醫(yī)學資源二、基因工程主要操作技術(shù)1．目的基因的獲得（1）cDNA文庫純化目的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA①mRNA的分離②cDNA第一鏈的合成③cDNA第二鏈的合成④cDNA與載體連接⑤轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化⑥篩選目的克隆23醫(yī)學資源目的基因的獲得：cDNA文庫24醫(yī)學資源（2）PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

典型PCR反應包括①模板變性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高溫聚合酶作用下，以DNA單鏈為模板，由引物起始從5′→3′

延伸。25醫(yī)學資源26醫(yī)學資源（3）化學合成法

在已知DNA序列或多肽的一般結(jié)構(gòu)時，如鏈長在60bp～100bp可用化學合成法直接合成DNA。27醫(yī)學資源2．DNA重組體的構(gòu)建根據(jù)宿主菌不同，選擇基因載體（Vector）（1）E.coli質(zhì)粒非表達型

pBR322，表達型pUC，實用型pBV220，PET系統(tǒng)，λ噬菌體DNA作為載體，非表達型λgt10，表達型λgt11。（2）芽孢桿菌pUB110pE194和pC194（3）鏈霉菌pIJ101pSG5

cDNA與載體連接方法①同聚尾連接法②人工接頭連接法28醫(yī)學資源3．重組體的表達系統(tǒng)（1）原核表達系統(tǒng)①E.coli；②芽孢桿菌Bacillus；③鏈霉菌Streptomyces

優(yōu)點：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短缺點：多為胞內(nèi)表達、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met(AUG)，有內(nèi)毒素毒性29醫(yī)學資源（2）真核表達系統(tǒng)①酵母表達畢赤酵母（pichia

psatoris）受甲醇誘導優(yōu)點：易培養(yǎng)無毒性，易高密度發(fā)酵（100g/L），高表達，成本低，產(chǎn)物可糖基化，有分泌表達。②動物細胞哺乳動物細胞——CHO（倉鼠細胞）昆蟲細胞——家蠶細胞30醫(yī)學資源4．表達產(chǎn)物的純化包含體inclusionbodies:大部分是表達產(chǎn)物，（還有細胞蛋白和膜蛋白）一級結(jié)構(gòu)正確、無活性，不溶于水，可用變?nèi)軇㏒DS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復性。31醫(yī)學資源

為防止或減少包含體的形成常用方法：

（1）降低培養(yǎng)溫度從37℃降到30℃可顯著降低包含體形成率。（2）以硫氧還原蛋白為載體進行融合表達。硫氧還原蛋白是E.coil的一種同源蛋白，定位于粘附區(qū)，富含-SH,可保目的蛋白不發(fā)生分子錯誤折疊，是一種熱穩(wěn)定蛋白，表達產(chǎn)物聚集于粘附區(qū)，通過振擾提取使產(chǎn)物進入介質(zhì)中，再酶解就得到目的蛋白。32醫(yī)學資源三、酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、酶工程(enzymeengineering)

研究內(nèi)容（1）酶的發(fā)現(xiàn)、分離純化與生產(chǎn)應用。（2）酶與細胞的固定化技術(shù)與酶反應器。（3）生物酶工程：以基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究酶工程。（4）抗體酶、模擬酶合成酶及酶的人工設計。（書P102）33醫(yī)學資源2、固定化酶(immobilizedenzyme)（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強度，便于連續(xù)、自動、規(guī)模化生產(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化34醫(yī)學資源共價鍵結(jié)合酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶35醫(yī)學資源3、制備方法：（1）吸附法：分為物理吸附法和離子交換吸附法（2）包埋法：將酶或細胞定位于凝膠高聚物網(wǎng)絡中，如卡拉膠，海藻膠，聚丙烯酰胺（3）共價鍵結(jié)合法：酶分子與載體分子，通過化學偶聯(lián)使酶與載體共價結(jié)合。（4）交聯(lián)法：用雙功能試劑將酶與載體交聯(lián)固定化

圖:酶固定化方法示意1.離子結(jié)合2.共價結(jié)合3.交聯(lián)4.聚合物包埋5.疏水作用6.脂質(zhì)體包埋7.微膠囊36醫(yī)學資源第四節(jié)生物制藥工藝中試放大設計

一、中試放大目的與規(guī)模1．目的：（1）建立穩(wěn)定工藝、大批量制備足量合格產(chǎn)品，供應臨床前與臨床研究；（2）研究工藝參數(shù)制定工藝規(guī)程和檢定規(guī)程，為正式生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，保證能在以后生產(chǎn)中應用。37醫(yī)學資源2．規(guī)模：中試是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)的過渡性研究，是取得成功產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。38醫(yī)學資源3、中試放大時應具備的條件（1）有穩(wěn)定的工藝：收率，質(zhì)量可靠（2）操作條件基本確立（3）已建立中間品和成品分析方法（4）生物材料已鑒定（5）物料平衡、三廢處理已基本解決（6）中試規(guī)模、產(chǎn)品產(chǎn)量，規(guī)模已確定（7）安全生產(chǎn)已有方案39醫(yī)學資源4．中試放大要解決的問題（1）原輔材料規(guī)格（2）設備選型與材質(zhì)選用（3）反應條件（4）原輔料中間品、產(chǎn)品質(zhì)控標準與檢定方法（5）下游工藝優(yōu)化與穩(wěn)定制造規(guī)程的制定40醫(yī)學資源二．中試放大方法與總結(jié)內(nèi)容1、放大方法

（1）經(jīng)驗放大（2）相似放大（3）數(shù)學模型放大2、總結(jié)內(nèi)容：（1）確定工藝路線，優(yōu)化工藝條件，制定制造規(guī)程。（2）制定崗位操作、投產(chǎn)（3）進行材料衡算（4）安全生產(chǎn)與處理（5）原輔料及產(chǎn)品質(zhì)控方法與標準測定。（6）產(chǎn)品規(guī)格標準制定（7）消耗定額，成本核算，工時，生產(chǎn)周期計算。

41醫(yī)學資源

第五節(jié)生物制藥工藝技術(shù)若干進展

一、21世紀的熱門生物技術(shù)

1．組合生物合成組合生物合成(combinatorialbiosynthesis)或組合生物學(combinatorialbiology)是指應用基因重組技術(shù)重新組合微生物藥物的基因簇,產(chǎn)生一些新的非天然的基因簇,從而合成許多新的非天然的化合物,為生物藥物的篩選提供豐富的化合物資源42醫(yī)學資源

微生物藥物通常是由非常簡單的化學物質(zhì),如小分子羧酸或某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位合成的,參與合成的酶為一系列基因編碼的多酶體系(構(gòu)成一個合成途徑)。研究表明,參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構(gòu)成一個基因簇(cluster),這為基因的克隆和操作提供了方便,同時由于參與次級代謝生物合成酶系對底物的特異性,專一性要求不是很嚴格的,對結(jié)構(gòu)相類似的底物均可識別,這一特點為不同基因組合產(chǎn)生新的化合物創(chuàng)造了條件。43醫(yī)學資源組合生物合成技術(shù)在藥物研發(fā)中的應用酮基合成酶(KS)、?；D(zhuǎn)移酶（AT）、脫氫酶（DH）、烯醇還原酶（ER）、酮基還原酶（KR）和?；d體蛋白（ACP）等功能域44醫(yī)學資源45醫(yī)學資源組合生物合成技術(shù)示意圖酶1酶2酶3化合物A

B

C

D酶1基因酶2基因酶3基因基因克隆AD質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至宿主菌酶或蛋白質(zhì)46醫(yī)學資源

2．藥物基因組學是一門研究個人的基因遺傳如何影響身體對藥物的反應的一門科學。由對基因的研究發(fā)現(xiàn)帶有某種特定基因的人，會對某種特定的藥物成份，產(chǎn)生某種特定的反應。將這個基因、藥物成份與服用后反應的一連串關(guān)聯(lián)，運用在用藥之上，就可以知道帶有某特定基因之人，不適合服用含有某特定成份的藥物，進而降低藥物副作用產(chǎn)生的風險；反之，也可以知道帶有某特定基因之人，特別適合服用含有某特定成份的藥物，進而提升治愈疾病的機率

3．藥物蛋白質(zhì)組學47醫(yī)學資源

4．蛋白質(zhì)工程

5．基因治療與基因疫苗

6．糖基化工程

7．先導物高通量篩選與藥物合理設計（rationaldrugdesign）

8．核酶、抗體酶、干擾RNA9．藥物生物信息學

10．功能抗體與人工智能技術(shù)和虛擬人技術(shù)48醫(yī)學資源二、蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)的分子設計蛋白質(zhì)工程：

在基因水平上設計表達新的功能蛋白

1．產(chǎn)品的特點（1）改善穩(wěn)定性（2）提高生物活性（3）延長體內(nèi)半衰期（4）降低免疫原性49醫(yī)學資源2．蛋白質(zhì)工程研究基本程序