生活中的發(fā)酵食物報告微生物工程實驗報學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)：生物技術(shù)年級：學(xué)號：學(xué)生姓名：組別：第一組指導(dǎo)老師：xxx老師時間：20xx年6月15日1摘要：發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的范疇，生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)作為一門新興的高科技術(shù)產(chǎn)業(yè)，在發(fā)酵技術(shù)中一般包括微生物細胞或動植物細胞的懸浮培養(yǎng)，或利用固定化酶，固定化細胞所做的反應(yīng)器加工底物，以及培養(yǎng)加工后產(chǎn)物大規(guī)模的分離提取等工藝。主要是在生物反應(yīng)過程中提供各種所需的最適環(huán)境條件。試驗采用L1523小型發(fā)酵罐對枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵液為液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。運用吸光光度法來表示生物量，繪制此過程枯草芽孢桿菌的生長曲線，通過革蘭氏染色確定芽孢產(chǎn)生情況，確定放罐時間等。Abstract:Fermentationengineeringaretheareasofbiotechnology,biotechnology,alsoknownasbiotechnology,modernbiotechnologyasanewHigh-TechIndustry.Infermentationtechnologyingeneral,includingmicrobialcellsoranimalandplantcellsuspensionculture,ortheuseofimmobilizedenzyme,theimmobilizedcellreactormadeprocessingofthesubstrate,aswellasaproductofthecultureafterprocessinglarge-scaleseparationandextractionprocess.Mainlyprovideallthenecessaryoptimumenvironmentalconditionsinthebioreactorprocess.UsingL1523smallfermentationtankfermentationofBacillussubtilisfermentationbrothfortheliquidbeefextractpeptonemedium.ThenusingphotometricmethodtorepresentthebiomassthisprocessisthegrowthcurveofBacillussubtilis,GramstaintodetermineBacillusproduceasituationtodeterminethetimeofthereleasetank.關(guān)鍵詞：發(fā)酵工程、生物技術(shù)、分離、提取Keyword：Fermentationengineering、biotechnology、separation、extraction2前沿：發(fā)酵工程（FermentationEngineering）屬于生物技術(shù)的范疇，生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)作為一門新興的高科技術(shù)產(chǎn)業(yè)，它的生命力在于他對社會經(jīng)濟和發(fā)展的各個方面都帶來了極大沖擊和影響。發(fā)酵工程是指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的技術(shù)。發(fā)酵工程由于涉及到生物催化劑，因而與化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。由于生物技術(shù)的最終目標(biāo)是建立工業(yè)生產(chǎn)過程為社會服務(wù)，因而該生產(chǎn)過程可稱為生物反應(yīng)過程（亦稱為生化反應(yīng)過程）。在發(fā)酵技術(shù)中一般包括微生物細胞或動植物細胞的懸浮培養(yǎng)，或利用固定化酶，固定化細胞所做的反應(yīng)器加工底物（即有生化催化劑參加），以及培養(yǎng)加工后產(chǎn)物大規(guī)模的分離提取等工藝。主要是在生物反應(yīng)過程中提供各種所需的最適環(huán)境條件。如酸堿度、濕度、底物濃度、通氣量以及保證無菌狀態(tài)等研究內(nèi)容。生物技術(shù)產(chǎn)品具有多樣性，各個學(xué)校的教學(xué)資源和課時不同，所進行的實驗種類不同。本實驗內(nèi)容根據(jù)本校的具體條件進行安排。安排的思路是以最簡潔有效的方式針對發(fā)酵過程的重要要素進行實驗，便于學(xué)生對教學(xué)內(nèi)容有個較好的認識，理順學(xué)習(xí)思路，為進行社會科學(xué)實踐打下良好基礎(chǔ)。小型發(fā)酵罐是實驗室進行小規(guī)模試驗研究的必備裝置，瑞士比歐生物工程公司生產(chǎn)的L1523型小型發(fā)酵罐主要由罐體、通氣系統(tǒng)、攪拌系統(tǒng)、加熱及控溫系統(tǒng)、監(jiān)測及控制系統(tǒng)等幾個部分組成。罐體：罐體是發(fā)酵生產(chǎn)微生物菌體或代謝產(chǎn)物的場所，一般由不銹鋼、陶瓷或特種玻璃制成，其體積根據(jù)需要可從0.1升到100升不等。L1523型發(fā)酵罐的體積為19升，發(fā)酵罐的外形由罐蓋、罐體和罐底組成。罐蓋：由耐腐蝕的不銹鋼構(gòu)成，其上有十二個圓孔，分別用于安裝pH探頭、溫度探頭、溶解氧探頭、氣壓表、調(diào)節(jié)pH的補酸、補堿管、排氣管過濾器、通氣管、放樣管和安全閥，靠近外側(cè)的兩個孔一般用塞子塞住，主要用于接種、加消泡劑等。罐體：由耐高溫、高壓的特種玻璃制成，其內(nèi)3有各種探頭、通氣管、放樣管、攪拌器和擋板等。罐底：由具夾層的不銹鋼制成，夾層內(nèi)與加熱器和冷卻水聯(lián)通，通過此夾層與發(fā)酵罐進行熱交換，以控制罐內(nèi)溫度。攪拌器也是通過罐底進入罐體的，稱為下攪拌，此外在罐底還有空氣分布器，能使壓縮空氣均勻分布于發(fā)酵罐中。通氣系統(tǒng)：L1523型發(fā)酵罐適用于好氣性微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，其空氣來源于空氣壓縮機。由空壓機壓縮的高壓空氣經(jīng)除油、除水和減壓裝置減壓后，通過預(yù)先滅菌的空氣過濾器過濾除菌，然后再經(jīng)空氣分布器、攪拌器和擋板等的共同作用，使無菌空氣均勻地分布到整個發(fā)酵罐。攪拌系統(tǒng)：發(fā)酵罐的攪拌裝置可分為上攪拌和下攪拌兩種類型，L1523型發(fā)酵罐屬于下攪拌，其攪拌器由攪拌電機驅(qū)動，轉(zhuǎn)速高達1000rpm。加熱與控溫系統(tǒng)：L1523發(fā)酵罐為原位滅菌發(fā)酵罐，利用自帶的小型加熱器(鍋爐)，可進行培養(yǎng)基的滅菌和保溫，再借助于冷卻水(自來水)可使發(fā)酵罐內(nèi)的滅菌溫度和發(fā)酵溫度精確地保持恒定(誤差為±0.1℃)。監(jiān)測及控制系統(tǒng)：小型發(fā)酵罐一般都配備有監(jiān)測控制系統(tǒng)，可以監(jiān)測和控制攪拌器的轉(zhuǎn)速、滅菌和發(fā)酵的溫度、pH值、溶解氧量等。L1523型發(fā)酵罐可通過計算機實現(xiàn)自動控制，中間可借助蠕動泵和補料系統(tǒng)自動補料和調(diào)節(jié)pH值等。4正文：一、實驗材料與方法1、實驗材料1.1菌種枯草芽孢桿菌V1J，黑曲霉菌株1.2培養(yǎng)基1.2.1斜面菌種培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂20.0g，水1000ml，pH7.2~7.4，0.1Mpa，121℃，滅菌30min。配制500ml固體培養(yǎng)基，分裝入20支15×150mm試管(每管約5ml)和3個250ml三角瓶中，包裝、滅菌。試管擺成斜面。1.2.2三角瓶種子培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，水1000ml，pH7.2~7.4，0.1Mpa，121℃，滅菌30min。配制液體培養(yǎng)基1000ml，分裝到10個250ml三角瓶中，每瓶100ml，滅菌。1.2.3PDA培養(yǎng)基的制備稱取去皮馬鈴薯200g，切片，放入小鍋中，加入1000ml水，加熱煮沸10—15分鐘，用8層紗布過濾。取濾液加入蔗糖20g、瓊脂20g，加熱熔化后補足水分（自然pH），然后分裝到20支15×150mm試管（5ml/支）和6個250ml三角瓶（150ml/瓶）中，于0.1Mpa，121℃滅菌30min。1.3試劑及藥品馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、蒸餾水、NaCl、NaOH、H2SO4、酒精（75%和95%各一瓶）、消泡劑（豆油）、沙黃、孔雀綠等2、方法2.1滅菌劑實驗前準備2.1.11ml無菌吸管：每組30支，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘。2.1.2無菌水：18×180mm試管，每支裝9ml水，每組40支，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘（作標(biāo)準曲線10倍稀釋法用）；另配3-5個三角瓶無菌水（總1升）；另配10余支4.5ml15×150mm(稀釋、抑菌試驗作對照，洗菌（枯草芽孢桿菌洗菌接種、黑曲霉洗菌涂布等）。2.1.3無菌培養(yǎng)皿：每組40套，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘。2.1.4無菌大試管（18×180mm試管）：每組20個，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘。主要用于發(fā)酵液取樣方便，量足，取樣時接近1/2。不夠再滅菌使用。2.1.5無菌吸管（可用無菌槍頭取代，用于吸少量液體涂布和作抑菌試驗等）：1ml吸管，每組20支，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘。2.1.6空氣過濾器的滅菌：空氣過濾器針尖先用紗布包扎好，然后再用包裝紙和5繩子將空氣過濾器整體包裝好，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘。2.1.7牛津杯的滅菌：將36只牛津杯裝入培養(yǎng)皿中，每皿10只，用包裝紙包裝好，于0.1Mpa，121℃滅菌30分鐘。2.1.8消泡劑的滅菌：量取100ml豆油倒入250ml三角瓶中（每組3~4瓶），包裝好后于0.1Mpa，121℃，滅菌30分鐘。2.1.91NH2SO4和1NNaOH溶液滅菌，用來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH。配制75%和95%的酒精棉球各一瓶2.2培養(yǎng)方法2.2.1斜面菌種的培養(yǎng)將已活化兩次的試管斜面菌種接種到牛肉膏蛋白胨試管斜面上，30℃培養(yǎng)18~20小時，即為斜面菌種。2.2.2種子液的制備將試管斜面用4.5ml無菌水洗下，然后接種到250ml三角瓶培養(yǎng)基中，每瓶一管，接三瓶，于30℃，150rpm條件下，振蕩培養(yǎng)18~20小時（一級種子）。由三角瓶移接入另外500ml三角瓶（或更多的250ml三角瓶）中擴大培養(yǎng)（此為二級種子），保證二級種子接種量7-10%（如13L發(fā)酵液則為910-1300ml左右，其中還包括預(yù)留一部分作標(biāo)準曲線用）。2.2.3發(fā)酵生產(chǎn)2.2.3.1細菌細胞濃度的測定（比濁法）2.2.3.2標(biāo)準曲線的制作取無菌水9支，編號，將在30℃、150rpm條件下培養(yǎng)20~22小時的枯草桿菌細胞按二倍系列稀釋法進行適當(dāng)稀釋，使其濃度分別為原液、1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/12、1/16、1/32、1/64原液，同時以無菌水作為空白對照，利用分光光度計測定其在580nm波長下的O.D.值，并求出原液OD值的平均值；然后，采用平板菌落計數(shù)法-6-7-8-7（注意：這是十倍稀釋法）測定其中的細胞數(shù)量（大約10、10、10，如太濃則10、-8-910、10，每一個梯度用三個重復(fù)），換算出原液細胞數(shù)量的平均值。（注：為保證標(biāo)-5-6-7準曲線成功率，加之不知何種濃度稀釋適于涂布平板計數(shù)，建議學(xué)生10、10、10、-8-9-6-7-810、10各個梯度各3個重復(fù)，如果還不成功，則可減少梯度，如選10、10、10三個梯度3重復(fù)再作一次，具體情況視前面平板的菌落長相而定其梯度，但保證三個重復(fù)以保證其成功率）。以O(shè).D.值作為縱坐標(biāo)，每ml樣品中的細胞數(shù)作為橫坐標(biāo)，曲線換算，繪制標(biāo)準曲線。2.2.3.3發(fā)酵液細胞濃度的測定從取樣管放出10ml左右的發(fā)酵液至無菌大試管（18×180mm試管）中，在580nm波長下，測定發(fā)酵液的O.D.值，對照標(biāo)準曲線，可知該發(fā)酵液的細胞濃度。2.2.3.4發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌每組配制13L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（pH7.4），另再加0.1%的酵母膏，用乳膠管小心地加入發(fā)酵罐中，然后旋緊塞子，安裝好防護罩，按下面的方法滅菌：6（1）檢查水、電、氣以及發(fā)酵罐的密封性是否正常。如正常即可滅菌。（2）打開進水閥，調(diào)節(jié)水壓使水壓表指針指示在0.2~0.4之間，使水充滿加熱器，防止燒壞加熱器。（出水閥近關(guān)閉情況下，達到0.4，此時出水閥雖然關(guān)閉，但進水閥打開，此外水壓也滿足要求，所以水能充滿加熱器不至于燒壞，當(dāng)滅菌結(jié)束降溫時，熱水會走另一條旁路（非出水閥的另一條出口）泄壓。）（3）打開發(fā)酵罐的總電源。（4）打開攪拌器的電源開關(guān)，使攪拌器轉(zhuǎn)速控制在300rpm，培養(yǎng)時根據(jù)要求調(diào)整。（5）適當(dāng)開啟排氣口排氣，但應(yīng)注意：排氣口不能開得過大，否則，培養(yǎng)基的水分損失嚴重?。。?）打開溫度控制器的電源開關(guān)，將滅菌溫度設(shè)定為121℃，滅菌時間設(shè)定為30min，發(fā)酵溫度設(shè)定為30℃。啟動滅菌開關(guān)，進行自動滅菌。（7）滅菌結(jié)束后，發(fā)酵罐會自動降溫，當(dāng)溫度低于95℃時，通過無菌操作，安裝好已滅菌的空氣過濾器，（即關(guān)上門窗，解開繩子，放好95%酒精在安裝孔的周圍，關(guān)上進氣口，開大出氣口，保證極低正壓以保安全和防止雜菌落入罐內(nèi)，先旋松螺蓋，點燃95%酒精，在火上操作裝上空氣過濾器。工具有：尖嘴鉗、鑷子、95%和75%的酒精）然后，通入無菌空氣，使培養(yǎng)基快速降溫，并使發(fā)酵罐保持一定的正壓，以減少污染。（8）當(dāng)溫度低于35℃時即可接種發(fā)酵。（操作同（7）里類似）2.2.3.5接種在發(fā)酵罐的罐蓋上選擇一個塞子，先用75%的酒精棉球在其周圍消毒，同時消毒尖嘴鉗，然后在塞子周圍放置吸滿無水酒精的棉花，點燃酒精，用鉗子小心打開塞子，取出置于火焰上，將三角瓶種子按5%的接種量迅速倒入發(fā)酵罐內(nèi)，旋緊塞子。2.2.3.6發(fā)酵在滅菌達到121℃時校正溶氧電極的讀數(shù)為零，接種后當(dāng)溫度達到培養(yǎng)溫度、攪拌速度穩(wěn)定、通氣量穩(wěn)定時，校溶氧電極至95%以上。攪拌速度設(shè)定為350rpm，發(fā)酵溫度設(shè)定為28℃，開始計時發(fā)酵。發(fā)酵時間根據(jù)細菌生長情況而定，一般約70小時。2.2.3.7繪制枯草桿菌的生長曲線發(fā)酵培養(yǎng)基接種后，從0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30、??小時，分別取樣測定發(fā)酵液的O.D.值，繪制出枯草桿菌的生長曲線?？莶輻U菌的鏡檢發(fā)酵接種以后，12，24，36，??每隔12小時芽孢染色鏡檢一次，觀察芽孢和菌體情況（看芽孢何時長出來和芽孢何時脫落），確定是否可下罐（一般芽孢數(shù)多，且脫落宜下罐。）2.2.3.8抗生素的檢測將黑曲霉用PDA培養(yǎng)基活化，然后接種到PDA試管斜面上，培養(yǎng)36~48h。取3套無菌培養(yǎng)皿倒入PDA培養(yǎng)基，冷凝后置30℃溫箱中過夜。將培養(yǎng)好的黑曲霉試管斜面7用4.5ml無菌水洗下，然后將菌懸液分別倒入三套PDA平板上，用玻璃涂棒涂勻。（操作：吸0.3ml左右到一平板，涂布，其它平板相同操作）。采用無菌操作，用無菌小鑷子將牛津杯輕輕放在培養(yǎng)基上。每皿放兩只，并作好標(biāo)記（參見下圖）。分別將發(fā)酵20、30、40、50、60、70h的發(fā)酵液用無菌18×180mm大試管取出，用移液槍吸取0.25~0.3ml(0.5ml會溢出)發(fā)酵液至一只牛津杯內(nèi)（發(fā)酵液可預(yù)先用離心管離心，10000轉(zhuǎn)16分鐘，吸中間清液，上層是油層，中層是清液，下層菌細胞，但盡量保證無菌，如離心管先用酒精擦洗一下為好），另一只加入0.25~0.3ml無菌水，共三個重復(fù)。靜置30min，將培養(yǎng)皿小心放入30℃溫箱中，培養(yǎng)48h，觀察并記錄抑菌圈的大小。實驗過程中，盡量不要移動牛津杯.3、實驗器材試管、PH儀、牛津杯、發(fā)酵罐、嵌子、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡、電爐、超凈臺、接種環(huán)、接種針、酒精燈、燒杯、鑷子、培養(yǎng)皿、三角瓶等。二、實驗結(jié)果與分析2.1標(biāo)準曲線的制作8標(biāo)準曲線是用于判斷測量OD值下的細菌數(shù)量。實驗標(biāo)準曲線中的點過于分散，差異較大。用于判斷細菌數(shù)量有點過于強求了，應(yīng)再次重復(fù)做標(biāo)準曲線。2.2鏡檢結(jié)果及圖片芽孢是細菌對外界環(huán)境變化高度適應(yīng)的一種結(jié)果，是細胞質(zhì)高度縮水而形成的一種高密度的無性生殖結(jié)構(gòu)。運用革蘭氏染色法可將細菌分成革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰9性菌，陽性菌被染成紫色，陰性菌被染成紅色。從染色結(jié)果看枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陰性菌。芽孢在最后階段才形成，并且脫落在培養(yǎng)基中。說明在后期培養(yǎng)中，培養(yǎng)基已經(jīng)基本消耗殆盡，環(huán)境已經(jīng)不能滿足菌體的營養(yǎng)生長。此時可以判斷菌體處在生長的衰亡期，據(jù)此可以確定是否放罐。抑菌性是指優(yōu)勢菌種對其他雜菌的抑制作用，或者某些菌種能分泌某些抗菌素的刺激產(chǎn)物對其他菌種的抑制作用。前者主要是通過生物量、生物代謝率來抑制雜菌的生長；后者則是通過分泌代謝產(chǎn)物來抑制雜菌某些代謝途徑或某些必需組成成分來抑制菌體生長。通常所說的抑菌則是指后者。通過實驗數(shù)據(jù)可以了解到，在最初24小時內(nèi)沒有抑菌素的存在，即沒有抑菌圈產(chǎn)生。這是由于在開始時間內(nèi)菌體處在快速生長過程中，營養(yǎng)豐富、環(huán)境優(yōu)越，不會產(chǎn)生抑菌素。在24—40h內(nèi)真菌分泌的抗菌素逐漸增多，到40h時達到最大值，所以抑菌圈最大。這是由于菌體數(shù)量增多致使菌體的生長招到營養(yǎng)和環(huán)境因素的壓力，所以菌體會產(chǎn)生抑菌素增強自身的適應(yīng)性。后期隨著環(huán)境進一步惡化，菌體已經(jīng)開始解體，基10本無抑菌效應(yīng)，即抑菌圈慢慢減小。（注