（優(yōu)選）zj基因工程第章工具酶現(xiàn)在是1頁\一共有89頁\編輯于星期一重組DNA技術(shù)所需的基本條件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的載體C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞現(xiàn)在是2頁\一共有89頁\編輯于星期一第二章基因工程工具酶現(xiàn)在是3頁\一共有89頁\編輯于星期一現(xiàn)在是4頁\一共有89頁\編輯于星期一用于核酸操作的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA連接酶

DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶現(xiàn)在是5頁\一共有89頁\編輯于星期一切:

限制性內(nèi)切酶

“分子手術(shù)刀”現(xiàn)在是6頁\一共有89頁\編輯于星期一第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

宿主細(xì)胞的限制和修飾現(xiàn)象限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及類型限制性核酸內(nèi)切酶的命名Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的功能Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素限制性核酸內(nèi)切酶的星活性甲基化酶及其基本特征現(xiàn)在是7頁\一共有89頁\編輯于星期一仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因?yàn)镋.coliBphage對(duì)λ(K)進(jìn)行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）1宿主細(xì)胞的限制和修飾現(xiàn)象現(xiàn)在是8頁\一共有89頁\編輯于星期一限制性內(nèi)切酶

能識(shí)別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。現(xiàn)在是9頁\一共有89頁\編輯于星期一限制(restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。限制作用：實(shí)際就是限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用：宿主細(xì)胞通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的?，F(xiàn)在是10頁\一共有89頁\編輯于星期一NNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’現(xiàn)在是11頁\一共有89頁\編輯于星期一1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈；主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用。hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)2限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及類型現(xiàn)在是12頁\一共有89頁\編輯于星期一2限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及類型主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)多功能異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCTAACN6GTGC距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割單功能同源二聚體Mg2+

旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割雙功能異源二聚體ATPMg2+SAMGAGCCCAGCAG距識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割現(xiàn)在是13頁\一共有89頁\編輯于星期一屬名

種名

株名Haemophilus

influenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶3限制性核酸內(nèi)切酶的命名現(xiàn)在是14頁\一共有89頁\編輯于星期一4Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的功能4.1II型限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列及切割方式識(shí)別位點(diǎn)

識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列，大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)，識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)

EcoRI的切割位點(diǎn)

EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)5`…GCTGAATTCGAG…3`3`…CGACTTAAGCTC…5`現(xiàn)在是15頁\一共有89頁\編輯于星期一PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’切割類型及產(chǎn)生末端特征現(xiàn)在是16頁\一共有89頁\編輯于星期一EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP現(xiàn)在是17頁\一共有89頁\編輯于星期一PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP現(xiàn)在是18頁\一共有89頁\編輯于星期一4.2同裂酶與同尾酶同裂酶(isoschizomers):有一些來源不同的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的是同樣的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。

例：SmaI和XmaI(CCCGGG)。同尾酶(isocaudamer):有一些來源不同的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶稱為同尾酶。例：BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。

現(xiàn)在是19頁\一共有89頁\編輯于星期一5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡBamHⅠBclⅠBglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來?，F(xiàn)在是20頁\一共有89頁\編輯于星期一5Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件5.1標(biāo)準(zhǔn)酶切體系的建立大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCL50mMpH7.5MgCL210mMNaCL0-150mMDTT1mMVolume20-100ulTT37℃1-2.5h1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1ug標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量現(xiàn)在是21頁\一共有89頁\編輯于星期一

1)將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為18uL。 2)加入2uL適當(dāng)?shù)?0×限制酶消化緩沖液，輕敲管外壁混勻。 3)加入1～2單位限制酶，輕彈管外壁混勻。 4)將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育。 5)反應(yīng)終止現(xiàn)在是22頁\一共有89頁\編輯于星期一II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液。

若沒有通用緩沖液時(shí)，使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解。低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切。II型核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的終止65℃，溫浴5分鐘（常用）加入終止液（如EDTA）加入等體積的酚，抽提酶解產(chǎn)物現(xiàn)在是23頁\一共有89頁\編輯于星期一5.2Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA分子的不完全酶解

減少酶量；增加反應(yīng)體積；縮短反應(yīng)時(shí)間；降低反應(yīng)溫度；現(xiàn)在是24頁\一共有89頁\編輯于星期一5.3Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)

商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶，加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時(shí)將會(huì)抑制酶的活性。整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量?，F(xiàn)在是25頁\一共有89頁\編輯于星期一6影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素6.1DNA樣品的純度：

蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCL提高限制性內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA的反應(yīng)效率的方法加大酶的用量，1ugDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時(shí)間現(xiàn)在是26頁\一共有89頁\編輯于星期一6.2DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5`-GATC-3`序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclIMbol等，但BamHIBglII不受影響。大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5`-CCAGG-3`或5`-CCTGG-3`序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等現(xiàn)在是27頁\一共有89頁\編輯于星期一6.3酶的純度6.4酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間6.5DNA分子的構(gòu)型6.6限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液現(xiàn)在是28頁\一共有89頁\編輯于星期一

7Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的星活性高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性（Staractivity）”現(xiàn)象EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5`-GAATTC-3`序列，但在甘油濃度超過5%（V/V）時(shí)，也可切割5`-PuPuATPyPy-3`或者5`-AATT-3`現(xiàn)在是29頁\一共有89頁\編輯于星期一星活性產(chǎn)生的原因如下：

反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。酶用量過大，大于100U/微克DNA。低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L。高pH，大于8.0。含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)離子的存在。現(xiàn)在是30頁\一共有89頁\編輯于星期一Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶兩種酶分子組成。大多數(shù)限制酶都已分離出相應(yīng)的甲基化酶。甲基化酶也稱修飾酶(modificationenzyme)，用來修飾限制酶的識(shí)別序列，在該序列位點(diǎn)的胞嘧啶（C）5-氨基上加一個(gè)甲基，使得該序列可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別而免于切割。

8甲基化酶(methylase)現(xiàn)在是31頁\一共有89頁\編輯于星期一甲基化酶分兩類：維持性甲基化酶：用于在新合成的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用封閉DNA鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)現(xiàn)在是32頁\一共有89頁\編輯于星期一接:

DNA連接酶

“分子針線”現(xiàn)在是33頁\一共有89頁\編輯于星期一第二節(jié)DNA連接酶

DNA連接酶的基本性質(zhì)及作用機(jī)理DNA連接酶的種類DNA連接酶的連接反應(yīng)影響連接反應(yīng)的因素現(xiàn)在是34頁\一共有89頁\編輯于星期一1DNA連接酶的基本性質(zhì)及作用機(jī)理現(xiàn)在是35頁\一共有89頁\編輯于星期一1DNA連接酶的基本性質(zhì)及作用機(jī)理

修復(fù)雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick現(xiàn)在是36頁\一共有89頁\編輯于星期一T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’1DNA連接酶的基本性質(zhì)及作用機(jī)理

修復(fù)與RNA結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵現(xiàn)在是37頁\一共有89頁\編輯于星期一1DNA連接酶的基本性質(zhì)及作用機(jī)理

連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶現(xiàn)在是38頁\一共有89頁\編輯于星期一2DNA連接酶的種類T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶T4噬菌體RNA連接酶熱穩(wěn)定的DNA連接酶現(xiàn)在是39頁\一共有89頁\編輯于星期一Tris-HCL50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20uLTT4-15℃4-16h1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1ugλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量。3DNA連接酶的連接反應(yīng)現(xiàn)在是40頁\一共有89頁\編輯于星期一T4-DNA連接酶：

T4-噬菌體連接溫度：不高于粘性末端熔點(diǎn)溫度（Tm）

≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；現(xiàn)在是41頁\一共有89頁\編輯于星期一連接方式：

相同粘性末端的連接

平頭末端的連接現(xiàn)在是42頁\一共有89頁\編輯于星期一平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢的多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)。加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM現(xiàn)在是43頁\一共有89頁\編輯于星期一4影響連接反應(yīng)的因素DNA末端的濃度反應(yīng)溫度

不高于粘性末端熔點(diǎn)溫度（Tm）

≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；ATP濃度酶的用量現(xiàn)在是44頁\一共有89頁\編輯于星期一第三節(jié)DNA聚合酶

大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段T4噬菌體DNA聚合酶測序酶TaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶現(xiàn)在是45頁\一共有89頁\編輯于星期一DNA聚合酶的種類現(xiàn)在是46頁\一共有89頁\編輯于星期一1大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI現(xiàn)在是47頁\一共有89頁\編輯于星期一三種酶活性DNA聚合活性

dTTP3'3'ATGCAATTGC5'||||5`

TACGppi

T現(xiàn)在是48頁\一共有89頁\編輯于星期一聚合反應(yīng)的特點(diǎn)：

1、聚合反應(yīng)具有方向性:5’3’2、DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的脫氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3`-OH逐個(gè)添加脫氧核苷酸，使核苷酸鏈不斷延長。3’3’引物現(xiàn)在是49頁\一共有89頁\編輯于星期一核酸外切酶活性5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAG5’現(xiàn)在是50頁\一共有89頁\編輯于星期一5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’?3’5’外切酶活性

能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解5’3’外切酶活性

能切除突變的DNA片段

AC現(xiàn)在是51頁\一共有89頁\編輯于星期一應(yīng)用切口移位法標(biāo)記DNA

在DNase的作用基礎(chǔ)上產(chǎn)生鏈內(nèi)切口，應(yīng)用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步聯(lián)合反應(yīng)，使切口沿DNA鏈從5’-端向3’-端移動(dòng)。若用于聚合反應(yīng)的原料dNTP帶有放射性核素α32P，就能使生成的雙鏈帶有標(biāo)記物。5’3’現(xiàn)在是52頁\一共有89頁\編輯于星期一現(xiàn)在是53頁\一共有89頁\編輯于星期一3’-粘端的末端標(biāo)記先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其補(bǔ)平，在高濃度的dNTP條件下，使3’-端的外切反應(yīng)與dNTP的攙入反應(yīng)達(dá)到平衡。若dNTP中有放射性標(biāo)記的核苷酸，即可使產(chǎn)物成為3’-末端帶標(biāo)記的DNA。3’5’5’3’現(xiàn)在是54頁\一共有89頁\編輯于星期一合成cDNA的第二鏈cDNA5’3’5’3’現(xiàn)在是55頁\一共有89頁\編輯于星期一2大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得Ｃ端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。現(xiàn)在是56頁\一共有89頁\編輯于星期一小片段N端C端木瓜蛋白酶大腸桿菌DNA聚合酶I5核酸外切酶活性大片段（

Klenow片段）

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性現(xiàn)在是57頁\一共有89頁\編輯于星期一Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5`粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列現(xiàn)在是58頁\一共有89頁\編輯于星期一Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’現(xiàn)在是59頁\一共有89頁\編輯于星期一Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’現(xiàn)在是60頁\一共有89頁\編輯于星期一3T4-DNA聚合酶基本特性：

5`→3的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性；在無dNTP時(shí)，可以從任何3`-OH端外切；在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止；在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位；現(xiàn)在是61頁\一共有89頁\編輯于星期一T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多現(xiàn)在是62頁\一共有89頁\編輯于星期一T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘現(xiàn)在是63頁\一共有89頁\編輯于星期一4T7DNA聚合酶與測序酶T7DNA聚合酶來源于T7噬菌體感染的大腸桿菌，持續(xù)合成能力很強(qiáng)。對(duì)T7DNA聚合酶進(jìn)行化學(xué)修飾或基因工程改造，去除該酶的3`-5`外切酶活性，而保留其聚合活性，即為測序酶?，F(xiàn)在是64頁\一共有89頁\編輯于星期一TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶。最適溫度75℃~80℃。對(duì)基因的克隆、測序、突變研究和檢測診斷等方面發(fā)揮巨大的作用。5TaqDNA聚合酶現(xiàn)在是65頁\一共有89頁\編輯于星期一6依賴于RNA的DNA聚合（反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA現(xiàn)在是66頁\一共有89頁\編輯于星期一反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’現(xiàn)在是67頁\一共有89頁\編輯于星期一1975年，H.TeminRNA病毒:勞斯雞肉瘤病毒放線菌素D(-)(-)DNA合成RNADNA(前病毒)RNA

“前病毒假說”現(xiàn)在是68頁\一共有89頁\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：

RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA

雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA雙鏈DNA*逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣具有遺傳物質(zhì)的傳代與表達(dá)功能?，F(xiàn)在是69頁\一共有89頁\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用:應(yīng)用于基因工程基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈現(xiàn)在是70頁\一共有89頁\編輯于星期一基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA

cDNA文庫的組建現(xiàn)在是71頁\一共有89頁\編輯于星期一第四節(jié)核酸酶

核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶脫氧核糖核酸酶大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ核糖核酸酶A核糖核酸酶T1核糖核酸酶H現(xiàn)在是72頁\一共有89頁\編輯于星期一核酸酶是一類降解核酸的水解酶

1核糖核酸酶1.1核糖核酸酶A（RNaseA)來源于牛胰臟，攻擊RNA上嘧啶殘基的3`端，水解胞嘧啶或尿嘧啶與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵。用途：（1）去除DNA：RNA雜交體中未雜交的RNA區(qū)。（2）RNA檢測。（3）消化DNA樣品中的RNA分子?，F(xiàn)在是73頁\一共有89頁\編輯于星期一1.2核糖核酸酶T1（RNaseT1)來源于米曲霉，攻擊RNA上鳥嘌呤的3`端磷酸，鳥嘌呤的3`端磷酸與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵。1.3核糖核酸酶H（RNaseH)來源于小牛胸腺，特異性降解DNA：RNA雜交鏈中的RNA鏈?，F(xiàn)在是74頁\一共有89頁\編輯于星期一3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNARNaseH3’AAAA

AAA

AAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNApolI3’AAAAAAAAAAAAAA5’cDNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA現(xiàn)在是75頁\一共有89頁\編輯于星期一用途：（1）參于切口平移；（2）使用DNaseI足跡法測定DNA結(jié)合蛋白的位置；（3）通過鳥槍法，制備DNA文庫；（4）消化RNA樣品中的DNA分子；2脫氧核糖核酸酶2.1脫氧核糖核酸酶I（DNaseI)來源于牛胰臟，從嘧啶殘基的5`端隨機(jī)降解單鏈或雙鏈DNA，或在Mg2+存在下在雙鏈DNA分子上隨機(jī)產(chǎn)生切口?，F(xiàn)在是76頁\一共有89頁\編輯于星期一2.2雙鏈核酸外切酶（exoⅦ)ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’可使DNA分子變?yōu)槠筋^末端，不需要Mg2+現(xiàn)在是77頁\一共有89頁\編輯于星期一2.3雙鏈核酸外切酶（exoⅢ)ExoⅢ3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’現(xiàn)在是78頁\一共有89頁\編輯于星期一2.4λ核酸外切酶（λExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5‘端外切3’5’3’5’現(xiàn)在是79頁\一共有89頁\編輯于星期一3單鏈核酸內(nèi)切酶（S1核酸酶）S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌；降解單鏈DNA或RNA；包括雙鏈分子中的單鏈區(qū)降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍最適pH范圍為4.0---4.3需要NaCl10-300mMZn2+必需現(xiàn)在是80頁\一共有89頁\編輯于星期一S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C