DNA多態(tài)性分型技術(shù)演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日DNA多態(tài)性分型技術(shù)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日什么是DNA多態(tài)性?現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日多態(tài)性（polymorphism）是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）或基因多態(tài)性。從本質(zhì)上來(lái)講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒(méi)有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日DNA多態(tài)性對(duì)微生物有哪些實(shí)際意義？將導(dǎo)致——不同的細(xì)菌亞型——耐藥菌株出現(xiàn)——毒力變異株出現(xiàn)——抗原漂移與抗原變異。。。。?！，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日在疾病預(yù)防控制中的應(yīng)用同源性追蹤細(xì)菌分型傳染控制現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日DNA多態(tài)性分析常用的方法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（自學(xué)要考）脈沖場(chǎng)凝膠電泳。。。。?！，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP

——以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記，是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術(shù)、探針-雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日每種生物基因型具有其獨(dú)特的特征，及獨(dú)特的限制酶識(shí)別序列分布，其基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等片段，這些片段經(jīng)電泳以后幾乎是連續(xù)排列的，如用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，將與被標(biāo)記的DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來(lái)，即可構(gòu)建出多態(tài)性圖譜?；驹憩F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日因此，RFLP即是基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化核酸及標(biāo)記的DNA探針能與任何序列相似的片段雜交，通過(guò)片段長(zhǎng)度變異性來(lái)檢測(cè)生物體多態(tài)性?；驹憩F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日基本方法

提取基因組DNA制性內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳DNA變性、轉(zhuǎn)膜、固定核酸雜交顯影、顯色、分析現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease，RE）

一類能識(shí)別環(huán)狀或線性雙鏈DNA特定核苷酸序列的DNA水解酶，在合適反應(yīng)條件下，使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)，產(chǎn)生多種可測(cè)量的寡核苷酸片段的酶。

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日內(nèi)切酶的命名規(guī)則前三個(gè)字母代表其來(lái)源的細(xì)菌種名，用斜體字母，第四個(gè)字母代表菌株名稱，如果同一株菌有不同限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)，則不同的內(nèi)切酶系用羅馬數(shù)字區(qū)分。

例：EcoRI代表該酶來(lái)源于E.coli的R菌株。

現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日瓊脂糖凝膠電泳槽和電泳儀現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日轉(zhuǎn)移電泳槽現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日核酸分子雜交的概念及原理核酸雜交:兩個(gè)不同來(lái)源的、含有互補(bǔ)核苷酸順序的單股核酸分子，通過(guò)堿基配對(duì)形成一個(gè)新的、穩(wěn)定的雙股分子的過(guò)程?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

核酸經(jīng)加熱變性后，在低于變性溫度20℃~30℃時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中加入的核酸探針與待測(cè)核酸樣品中具有互補(bǔ)序列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)即可檢測(cè)特定的核苷酸片段。

核酸分子雜交技術(shù)原理現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日根據(jù)探針上的標(biāo)記，可用放射自顯影或加入酶底物顯色的方式觀察結(jié)果。現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日優(yōu)點(diǎn)1．可靠性較高2．來(lái)源于自然變異3．標(biāo)記覆蓋面廣優(yōu)缺點(diǎn)現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日缺點(diǎn)：①檢測(cè)步驟多，周期長(zhǎng)；②對(duì)DNA需求量大，一般需要5~l0μg，純度要求較高；③技術(shù)復(fù)雜，操作繁瑣，工作量大；④具有放射性的危害；⑤檢測(cè)成本高?，F(xiàn)在是22頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日討論：RFLP與脈沖場(chǎng)凝膠電泳都是根據(jù)基因組上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的多態(tài)性來(lái)對(duì)生物進(jìn)行基因分型的，那么它們兩者的異同點(diǎn)有哪些呢？現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日基于上述RFLP的缺點(diǎn)，一種更好的分析技術(shù)——聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（PCR-RFLP）應(yīng)運(yùn)而生?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日結(jié)合PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其基本原理是對(duì)目的基因片段PCR擴(kuò)增后，利用多種限制性內(nèi)切酶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同基因序列，不同限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，在電泳后可產(chǎn)生不同電泳圖譜，通過(guò)對(duì)電泳圖譜的分析，得出基因多態(tài)性結(jié)果。思考：需要和探針做核酸雜交嗎？為什么？基本原理根據(jù)名稱：PCR-RFLP猜想本方法的原理？現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日1.提取DNA2.設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行目的基因PCR反應(yīng)3.將DNA擴(kuò)增產(chǎn)物選用合適限制性內(nèi)切酶酶切4.將酶切出來(lái)的具各種長(zhǎng)度的DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離5.對(duì)顯示出來(lái)的帶譜進(jìn)行分析。

基本程序根據(jù)基本原理思考基本程序？現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①敏感性高。②操作簡(jiǎn)便省時(shí)。缺點(diǎn)：①影響因素較多。②不能完全區(qū)分基因非常相似，甚至只有一個(gè)核苷酸差異的生物類型。

現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日RFLP與PCR-RFLP的應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌IS6110-RFLP分析厭氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析其他現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日二、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)randomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD

以PCR技術(shù)為背景，以人工合成的堿基順序隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分離后產(chǎn)生DNA指紋圖譜。

現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日模板DNA經(jīng)92～94℃變性解鏈后，在較低溫度下退火，此時(shí)，有許多位點(diǎn)能與隨機(jī)合成的短引物互補(bǔ)而形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果某兩位點(diǎn)間在可擴(kuò)增范圍之內(nèi)，且分別位于互補(bǔ)的兩條單鏈上，并且與引物的3’端相對(duì)應(yīng)，就可以通過(guò)PCR得到一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物?；驹憩F(xiàn)在是30頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日RAPD所用的一系列DNA引物序列各不相同，但對(duì)于任意特定引物，它同基因組DNA序列有其特定結(jié)合位點(diǎn)，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)變化，而使PCR產(chǎn)物增加、減少或發(fā)生分子量改變，產(chǎn)生多態(tài)性圖譜?；驹憩F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日總DNA提取隨機(jī)引物合成PCR擴(kuò)增隨機(jī)引物篩選電泳檢測(cè)圖譜分析現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日①采用隨機(jī)引物，無(wú)需預(yù)先知道被研究生物基因組核苷酸序列；②引物短，在整個(gè)基因組內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)多，2種甚至多種引物可混用；③成本較低；④操作簡(jiǎn)便，快速；⑤DNA分析效率較高；⑥所需DNA樣品少。優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日①重復(fù)性不高（最大缺點(diǎn)）；②只能區(qū)分不同大小的片段，而不能區(qū)分有不同堿基序列但大小相同片段；③需對(duì)引物進(jìn)行篩選，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日三、細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)（repetitive-elementPCR,rep-PCR）——一種基于PCR的DNA標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日rep-PCR技術(shù)是利用基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列（repetitivesequences)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行比較，來(lái)分析菌株間基因組存在的差異。rep-PCR-原理現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

目前研究最多、最常用的細(xì)菌基因組短重復(fù)序列有：rep-PCR-短重復(fù)序列基因外重復(fù)回文序列（RepetitiveIntergenicPalindrome,REP)腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列（Entero-bacterialRepetitiveIntergenicConsensus,ERIC)現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

兩者的共同特征是它們?cè)诩?xì)菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數(shù)量的差異，而序列本身在進(jìn)化過(guò)程中又具有較強(qiáng)的保守性。

基于這兩種短重復(fù)序列的PCR就成為rep-PCR的2個(gè)重要的技術(shù)——REP-PCR和ERIC-PCR。rep-PCR-短重復(fù)序列現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日兩種短重復(fù)序列的特點(diǎn)及功能：

基因外重復(fù)回文序列（REP）又稱回文單位，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是回文性質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄的mRNA有形成莖-環(huán)（stem-loop）結(jié)構(gòu)的潛能。

REP家族序列由38bp構(gòu)成，含有6個(gè)非常保守的位點(diǎn)及5bp構(gòu)成的位于非常保守的回文臂之間的保守環(huán)。REP序列rep-PCR-REP序列現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日REP家族序列廣泛分布在大腸埃希菌和沙門(mén)菌基因組內(nèi)(提示什么？）。REP序列可以單獨(dú)出現(xiàn)或增加為4個(gè)串聯(lián)的重復(fù)單位。在E.coli的染色體上，存在500到1000個(gè)的REP串聯(lián)重復(fù)單位，在沙門(mén)菌上REP串聯(lián)重復(fù)單位約占基因組的1%。rep-PCR-REP序列現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日REP序列的功能：rep-PCR-REP序列轉(zhuǎn)錄終止作用；穩(wěn)定mRNA；在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用?，F(xiàn)在是41頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

根據(jù)REP這段高度保守的重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增兩段REP之間的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和片段長(zhǎng)短的不同就直接反映了基因組DNA的差異，從而可對(duì)菌株進(jìn)行分型和同源性分析，這就是rep-PCR技術(shù)中的REP-PCR技術(shù)。rep-PCR-REP-PCR技術(shù)現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列（ERIC）長(zhǎng)約126bp，其中包含幾個(gè)反向重復(fù)序列，具有非常保守的中央倒置重復(fù)區(qū)，轉(zhuǎn)錄后的mRNA形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中位于莖部位的一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，與其相對(duì)應(yīng)的堿基也要發(fā)生相應(yīng)的改變，從而保證二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。rep-PCR-ERIC序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

ERIC序列的功能目前還不太清楚，在一些研究中，ERIC被認(rèn)為：可能有助于相鄰基因的表達(dá)；也可能與細(xì)菌基因組局部區(qū)域的組織有關(guān)；或認(rèn)為位于基因3‘末端的ERIC可防止外切核酸酶對(duì)基因3’末端的降解。rep-PCR-ERIC序列功能現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期日

依據(jù)ERIC重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，可產(chǎn)生DNA指紋圖譜。在一定范圍內(nèi)，DNA遷延帶的大小和多少代表著此重復(fù)序列間的距離和重復(fù)次數(shù)，因此，基因