新型鴨病毒性肝炎病毒第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五1.1DHV的歷史與分布

鴨肝炎病毒(DHV)包括三個血清型，分別引起Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎。其中Ⅰ型鴨病毒性肝炎呈世界性分布。我國流行的鴨病毒性肝炎主要為Ⅰ型鴨病毒性肝炎，近年來陸續(xù)有新型鴨病毒性肝炎發(fā)現(xiàn)三個型之間無抗原相關性，沒有交叉保護和交叉中和作用。DHV最早發(fā)現(xiàn)是在1945年由Levine在美國發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型鴨病毒性肝炎。該病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法國、日本、美國和埃及等地流行、在我國廣東、北京、浙江、福建、四川、安徽、廣西、江蘇、山東等地相繼發(fā)生該病、目前幾乎世界范圍內主要養(yǎng)鴨地區(qū)均存在該病，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

Ⅱ型鴨病毒性肝炎是1958年首先爆發(fā)于英格蘭諾?？锁唸觯渌貐^(qū)未見本病的報道。Ⅲ型鴨病毒性肝炎是1969年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島地區(qū)。1999年，蘇敬良等和黃安國等在北京和廣西等地在3～13日齡疑似鴨肝炎的北京鴨和櫻桃谷鴨上分離到兩株與I型和III型DHV無血清學交叉免疫反應的DHV，認為出現(xiàn)了新的血清型，并將其命名為新型鴨肝炎病毒。新型鴨病毒性肝炎的基因組與I型結構相似，但比I型DHV基因組稍大。同時，發(fā)現(xiàn)高變區(qū)主要存在于VP1和VP3基因、在VP1,VP3基因上存在多個T細胞抗原表位和B細胞抗原表位，VP1基因的變異致使不同血清型DHV抗原性發(fā)生改變。第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五1.2DHV的生物學特征

2006年KimMC報道了I型DHV的全基因組序列，2007年TsengCH報道了DHV-1型變異株全基因組序列，為DHV的研究做出了新的突破。DHV與其他小RNA病毒相比，DHV基因組具有一些特殊的結構特征,TsengCH等建議將I型DHV歸為小RNA病毒科一個新的獨立的屬。T.Yun等構建出了具有感染性的DHV全長cDNA克隆，為進一步揭示DHV基因組的結構和功能及防控該病提供了良好的技術平臺。I型DHV基因組大小約為7,690nt,編碼2,249aa、具有一個較大的開放閱讀框(ORF)，在基因組RNA兩端各有一段保守的非編碼區(qū),I型DHV全基因組結構依次為:5'UTR(626nt)-VPO-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3'UTR(314nt),5'UTR內含有病毒翻譯起始所必需的內部核糖體進入位點(IRES)第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

I型DHV的IRES己報道具有8個莖環(huán)結構，3’UTR內含有病毒RNA復制和翻譯有關的poly(A)尾。I型DHV的3’UTR為314nt，新型DHV的3’UTR為366nt，均具有典型的小RNA病毒的基因組結構、,I型DHV多聚蛋白具有11個切割位點，且具有與小RNA病毒相似的切割位點和保守基因序列?；蚪M編碼區(qū)包含結構蛋白和非結構蛋白，分為3種初級前體分子P1,P2,P3,其中，P1前體蛋白裂解為組成病毒衣殼蛋白VP0,VP3和VP1，3種結構蛋白。P2和P3構成病毒的非結構蛋白。P2編碼2A1,2A2,2A3,2B和2C3種非結構蛋白，P3編碼3A,3B,3C和3D4種非結構蛋白。第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.1非編碼區(qū)

I型DHV基因組5‘UTR長626nt,內含病毒翻譯起始所必需的內部核糖體進入位點(IRES)。在各病毒屬不同血清型之間，小RNA病毒IRES元件的序列和二級結構具有保守性，是病毒存活所必需的。小RNA病毒的IRES分為3個型，I型IRES的病毒包括腸道病毒屬和鼻病毒屬，心臟病毒屬、口瘡病毒屬，雙?？虏《緦俚腎RES屬于II型IRES;甲肝病毒屬的IRES屬于III型IRES。通過對I型DHV的RNA級結構預測表明，I型DHV的5’UTR可能含有II型IRES的頸環(huán)結構而沒有I型的三葉草結構，第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

據(jù)此推斷I型DHV的5’UTR區(qū)域會形成II型的IRESI型DHV的3’UTR長為314-317nt，新型DHV長366nt，這在小RNA病毒基因組中是最長的。有學者報道,I型DHV的3’UTR形成了5個發(fā)夾結構，參與病毒的復制，但它是否與宿主特異性有關還需進一步研究。病毒的3’端poly(A)尾作為病毒RNA的負鏈合成起始位點，其長度與負鏈RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有關。第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.2編碼區(qū)DHV包含一個大的ORF，編碼一個多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，從而分解成P1、P2和P3產(chǎn)物，P1、P2和P3又進一步分別分解為VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D、I型DHV的多聚蛋白的切割位點預測的結果是:VP0/VP3和3C/3D的切割位點為：Q/G;2A3/2B,2B/2C,2C/3A,3A/3B以及3B/3C的切割位點為Q/S；VP3/VP1的切割位點為Q/M。多聚蛋白水解產(chǎn)生的多膚數(shù)量主要由以下因素決定:(1)基因組是否存在L蛋白。(2)VP0是否水解為VP4和VP2。(3)2A蛋白的數(shù)量。其也是小RNA病毒的基因組在不同的種屬之間存在的差異所在。第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

小RNA病毒的基因組在不同的種屬間雖然存在差異，但是在病毒復制過程中具有相似的功能、,L蛋白作為前導蛋白;2A是蛋白酶，參與多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成關閉;2B蛋白作為宿主范圍的決定因子;2C蛋白是小RNA病毒中的保守序列，與病毒RNA合成相關;3A蛋白與病毒毒力有關;3B蛋白即VPg，是共價結合于正鏈和負鏈RNA5’末端的蛋白引物;3C蛋白構成大部分多聚蛋白，3C蛋白在病毒加工處理過程和RNA復制中產(chǎn)生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一個半胱氨酸作為親核作用的活性位點.3D蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶。第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.2.1結構蛋白:

P1區(qū)編碼病毒的殼體蛋白，包括VP0,VP3,VP1基因，核苷酸序列全長2193nt、I型DHVVP0的N末端缺少GxxxS/T基因序列，因此其N末端可能未被十四烷基化，VP0不被蛋白酶切割為VP2和VP4。試驗證明，殼體蛋白含有多個類似于其他小RNA病毒的核心結構，即八鏈反向平行β桶結構，與其相連的環(huán)形結構位于殼粒表面，這在免疫學中占有重要作用。I型DHV的VP3與人腸道病毒(Humanparechovirus,HPeV)一樣，N一末端有一段殘基豐富區(qū)延伸出來，長度約20aa,這段區(qū)域在HPeV中具有很強的免疫原性但它在I型DHV是否也具有同樣的功能還未見報道。第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五(1)VPl基因:

小RNA病毒中VP1蛋白作為主要的宿主保護蛋白，具有特異性抗原中和位點，VP1蛋白多暴露于病毒表面，是決定病毒抗原性的主要成分，它能夠誘導動物產(chǎn)生中和抗體。I型DHV與其他小RNA病毒之間衣殼蛋白的氨基酸序列差異主要存在于VP1的兩端。何內婭通過對華南地區(qū)分離到的I型和新型DHV的VP1氨基酸序列比對分析表明:VP1包括了大部分的插入與缺失片段和高變異區(qū)，高變區(qū)主要分布在46-64,95-149,180-223位，尤其是C末端，存在點突變或連續(xù)變異。在第145-146位，15株新型DHV毒株比3株I型DHV多2個氨基酸(G和G)。I型DHV和新型DHV的VP1蛋白不存在小RNA病毒科保守的RGD基序((Arg-Gly-Asp(RGD)),而I型DHV相應序列為SGD，而新型DHV為QSD，這表明DHV的病毒吸機制和復制能力存在差異還有待于進一研究。第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五(2)VP3基因:

VP3蛋白的N末端具有免疫原性，VP3的N端以及連接β鏈的環(huán)，特別是βB-C,βE-F及βG-H環(huán)的序列差異顯著、何內婭通過對華南地區(qū)分離到的I型和新型DHV與參考毒株進行VP3基因的變異分析，結果顯示，I型DHV和新型DHV的VP3基因不同點在于:第三位I型(R)→新型(K)，第15位I型(N)→新型(S)(除了臺灣新型)，第20位I型(P)→新型(S)，第22位I型(V)→新型(I)，第39,40位I型(IA)→新型(VT)，第45、69位I型(T,I)→新型(A/V,V)，第78位～第107位為I型和新型DHV變異最多處，第125,126位I型(MT)→新型(LL)，第143到第234位I型和新型DHV存在不連續(xù)的多位點不同，這些變異區(qū)是否影響I型和新型DHV的致病機理有待于進一步研究。第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.2.2非結構蛋白:

(1)P2非結構蛋白:小RNA病毒中，P2區(qū)長2271nt,I型DHV推測具有多達3種不同的2A蛋白，分別是2A1,2A2和2A3以及2B,2C。DHV的2A2蛋白是小RNA病毒多聚蛋白中的1個新蛋白，由161aa組成，可能參與病毒與宿主細胞之間相互作用，推測與病毒復制有關。2A3蛋白由124aa組成，含有3個結構域。2A3蛋白可能在控制細胞生長方面起作用，目前關于小RNA病毒2B和2C蛋白的具體功能還不清楚。第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五(2)P3非結構蛋白:

P3區(qū)編碼4種非結構蛋白，分別是3A,3B,3C和3D。據(jù)報道，小RNA病毒科的病毒,3A蛋白與病毒毒力有關。3BVPg蛋白包含34個as，這在小RNA病毒中是最大的3B蛋白，并且與其他小RNA病毒的3B蛋白序列一致性很低，DHV的L(亮氨酸)被小RNA病毒KP基序中的K(賴氨酸)所取代，但是該蛋白第3位酪氨酸Tyr(Y)殘基卻很保守，它在VPg與基因組5’末端尿嘧啶的附著過程中起重要作用。DHV的3C蛋白酶是催化裂解小RNA病毒多聚蛋白中非結構蛋白部分的關鍵酶，具有絲氨酸蛋白酶和半膚氨酸蛋白酶雙重特性，病毒編碼的3C蛋白酶完成多聚蛋白的大多數(shù)切割，通常發(fā)生在谷氨酞胺和甘氨酸之間的膚鍵(Gln-Gly),最終產(chǎn)生11個終末產(chǎn)物。DHV的3D蛋白是依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase),3D蛋白在病毒RNA復制中起主導轉錄及復制作用。第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.新型鴨病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR檢測方法的建立及應用

近年來，DVH在世界各地不斷發(fā)生，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，養(yǎng)鴨比較集中的地區(qū)均遭受了巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的威脅，由于新型鴨病毒性肝炎病毒(N-DHV)的存在，許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)I型鴨病毒性肝炎病毒(DHV-I)免疫鴨群暴發(fā)鴨肝炎的報道，嚴重制約了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，不少學者己從發(fā)病鴨群中分離到工型鴨肝炎病毒的變異株(新型毒株,N-DHV),2007年，有學者先后證實新型DHV也具有典型的DHVI基因組結構，但其與DHV-I在序列上存在顯著差異，且新型DHV均不與DHV-I產(chǎn)生交叉反應。因此，加強N-DHV病原診斷技術的研究對預防和控制鴨病毒性肝炎具有重要的現(xiàn)實意義。本試驗選取新型DHV與傳統(tǒng)工型DHV差異序列區(qū)設計引物，建立了N-DHV檢測的逆轉錄巢式PCR方法，旨在為新型鴨病毒性肝炎的早期診斷、流行病學調查等提供一種有效的分子生物學檢測方法。第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.1材料和方法2.1.1病毒

N-DHV、DHV-Ⅰ、鴨病毒性腸炎病毒(DEV)、鴨細小病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)均由本實驗室分離并保存。2.1.2主要試劑

Trizol、M-MLV反轉錄酶、RibonucleaseInhibitor購自生工生物工程(上海)有限公司;ExTaq酶、pMD18-T克隆載體及其他限制性內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;質粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.1.3引物的設計與合成

根據(jù)己發(fā)表的N-DHV基因組序列，選取N-DHV與DHV-I差異序列區(qū)設計引物，利用生物學軟件設計合成了2對引物，引物序列如下:第1輪擴增引物:上游引物:ygpl5'-TUTUCCTUAUAAUCUUUATA-3';下游引物:ygp25'-CCUAAAUTUUAUATTAUUTG3‘;第2輪擴增引物:上游引物:ygp35'-CAUCCACAUCCAUCUACAACr3';下游引物:ygp45'-TTUCTCTUCUUTATCCTUCC-3'。2.1.4病毒基因組RNA的提取

按Trizol試劑使用說明提取N-DHV基因組RNA，并提取其他幾種病毒的DNA或RNA。第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.1.5RT-PCR反應2.1.5.1反轉錄合成cDNA反轉錄反應按20μL,體系操作，反轉錄條件為42℃作用60min后，95℃5min滅活反應。2.1.5.2PCR反應最適模板用量的確立分別以2,4,6,8,10,12μL反轉錄cDNA為模板，保持其他試劑濃度及反應條件不變，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳模板用量。2.1.5.3PCR反應最適引物用量的確立在50μLPCR反應體系中分別加入不同用量的引物，上下游引物(20mol/L)分別入0.1,0.3,0.5,0.7,1,1.2μL對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物用量。第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.1.5.4PCR反應最適退火溫度的確立PCR反應的退火溫度分別取50,52,54,56,58℃，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。2.1.5.5第1輪PLR擴增反應PCR反應按50μL體系進行，根據(jù)本試驗確定的最適模板用量為10μL，最適引物用量為0.5μL，最適退火溫度為54℃，確定PCR反應體系為:0.5μLExTaq(5U/μL)、5μL10XExTaqBuffer5μLdNTP(2.5mmol/L）、上下游引物ygp1、ygp2（20mo1/L)各0.5、10μLcDNA，加水至50μL。PCR反應條件為:94℃4min;94℃45s、54℃45s、，72℃60s、30個循環(huán);72℃10min。第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.1.5.6第2輪PCR擴增反應

PCR反應按50μL，體系進行，模板為第1輪PCR產(chǎn)物1μL，最適引物用量為0.5μL，最適退火溫度為54℃，確定PCR反應體系為:0.5μLExTaq(5U/pL)、5μL10XExTaqBuffer5μLdNTP(2.5mmol/L)、上下游引物ygp3、ygp4(20mol/L)各0.5μL，加水至50μL。PCR反應條件同2.1.5.5第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.6擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴增產(chǎn)物5μL在10g/L二的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于4℃過夜連接，轉化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個的轉化菌落，加LB溶液培養(yǎng)12h后用質粒提取試劑盒抽提質粒DNA，利用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，陽性的克隆送生工公司進行測序鑒定。將測序結果與N-DHV毒株序列進行同源性比較。2.7PCR特異性試驗分別提取N-DHV、DHV-Ⅰ,NDV,IBDV、健康鴨肝組織的RNA,DEV、DPV的DNA，用己建立的方法進行擴增。第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.8PCR敏感性試驗

N-DHV標準毒株提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當于含有10、1、0.1μL、10、1、0.1、0.01pgRNA的含量，分別進行RT-PCR檢測，確定其敏感性。在第2輪PCR中，利用上而不同的病毒RNA濃度進行的RT-PLR產(chǎn)物1μL為模板，進行巢式PCR檢測，反應程序不變，確定巢式PCR的敏感性。2.9PCR重復性試驗

用建立的巢式RT-PCR檢測方法，對N-DHV、DHV-I、NDV、IBDV、DEV、DPV、健康鴨肝組織及檢測為新型鴨病毒性肝炎陽性病料3份和陰性病料3份，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩(wěn)定性。第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.10初步應用—臨床樣品檢測取疑似送檢病料21份，利用建立的RT-PCR檢測方法進行檢測，對擴增產(chǎn)物全部進行測序鑒定，并利用生物學軟件進行序列分析。第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五3.實驗結果3.1擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定3.1.1擴增產(chǎn)物的檢測PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過10g/L二瓊脂糖凝膠電泳，第1,2輪擴增產(chǎn)物在位于706、502bp處可見特異性DNA擴增條帶，與預期大小相符。

M：DL2000DNAMarkcr1、4：是2對引物的空白對照2：第1輪擴增的PCR產(chǎn)物3：第2輪擴增的PCR產(chǎn)物第24頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五3.1.2克隆載體的酶切鑒定擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，根據(jù)病毒基因組的序列結構，利用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定。M：DL200CDNAMarkcr1,2：第1,2輪擴增產(chǎn)物重組質粒的EcoRⅠ和HindⅢ的雙酶切產(chǎn)物第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五3.1.3擴增產(chǎn)物的測序鑒定

挑取雙酶切鑒定正確的陽性菌液送生工公司測序。DNA測序結果表明，插入到T載體的基因片段的核普酸序列為N-DHV。3.2特異性試驗結果

利用設計的第1輪引物對N-DHV擴增出了706bp的目的基因片段，而DHV-Ⅰ、NDV,IBDV、健康鴨肝組織、DEV,DPV均未擴增出目的片段(圖3)。取PCR產(chǎn)物各1μL為模板，利用第2輪引物進行巢式PCR檢測，結果N-DHV出現(xiàn)502bp的擴增產(chǎn)物，而DHV-Ⅰ、NDV、IBDV、健康鴨肝組織、DEV}DPV均未擴增出目的片段(圖4)。第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五第1輪擴增的特異性試驗M：DL2000DNAMarKer1:N-DHV2:DHV-Ⅰ3:NDV4:IBDV5:健康鴨的肝組織6.DEV7.DPV（圖3）第2輪擴增的特異性試驗M.:DL2000DNAMarker1:N-DHV;2:DHV-Ⅰ;3:NDV4:IBDV5.健康鴨肝組織6.DEV7.DPV（圖4）第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五3.3敏感性試驗結果

2種引物敏感性試驗的PCR產(chǎn)物取5μL經(jīng)10g/L二瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約706,502bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與各自的預期產(chǎn)物大小相符。從結果可以看出第1輪引物的RT-PCR檢測靈敏度可以達到10pgRNA，而第2輪引物的RT-PCR檢測靈敏度可以達到0.1p}RNA。第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五第1輪擴增的敏感性試驗M：DL2000DNAMarKer1~7：10、1,0.1μL、10、1、0.1、0.01pgRNA第2輪擴增的敏感性試驗M：DL2000DNAMarKer1~7：10、1,0.1μL、10、1、0.1、0.01pgRNA第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五3.4重復性試驗結果經(jīng)過3次重復操作，結果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定可靠的。3.5臨床樣品檢測結果用建立的N-DHV巢式RT-PCR檢測方法，共檢測了21份在不同地采集的鴨病料。檢出陽性樣品3份，對陽性樣品PCR產(chǎn)物全部進行克隆與序列分析，結果均為N-DHV。第30頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五4.討論

由于N-DHV在自然條件下感染成年鴨后，感染者可長期帶毒和排毒而不出現(xiàn)臨床癥狀，在這些情況下，病鴨組織中病毒含量較低，而且組織樣品中因含有大量的蛋白和脂類等可能會影響PCR擴增，將反轉錄產(chǎn)物直接用于PCR擴增很難見到擴增片段。巢氏PCR(nestedPCR)是PCR的一種改良模式，是指利用2對PLR引物進行2輪PCR擴增反應。首先對靶DNA進行第1步擴增，然后從第1次反應產(chǎn)物中取出少量作為反應模板進行第2次擴增，第2次PCR引物與第1次反應產(chǎn)物的序列互補，第2次PCR擴增的產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物。第31頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

由于巢式PCR反應有2次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性，增加了檢測的敏感性;又有2對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。巢式RT-PCR技術通過反轉錄產(chǎn)物的PCR和巢式PCR的2次擴增，首次反應產(chǎn)物的轉移有助于稀釋掉那些最初可能存在于樣品中的抑制物，大大提高了檢測的靈敏度，避免了樣品檢測過程中的假