本文格式為Word版，下載可任意編輯——綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用

楊軍廷202341804054華大基因

摘要來(lái)源于水母(AequoreaVictoria)的綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP),現(xiàn)已

成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一。其內(nèi)源性熒光基團(tuán)在受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可發(fā)現(xiàn)明了可見(jiàn)的綠光。由于檢測(cè)便利,對(duì)生物體基本沒(méi)有毒性,在好多領(lǐng)域已有取代LacZ,熒光素酶等傳統(tǒng)標(biāo)記方法的趨勢(shì),在制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過(guò)程中更是如此。本文綜述了GFP在標(biāo)記目的基因、篩選陽(yáng)性胚胎等方面的應(yīng)用

關(guān)鍵詞綠色熒光蛋白；轉(zhuǎn)基因

在研究基因的表達(dá)或蛋白質(zhì)的定位與時(shí)序變化時(shí)常用熒光物質(zhì)或報(bào)告基因作為標(biāo)記。傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記是通過(guò)純化蛋白質(zhì)再共價(jià)結(jié)合到熒光染料上!此方法難以控制化學(xué)劑量和染料附著部位!若該標(biāo)記蛋白用于活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)!則難以通過(guò)細(xì)胞膜。因此，該方法已基本淘汰現(xiàn)在常用的報(bào)告基因如熒光素酶（LUX）基因和β-葡萄糖苷酶（GUS）基因也不盡人意。LUX所檢測(cè)到的熒光產(chǎn)生部位不一定反映熒光素酶基因的特異表達(dá)部位；GUS則需要昂貴的反應(yīng)底物且由于其它因素的干擾。反應(yīng)顏色的深淺有時(shí)不能說(shuō)明GUS活性的高低或有無(wú).源于水母等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的綠色熒光蛋白(GFP)可吸收藍(lán)光而后發(fā)出綠光是生物發(fā)光現(xiàn)象中能量傳遞的受體之一。它戰(zhàn)勝了上述缺陷，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，不需要添加任何底物或輔助因子，不使用同位素，也不需要測(cè)定酶的活性等優(yōu)點(diǎn)。已成為目前最優(yōu)良的標(biāo)記基因之一。

1GFP的生化性質(zhì)及其發(fā)光原理

1.1GFP的發(fā)光特性

GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個(gè)峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相像,因此為熒光素FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀測(cè)。盡管450～490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰,但由于長(zhǎng)波能量低,細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測(cè).1.2GFP的性質(zhì)特點(diǎn)

GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng),特別在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便馬上得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光.中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定,脫水劑戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析。但由于GFP不是酶,熒光信號(hào)沒(méi)有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無(wú)法比較的。1.3GFP的發(fā)光原理

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GFP之所以能產(chǎn)生綠色熒光是由于其蛋白分子多肽鏈內(nèi)含有特別的生色基團(tuán)結(jié)構(gòu)。即第65-67位氨基酸Ser-Tyr-Gly鏈內(nèi)環(huán)化加氧形成對(duì)羥苯甲基咪唑環(huán)酮和周邊其它3個(gè)氨基酸形成六肽生色團(tuán)。但上述3個(gè)氨基酸殘基是如何控制光譜的特征目前還不十明顯了。體外試驗(yàn)時(shí)，當(dāng)Ca2﹢與來(lái)自水母的發(fā)光蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，便可以觀測(cè)到一種藍(lán)光。這種分子內(nèi)的反應(yīng)受一種在結(jié)合了Ca2﹢后轉(zhuǎn)化為熒光素酶蛋白質(zhì)的催化，產(chǎn)生CO2和藍(lán)色熒光蛋白（BFP）在反應(yīng)中也是一種發(fā)光體!假使在反應(yīng)體系中參與GFP即可以觀測(cè)到綠光!這一體外模擬試驗(yàn)與水母自然的發(fā)光現(xiàn)象一致?？偟倪^(guò)程可用下式表示

1.4GFP作為標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)

1．4.1體積小只有LacZ的1/5，表達(dá)無(wú)種屬限制，這是它能廣泛應(yīng)用的重要基礎(chǔ)之一。一系列與GFP的N-端、C-端融合的蛋白質(zhì)的性質(zhì)研究已證明：融合蛋白質(zhì)同時(shí)具有GFP的熒光特性和結(jié)合蛋白質(zhì)的功能。

1.4.2熒光表達(dá)穩(wěn)定即使是在甲醛或戊二醛固定的標(biāo)本中，GFP的熒光仍能保持穩(wěn)定但固定過(guò)程中使用了酸或過(guò)量的有機(jī)溶劑，則會(huì)破壞熒光。在各種制備切片的方法中，冰凍切片是效果最好的。標(biāo)本可在﹣70℃保存6周以上而熒光不受影響

1.4.3有多種突變體不僅可與其它標(biāo)記物，也可用不同突變體同時(shí)進(jìn)行多種標(biāo)記。1.4.4檢測(cè)便利常用熒光顯微鏡，激光掃描共聚

焦顯微鏡（Iascer-scanningconfocalmicroscope，ISCM）觀測(cè)。若在體表等簡(jiǎn)單觀測(cè)的部位且熒光夠強(qiáng)，則可直接用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈照射（如手提式長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈）后觀測(cè)?？捎^測(cè)熒光的儀器越來(lái)越多。1.4.5無(wú)放大作用因而，好多狀況下需要強(qiáng)啟動(dòng)子。這使536在研究一些弱啟動(dòng)子功能時(shí)受到限制。隨著檢測(cè)手段的不斷改進(jìn)，這一限制已被逐漸縮小。

正是由于以上這些特性，使536在問(wèn)世后不久，便被廣大科研工廣泛應(yīng)用。2

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用

2.1基因打靶和胚胎干細(xì)胞技術(shù)

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基因打靶和胚胎干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)為小鼠基因組操作引進(jìn)了新的方法。胚胎干細(xì)胞是來(lái)源于后胚泡期胚胎的多能干細(xì)胞系，經(jīng)體外繁殖和處理后可再導(dǎo)入胚胎。自人們從胚胎干細(xì)胞克隆出小鼠生殖細(xì)胞，并證明將親本的基因組傳遞給后代后，胚胎干細(xì)胞就成為常用的工具?，F(xiàn)在，只要在體外進(jìn)行基因打靶和轉(zhuǎn)基因操作，就可通過(guò)生殖細(xì)胞將親本的基因組傳遞給后代。

在胚胎干細(xì)胞中可進(jìn)行兩種基因組改造：定向改造和非定向改造。定向改造就是預(yù)先確定并確切設(shè)計(jì)所要做的改變，基因打靶就是定向改造。非定向改造是隨機(jī)的，包括轉(zhuǎn)基因和突變。研究中，這兩種方式可混合使用以達(dá)到不同的目的。同源重組和點(diǎn)特異重組可對(duì)基因組進(jìn)行任何想要的改變?？赏ㄟ^(guò)多種方式進(jìn)行隨機(jī)突變，利用外源基因陷阱載體可在基因組中隨機(jī)定位，從而“劫持〞基因表達(dá)并破壞基因功能。胚胎干細(xì)胞的另一種應(yīng)用是轉(zhuǎn)基因，它與經(jīng)典的原核注射類似。在體外，將載體自身的驅(qū)動(dòng)目的基因（尋常為報(bào)告基因）的啟動(dòng)子整合入基因組，然后導(dǎo)入體內(nèi)。因此，任何改造都能夠?qū)肱咛ジ杉?xì)胞，隨后通過(guò)生殖細(xì)胞傳遞給后代，這樣就可以建立小鼠突變品系或嵌合體，從而進(jìn)行原位研究了。由于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系能在體外增殖，所以與DNA注射相比，用ES細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)在于，可在動(dòng)物模型體外使用試劑進(jìn)行研究。

2.2標(biāo)記基因

直接檢測(cè)外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)和分布往往是困難的。因此，在制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，一般在目的基因旁邊加上一段表達(dá)產(chǎn)物易于檢測(cè)的基因，即標(biāo)記基因。標(biāo)記基因的表達(dá)與分布提醒目的基因的表達(dá)與分布。LacZ，Iuc等都是廣泛使用的標(biāo)記基因，其產(chǎn)物能催化一定的底物生成有色產(chǎn)物或熒光。由于GFP發(fā)光時(shí)不需底物，能對(duì)活體檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的人傾向于用它代替?zhèn)鹘y(tǒng)的分子標(biāo)記物。GFP與蛋白融合時(shí)，既可融合于蛋白的N-端，也可融合與蛋白的C-端，甚至能讓蛋白插入到編碼區(qū)之間而保持熒光特性不變由于GFP體積較小，只有27KD，融合后常能保持蛋白的正常分布與功能。不同的是現(xiàn)在能發(fā)光了。發(fā)光的蛋白能給研究者有關(guān)基因時(shí)間、空間表達(dá)的有用信息。這方面成功的例子好多，被成功標(biāo)記的蛋白目前已超過(guò)100種.MorilzOL將視紫紅質(zhì)蛋白（rhodopsin，RHO）基因與GFP的cDNA融合制作轉(zhuǎn)基因爪蟾。根據(jù)熒光觀測(cè)了RHO表達(dá)隨時(shí)間變化的規(guī)律，并將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的RHO-GFP與自然RHO作了對(duì)比：RHO-GFP能正確地定位，雖然被磷酸化的速度減慢，但對(duì)其行使光傳導(dǎo)功能影響很小。磷酸化速度減慢的原因是GFP的占位。由于27KD雖然不大，但仍會(huì)影響某些蛋白的折疊。尋覓分子量更小的GFP突變體，是今后GFP研究的一個(gè)重要目標(biāo)。GFP也可直接接在啟動(dòng)子后，觀測(cè)該啟動(dòng)子的表達(dá)、分布狀況或特異性標(biāo)記某種細(xì)胞、組織或器官。這是GFP在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中應(yīng)用最早、最多的一個(gè)方面。Chiocchclli等在血紅素結(jié)合蛋白（hcmopcxin，HPX）啟動(dòng)子和β1結(jié)合素啟動(dòng)子之后加上GFP或LacZ報(bào)告基因（共4個(gè)質(zhì)粒），制作轉(zhuǎn)基因小鼠。其中，HPX啟動(dòng)子能指導(dǎo)下游基因在肝臟強(qiáng)表達(dá)和部分腦區(qū)弱表達(dá)，而β1結(jié)合素啟動(dòng)子能指導(dǎo)下游基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中全身表達(dá)。比較了這9個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)狀況。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：用GFP作報(bào)告基因，不僅檢測(cè)便利，而且不管是強(qiáng)表達(dá)還是弱表達(dá)，全身表達(dá)還是區(qū)域表達(dá)，都與啟動(dòng)子指導(dǎo)的自然蛋白的原位雜交結(jié)果更加一致。

2.3篩選陽(yáng)性胚胎

制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)很大的問(wèn)題便是陽(yáng)性率低。從大量的動(dòng)物中篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物，是一個(gè)耗時(shí)耗力的過(guò)程。若在胚胎移入假孕母體以前就能用可靠的方法篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性胚胎，棄去基因未整合或表達(dá)不好的胚胎，將大大降低出生后動(dòng)物個(gè)體篩選的工作量，并降低成本。在桑葚胚或胚泡階段用活組織檢查結(jié)合PCR或

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RT-PCR的方法需要繁雜的顯微操作技術(shù)，并可能損傷胚胎，耗時(shí)較長(zhǎng)，并可能有假陽(yáng)性或假陰性。Thompsom等用熒光素酶作標(biāo)記基因，在移植前檢測(cè)。這種方法需要在培養(yǎng)基中參與一些輔助因子，檢測(cè)過(guò)程較繁雜；Takada等將EDFP的cDNA置于EF1α啟動(dòng)子和CMV加強(qiáng)子之下，注入小鼠和牛的受精卵內(nèi)，在體外培育至桑葚胚階段或胚泡階段。此時(shí)，GFP表達(dá)，用CLSM可檢測(cè)出熒光。用能表達(dá)熒光的胚胎作移植，出生后的小鼠發(fā)育正常，能表達(dá)外源基因（GFP）。牛的胚胎移植后未能成活。這種方法對(duì)胚胎沒(méi)有損傷，檢測(cè)便利。雖然此次試驗(yàn)只注射了標(biāo)記基因，但從試驗(yàn)過(guò)程來(lái)看，參與外源基因是沒(méi)有技術(shù)困難的。此試驗(yàn)還證明白每天用,405mm的紫外照射胚胎，并不影響植入和發(fā)育。GFP不僅可與外源基因構(gòu)成雙順?lè)醋樱部蓡为?dú)與外源基因共注射。以摩爾比1:1共注射后，80%的轉(zhuǎn)基因鼠同時(shí)攜有兩種基因，20%的轉(zhuǎn)基因小鼠只攜有其中一種基因。對(duì)于大動(dòng)物來(lái)講，由于受精卵來(lái)源有限，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，費(fèi)用高等限制，用此法有更大的優(yōu)越性。不僅在制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，而且用于F0代之后擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因群體。由于對(duì)大動(dòng)物來(lái)講，傳代也是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程。但假使能將雄性found動(dòng)物的生殖細(xì)胞取出，于雌性野生動(dòng)物的卵子在體外受精并培養(yǎng)，并在植入前用GFP篩選，也將大大縮短擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群體的時(shí)間。在某些全身透明的魚(yú)類，用能在生殖細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子與GFP融合后，可便利地根據(jù)熒光標(biāo)記篩選出有生殖系整合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

3問(wèn)題和展望

從1994年Chalfie等首次在果蠅、大腸桿菌等生物體內(nèi)成功表達(dá)GFP基因到現(xiàn)在已有十幾年的歷史，越來(lái)越多的研究人員將其作為又一快速高效的研究工具。雖然GFP在分子生物學(xué)的眾多研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，GFP本身也將不斷地被改進(jìn)及優(yōu)化，GFP的應(yīng)用在技術(shù)上將出現(xiàn)更多的創(chuàng)新，其應(yīng)用范圍將會(huì)越來(lái)越開(kāi)闊。但在研究中依舊存在著一系列的問(wèn)題，包括：①檢測(cè)靈敏度還有待提高，而且其熒光信號(hào)強(qiáng)度方面的非線性性質(zhì)使得定量十分困難也有待于進(jìn)一步研究。②新生GFP通過(guò)折疊和加工成為具有活性的形式其過(guò)程十分緩慢。⑧紫外激發(fā)對(duì)某些GFP有光漂白和光破壞作用，會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)快速喪失。④多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象，并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，這些熒光背景會(huì)影響某些GFP的檢測(cè)。

目前為止．大約有幾十種不同特性的熒光蛋白可供選擇使用，這些蛋白質(zhì)的熒光光譜幾乎覆蓋了整個(gè)可見(jiàn)區(qū)9。一個(gè)好的