雙水相萃取的原理及應用第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四組員:NF-κB信號通路劉文榮王嘉犀范倩何亞玲第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四英英釋義內(nèi)容Content1、雙水相萃取的歷史2.雙水相萃取的基本原理3.雙水相萃取的特點4.雙水相萃取的應用第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：Beijerinck（？？-）早在1896年,Beijerinck發(fā)現(xiàn),當明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時,得到一個混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉),這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueoustwophasesystem,ATPS)。第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：1956年瑞典lund大學的Albertsson教授及其同事開始對雙水相系統(tǒng)進行比較系統(tǒng)研究。測定了許多雙水相系統(tǒng)的相圖，為雙水相萃取系統(tǒng)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。只局限于實驗室內(nèi)的測定和理論研究。第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：Kula教授研究小組對雙水相的應用、工藝流程、操作參數(shù)、工程設(shè)備、成本分析等進行了大量研究，在應用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術(shù)用于酶的大規(guī)模分離純化。第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：雙水相萃取可分離多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器、細胞組織，以及重金屬離子等，近年來，還應用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應系統(tǒng)用于酶反應，生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵的產(chǎn)物生產(chǎn)與分離的集成。第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理

萃?。豪梦镔|(zhì)在兩種互不混溶的溶劑中的分配差異進行分離的技術(shù)。

有機溶劑萃?。阂耘c水互不相溶的有機溶劑作萃取劑從水相中萃取目的產(chǎn)物，廣泛應用于抗生素、有機酸、維生素等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)。用于蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物大分子的分離很少成功。

反萃取：使用水溶液從有機溶劑中萃取水溶性的物質(zhì)。第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理反膠團萃取：利用表面活性劑在有機相中形成的反膠團（reversedmicelles），從而在有機相內(nèi)形成分散的親水微環(huán)境。第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理反膠團萃?。菏股锓肿釉谟袡C相（萃取相）內(nèi)存在于反膠團的親水微環(huán)境中，消除了生物分子，特別是蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)難于溶解在有機相中或在有機相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。

超臨界萃取：第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理以上方法對蛋白質(zhì)的分離純化有不同的缺陷。第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理到目前為止，雙水相技術(shù)幾乎在所有的生物物質(zhì)如:氨基酸、多肽、核酸、細胞器、細胞膜、各類細胞、病毒等的分離純化中得到應用,特別是成功地應用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理當萃取體系的性質(zhì)不同時,物質(zhì)進入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四常用的雙水相體系:ATPE的基本原理高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG)/葡聚糖(簡稱Dextran)高聚物/無機鹽體系：硫酸鹽體系。常見的高聚物/無機鹽體系為:PEG/硫酸鹽或磷酸鹽體系。第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四常用的雙水相體系:ATPE的基本原理PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四常用的雙水相體系:ATPE的基本原理PEG/Dx體系一般用于小規(guī)模地分離生物大分子、膜、細胞等，PEG/無機鹽體系主要用來大規(guī)模地提純酶，這是因為PEG/無機鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價格昂貴的緣故。第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理類型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/非離子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基纖維素鈉聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/無機鹽聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨各種類型的雙水相體系第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四相圖:相平衡時物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系A(chǔ)TPE的基本原理第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四相圖:相平衡時物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系A(chǔ)TPE的基本原理雙節(jié)線(bi-nodal)：圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域為均相區(qū),以上的區(qū)域為兩相區(qū)，即ATPS。系線(tieline)：雙節(jié)線上連兩點的直線。K點：K點為臨界點，表示兩相差別消失。第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四相圖:相平衡時物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系A(chǔ)TPE的基本原理系線反映的信息

杠桿規(guī)則：系線上各點均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則

性質(zhì)差異：系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度,系線越長,兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理聚合物分子量的影響：

對于給定的相系統(tǒng)，如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替，被萃取的大分子物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸、細胞粒子等，將有利于在低分子量高聚物一側(cè)分配。第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理聚合物分子量的影響：

如以Dextran500(MW500000)代替Dextran40（MW40000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物質(zhì)如細胞色素C分配系數(shù)增加并不顯著。然而，被萃取的大分子量物質(zhì)，如過氧化氫酶的分配系數(shù)可增大到原來的6~7倍。第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理pH值的影響：改變兩相的電位差如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點相差越大，則蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。pH值的變化也會影響磷酸鹽的離解程度，導致組成體系的物質(zhì)電性發(fā)生變化，也會使被分離物質(zhì)的電荷發(fā)生改變，從而影響分配的進行。第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理離子環(huán)境對蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響:

在雙水相聚合物系統(tǒng)中，加入電解質(zhì)時，其陰陽離子在兩相間會有不同的分配。

同時，由于電中性的約束,存在一穿過相界面的電勢差(Donnan電勢),它是影響荷電大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等分配的主要因素。第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理例如，DNA萃取時，離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉(zhuǎn)移到另一相。第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理離子液體BmimPF6直接萃取DNA第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理基于離子液體BmimPF6的雙水相體系直接萃取牛血清蛋白。第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點ATPE的特點對生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的提取、純化方面的優(yōu)勢：

(1)含水量高(70％~90％)，在接近生理環(huán)境的體系中進行萃取，避免生物活性物質(zhì)失活或變性。

(2)可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)（或酶），可直接提取細胞內(nèi)酶，避免破碎或過濾等步驟。

第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點ATPE的基本原理

(3)分相時間短，自然分相時間一般為5min～15min。

(4)界面張力小(10-7～10-4mN／m)，利于兩相之間的質(zhì)量傳遞。(5)不存在有機溶劑殘留問題，高聚物不易揮發(fā)，對人體無害。

第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點ATPE的基本原理(6)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去。

(7)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無需進行特殊處理。

(8)操作條件溫和，在常溫常壓下進行。

(9)親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的選擇性。

第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點ATPE的基本原理雖然該技術(shù)在應用方面已經(jīng)取得了很大的進展，但幾乎都是建立在實驗的基礎(chǔ)上，到目前為止還沒能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統(tǒng)的形成機理以及生物分子在系統(tǒng)中的分配機理。

第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點ATPE的基本原理不足之處:如易乳化、成相聚合物的成本較高、分離效率不高等,

第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的基本原理雙水相系統(tǒng)平衡時間短，含水量高，界面張力低，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境。它還具備操作簡便、經(jīng)濟省時、易于放大。據(jù)報道，系統(tǒng)可從10ml直接放大到1m3規(guī)模（105倍）,而各種試驗參數(shù)均可按比例放大，產(chǎn)物收率并不降低。

第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的基本原理英英釋義1、蛋白質(zhì)、酶的純化2、多肽的分離純化3、核酸的分離純化4、其它分離純化第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的基本原理主要是分離蛋白質(zhì)，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的基本原理1)蛋白質(zhì)、酶的純化2)多肽的分離純化

第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的基本原理目前，用此法來提純的酶已達數(shù)十種，其分離過程也達到相當規(guī)模，I-HorngPan等人利用PEG1500/NaH2PO4體系從Trichodermakoningii發(fā)酵液中分離純化β-木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數(shù)33。

第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第一步：所選擇的條件應使蛋白質(zhì)產(chǎn)物分配在富PEG的上相中,而細胞碎片及雜質(zhì)蛋白質(zhì)等進入下相。第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第二步：分相后上相中再加入鹽使再次形成雙水相體系,核酸和多糖則分配入富鹽的下相,雜質(zhì)、蛋白質(zhì)也進入下相,而所需的蛋白質(zhì)再次進入富含PEG的上相。第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:第三步：向分相后的上相中加入鹽以再一次形成雙水相體系。在這一步中,要使得蛋白質(zhì)進入富鹽的下相,以與大量的PEG分開。蛋白質(zhì)與鹽及PEG的分離可以用超濾、層析、離心等技術(shù)。第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的應用雙水相萃取的應用第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的應用雙水相萃取的應用第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用3)核酸的分離純化

第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的應用4)病毒、細胞器、細胞的分離

第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四ATPE的應用4)病毒、細胞器、細胞的分離

第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用5）中草藥成分的提取

甘草、銀杏液、黃芩苷等的有效成分分離。

謝濤等利用PEG4000/K2HPO4組成的雙水相體系從三七中萃取三七皂苷,回收率為96%。

第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用5）中草藥成分的提取(1)將PEG和K2HPO4配成一定濃度的濃溶液;

(2)在常溫下,取三七濃縮液置于10ml的離心試管中,加入一定體積的成相物質(zhì)濃溶液,振蕩搖勻,在離心機中以一定轉(zhuǎn)速離心5min,使其分相;

第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用5）中草藥成分的提取(3)分別讀取上下相體積,并取樣分析上下相中三七總皂苷的含量。

第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用5）中草藥成分的提取

第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用5）中草藥成分的提取

第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用5）中草藥成分的提取

第54頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用6）雙水相萃取分析黃毒苷的免疫測定第55頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用7）稀有金屬/貴金屬分離克服溶劑萃取法的不足。在聚乙二醇2000/硫酸按/偶氮胂（shen四聲）(Ⅲ)雙水相體系中,實現(xiàn)了Ti(Ⅳ)與Zr（鋯gao）(Ⅳ)的分離

第56頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應用ATPE的應用7）稀有金屬/貴金屬分離

分別在60ml分液漏斗中加入不同pH值的緩沖溶液2ml,偶氮胂Ⅲ溶液0.