VIII致謝三年研究生學(xué)習(xí)生涯時(shí)光如白駒過隙，三年前第一次來工大參加研究生復(fù)試時(shí)看見路邊宣傳欄上寫著紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行的情景在我腦海閃過。三年的時(shí)間有苦有甜，有經(jīng)歷過無(wú)數(shù)次實(shí)驗(yàn)失敗的苦，也有最后實(shí)驗(yàn)成功的甜。在這過程中我明白了失敗是成功之母，只有不懈的努力才能獲得成功。也有和同窗好友一起奮斗的滿足，有的更是對(duì)這三年點(diǎn)點(diǎn)滴滴的不舍和感恩，在這畢業(yè)臨近的時(shí)刻，有太多不舍與感恩，不舍得與實(shí)驗(yàn)室小伙伴朝夕相處，一起為實(shí)驗(yàn)而奮斗的時(shí)光，同時(shí)感恩那些鼓勵(lì)我和幫助我的人，讓我始終保持樂觀向上的態(tài)度。首先，我要特別感謝我的導(dǎo)師xx老師，陳老師有淵博的專業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度，但在生活中卻是一個(gè)幽默風(fēng)趣、關(guān)心學(xué)生的好老師。每周開組會(huì)時(shí)，陳老師都會(huì)和我們分享他這一周的所見所感讓我們獲益頗深。陳老師的名言“要珍惜時(shí)間！”也深深印在我們的腦海里。在學(xué)校三年的研究時(shí)光，我的每一次進(jìn)步與成長(zhǎng)都得益于老師的悉心指導(dǎo)和培養(yǎng)，我的畢業(yè)論文也在老師的悉心教導(dǎo)下順利完成。同時(shí)，我也要感謝實(shí)驗(yàn)室的xxx老師、xx師姐和xxx、xx師兄，同學(xué)xxx、xxx和xxx、xx，以及師弟師妹們xxx、xxx、xx、xx、xxx、xxx和xx，他們?cè)谖矣龅嚼щy時(shí)給與我?guī)椭c支持，讓我們xx樓xxx實(shí)驗(yàn)室成為一個(gè)互幫互助的大家庭。感激我的室友們，我們?cè)谌陜?nèi)在這三年來一直理解和支持！感激全體xx與xxxx學(xué)院的老師，在我們?nèi)甑膶W(xué)習(xí)生涯中教會(huì)我們?cè)S多知識(shí)和道理。最后要感激我的家人們，他們是最愛我的人，也是我精神和生活上最堅(jiān)實(shí)的后盾！最后我要感激各位專家和學(xué)者撥冗審核修改我的碩士學(xué)位論文！2020年4月20日摘要合格的食用油中是不會(huì)含有辣椒堿，而地溝油大部分都是餐飲廢棄油，如果在烹飪過程中加入了辣味調(diào)料等物質(zhì)，尤其是牛油火鍋中，則油脂中一定會(huì)有辣椒堿物質(zhì)的存在。因?yàn)槔苯穳A的自身具備的一些特性例如親脂、穩(wěn)定和沸點(diǎn)高，這些特性決定了即使精煉地溝油也很難分離出辣椒堿，因此可以將辣椒堿作為鑒別食用油是否為地溝油的特異性指標(biāo)。因此，本文建立了三種不同的免疫側(cè)向?qū)游龇▉頇z測(cè)食用油中的辣椒堿：傳統(tǒng)型免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埵秤糜椭欣苯穳A檢測(cè)方法的建立本方法的原理在于毛細(xì)管側(cè)向?qū)游龊涂乖贵w免疫識(shí)別相結(jié)合，利用抗體可以通過靜電吸附與納米金粒子表面偶聯(lián)結(jié)合，NC膜上的C線上固定羊抗鼠二抗，T線上固定辣椒堿抗原，一般通過NC膜上T線和C線是否顯色來判斷食用油中辣椒堿的存在情況，同時(shí)與灰度掃描結(jié)果結(jié)合來對(duì)辣椒堿的含量進(jìn)行定量分析。在可行性研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化金納米粒子與抗體偶聯(lián)量、偶聯(lián)pH、重懸液、樣品墊處理液和上樣稀釋緩沖液，得出最佳實(shí)驗(yàn)方案，并檢測(cè)傳統(tǒng)型辣椒堿試紙條的特異性和靈敏度。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，可以在10min內(nèi)完成對(duì)辣椒堿含量的檢測(cè)。肉眼觀察試紙條的靈敏度為100μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)線性范圍為10-100μg/L。改良型免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埵秤糜椭欣苯穳A檢測(cè)方法的建立本方法是在傳統(tǒng)免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測(cè)的基礎(chǔ)上將金標(biāo)墊舍棄，將金標(biāo)偶聯(lián)產(chǎn)物滴入96孔板微孔中進(jìn)行冷凍干燥，實(shí)驗(yàn)對(duì)冷凍干燥物和上樣液的預(yù)孵育的時(shí)間優(yōu)化得出最佳實(shí)驗(yàn)方案，同時(shí)優(yōu)化金納米粒子和辣椒堿抗體偶聯(lián)量、封閉液的選擇、重懸液的選擇和96孔板微孔中滴加量，并檢測(cè)冷凍干燥型辣椒堿試紙條靈敏度。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)辣椒堿的檢測(cè)在15min內(nèi)完成，裸眼觀察靈敏度為10μg/L，相比于傳統(tǒng)方法提高了10倍。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為2.5-50μg/L。（3）時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記免疫側(cè)向試紙辣椒堿檢測(cè)方法的建立本方法是基于競(jìng)爭(zhēng)法免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測(cè)原理，用時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記辣椒堿抗體建立免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰?，?duì)食用油中辣椒堿進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)。時(shí)間分辨熒光微球比表面積大、同時(shí)熒光微球表面修飾了一定數(shù)量的羧基功能團(tuán)，可以有效地將蛋白或抗體表面的氨基和熒光微球表面的羧基通過共價(jià)結(jié)合偶聯(lián)在一起，提高了標(biāo)記過程的穩(wěn)定性。本方法是在時(shí)間分辨熒光微球表面標(biāo)記辣椒堿單克隆抗體，NC膜的T線上固定辣椒堿抗原，C線上固定羊抗鼠二抗，通過肉眼可以看出NC膜上的T線和C線是否顯色從而來定量分析食用油中辣椒堿的含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)熒光微球與辣椒堿抗體的偶聯(lián)量、封閉劑種類、重懸液種類和熒光微球偶聯(lián)時(shí)的緩沖液體系進(jìn)行優(yōu)化從而確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并檢測(cè)時(shí)間分辨熒光微球辣椒堿試紙條的特異性和靈敏度。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，可以在10min內(nèi)完成對(duì)辣椒堿的檢測(cè)，肉眼直接觀察的靈敏度為20μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢測(cè)范圍為2.5-50μg/L。因此可以看出利用時(shí)間分辨熒光微球進(jìn)行標(biāo)記抗體建立的免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性不輸于傳統(tǒng)金納米粒子標(biāo)記，為下一步時(shí)間分辨熒光微球在免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埳系暮罄m(xù)應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：辣椒堿；金納米粒子；免疫側(cè)向?qū)游觯粫r(shí)間分辨熒光微球；地溝油鑒別ABSTRACTAscapsaicinitselfhasthecharacteristicsoflipophilic,stableandhighboilingpoint,itisdifficulttoseparatefromgutteroil,soitcanbeusedasaspecificindicatortoidentifywhethercookingoilisgutteroil.Therefore,threedifferentimmunochromatographicteststripmethodswereestablishedtodetectcapsaicininedibleoil:(1)establishmentofamethodfordeterminationofcapsaicininedibleoilbytraditionalimmunoassaypaperPrincipleofthismethodistolateralchromatographyandcapillaryantigenantibodyimmunerecognition,thecombinationofantibodycanbeusedbystaticadsorptionandgoldnanoparticlessurfacecoupling,theClineinNCmembranefixedsheepratresistance,resistanceTonlinefixedcapsaicinantigen,usuallybyNCmembranewhetherTlineandClinecolortojudgetheexistenceofthecapsaicinincookingoil,atthesametimewithgrayscalescanningresultscombinedwithquantitativeanalysistothecontentofcapsaicin.Onthebasisofthefeasibilitystudy,thecouplingamount,couplingpH,resuspendedsolution,samplepadtreatmentsolutionandsampledilutionbufferwereoptimizedtoobtainthebestexperimentalschemeandtodetectthespecificityandsensitivityoftraditionalcapsaicinstrips.Underthebestexperimentalconditions,thecontentofcapsaicincanbedeterminedwithin10minutes.Thesensitivityofvisualobservationstripis100μg/L,andthelinearrangeofstandardcurvedetectionis10-100μg/L.(2)establishmentofanimprovedmethodfordeterminationofcapsaicininedibleoilbyimmunoassaypaperThismethodisthebasisofthetraditionalimmunelateralchromatographytestpapertodetectgeneralconjugatespadabandon,conjugatescouplingproductdropinto96-wellplatesofmicroporousfreezedrying,theexperimentonthefreezedryingandsampleliquidintheprocessoftheincubationtimeoptimizationoptimalexperimentscheme,andoptimizethegoldnanoparticlesandcapsaicinantibodycoupling,theselectionofsealingfluid,thechoiceofsuspensionand96intheorificemicroporousaddquantity,sensitivityandthedetectionoffreezedryingcapsaicinstrip.Underthebestexperimentalconditions,thedetectionofcapsaicinwascompletedwithin15min,andthesensitivityofnakedeyeobservationwas10μg/L,whichwas10timeshigherthanthetraditionalmethod.Thelinearrangeofthestandardcurveis2.5to50μg/L.(3)establishmentofamethodforthedeterminationofcapsaicininimmunoassaypaperlabeledbytime-resolvedfluorescentmicrospheresThismethodisbasedonthedetectionprincipleofthecompetitionmethod,theimmunochromatographytestpaperisestablishedbyusingthetime-resolvedfluorescentmicrospherestomarkthecapsaicinantibody,andthecapsaicininedibleoilisdetectedquicklyandaccurately.Thespecificsurfaceareaofthetime-resolvedfluorescentmicrospheresislarge,andacertainnumberofcarboxylfunctionalgroupsaremodifiedonthesurfaceofthefluorescentmicrospheres,whichcaneffectivelycoupletheaminogrouponthesurfaceoftheproteinorantibodywiththecarboxylgrouponthesurfaceofthefluorescentmicrospheresbycovalentbinding,thusimprovingthestabilityofthelabelingprocessing.Thismethodistomarkcapsaicinmonoclonalantibodyonthesurfaceoftime-resolvedfluorescentmicrospheres,fixcapsaicinantigenontheTlineofNCfilm,andfixsheepanti-mousesecondaryantibodyontheCline.ItcanbeseenbynakedeyewhethertheTlineandClineontheNCfilmshowcolor,soastoquantitativelyanalyzethecontentofcapsaicininedibleoil.Inthisstudy,thecouplingamount,thetypeofblockingagent,thetypeofsuspensionandthebufferingliquidsystemofthefluorescentmicrospheresandcapsaicinantibodywereoptimizedtodeterminetheoptimalexperimentalparameters,andthespecificityandsensitivityofthetime-resolvedfluorescentmicrospheresandcapsaicinstripsweredetected.Undertheoptimalexperimentalconditions,thedetectionofcapsaicincanbecompletedwithin10minutes,thesensitivityofdirectvisualobservationis20μg/L,andthelineardetectionrangeofthestandardcurveis2.5-50μg/L.Therefore,itcanbeseenthatthesensitivityandstabilityoftheimmunoassaypaperbasedontime-resolvedfluorescentmicrosphereslabeledwithantibodiesarenotinferiortothatoftraditionalgoldnanoparticlesmarkers,whichlaysacertainfoundationforthefollow-upapplicationoftime-resolvedfluorescentmicrospheresinimmunoassaypaper.KEYWORDS:capsaicin;Goldnanoparticles;immunochromatography;Time-resolvedfluorescentmicrospheres;Identificationofgutteroil1.1辣椒堿的理化性質(zhì)及其檢測(cè)的意義辣椒堿又名辣椒素，是從茄科植物辣椒中提煉出來的一種高附加值產(chǎn)品，是一種極度辛辣的香草酰胺類生物堿[1]。最早由D.J.Bennet[2]等人用色譜、核磁共振波譜等現(xiàn)代一期分析發(fā)現(xiàn)。辣椒堿是辣椒屬植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。它的化學(xué)式為C18H27NO3。它的熔點(diǎn)為62-65℃，沸點(diǎn)為210-220℃?；瘜W(xué)穩(wěn)定性非常高，易溶于乙醇，甲醇，丙酮等有機(jī)溶劑。相關(guān)部門一直以來對(duì)于地溝油的監(jiān)管有所欠缺，其中的主要原因就是因?yàn)殍b別地溝油的技術(shù)不夠完善，如果不能準(zhǔn)確鑒別油樣是否為地溝油，監(jiān)管就成為一個(gè)艱巨的任務(wù)[3,4]。因?yàn)榈販嫌蛠碓吹那蓝鄻?、精煉程度和加工工藝不同，?dǎo)致地溝油中的有害成分也有很大不同，因此用檢測(cè)方法的不同可能會(huì)導(dǎo)致兩種不同的結(jié)果，而且目前精煉地溝油的技術(shù)十分成熟，精煉過程中可以剔除大部分檢測(cè)時(shí)的標(biāo)記物，如果不法商家將少量經(jīng)過精煉后的地溝油與合格食用油混合售賣，這樣給地溝油的鑒別帶來更大的挑戰(zhàn)。我國(guó)科研工作者對(duì)地溝油的檢測(cè)進(jìn)行了很多研究，但是大部分的檢測(cè)技術(shù)還是有一些不足之處，對(duì)于地溝油的鑒別存在片面性。根據(jù)中國(guó)的菜系及餐飲習(xí)慣，辣椒作為常用的調(diào)料在烹飪過程中加入辣椒堿，作為辣椒的有效成分能在烹飪過程中不被完全破壞并溶于油中[5]。辣椒堿對(duì)地溝油可謂是忠貞不渝，地溝油的精煉步驟都無(wú)法從油脂中分離辣椒堿。因此將辣椒堿這一物質(zhì)作為辨別地溝油的標(biāo)準(zhǔn)是檢測(cè)地溝油方法的一大突破[7]。1.2膠體金納米粒子在免疫側(cè)向?qū)游鲋械膽?yīng)用膠體金也被稱作金溶膠，是膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠，是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液[8]。膠體金顆粒通常分布在1～100nm之間，并且在膠體金溶液中可以呈現(xiàn)出穩(wěn)定、均勻、單一分散的狀態(tài)。膠體金通常由氯金酸在還原劑如檸檬酸鈉、白磷、抗壞血酸等試劑的作用下形成一定大小的金納米顆粒，并且在靜電作用下形成穩(wěn)定的帶負(fù)電的疏水性水膠溶液[9]。一定體積的氯金酸在不同體積的還原劑的作用下得到的膠體金粒徑大小也不一樣，一般因?yàn)槟z體金溶液的粒徑大小有差異，所以看到的膠體金溶液的顏色也有區(qū)別。膠體金溶液中的金納米粒子粒徑為2～5nm時(shí)，膠體金溶液顯示為橙黃色；粒子粒徑為10～20nm時(shí)，膠體金溶液顯示為酒紅色；粒子粒徑為30～80nm時(shí)，膠體金溶液顯示為紫紅色。膠體金在免疫側(cè)向?qū)游鲋衅鸬綐?biāo)記的作用，與抗體吸附結(jié)合后可以起到顯色的作用[10]。二者吸附機(jī)理目前廣泛認(rèn)為是膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附作用合。膠體金粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力，能夠與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等以非共價(jià)方式結(jié)合，因而膠體金在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面發(fā)揮著十分重要的作用[11,12]。1.3時(shí)間分辨熒光免疫層析分析技術(shù)的應(yīng)用熒光免疫分析法是在上世紀(jì)40年代由Cons和Kaplan[13-15]在一次實(shí)驗(yàn)中用熒光素和抗體相結(jié)合來準(zhǔn)確定位組織中的抗原所在的位置，因而提出的一種檢測(cè)概念。在分析領(lǐng)域中，熒光素是最為常用的標(biāo)記物之一，這些標(biāo)記物通常在在特定的激發(fā)光照射下，則會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光免疫分析技術(shù)是在上世紀(jì)20年代初期建立的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，其主要的原理是利用熒光的可測(cè)定性和抗原抗體的高效識(shí)別性相結(jié)合，將熒光素作為抗體的標(biāo)記物，在特定的激發(fā)光的作用下，熒光素可以進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)并且釋放出光能同時(shí)產(chǎn)生一定的熒光信號(hào)。將檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來判斷最終檢測(cè)結(jié)果[16,17]。這種檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、貨架存儲(chǔ)期長(zhǎng)、所需要的儀器簡(jiǎn)單等等優(yōu)點(diǎn)，因此熒光免疫分析法在食品衛(wèi)生、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)保等等領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。但是傳統(tǒng)的熒光免疫層析法大多都存在著標(biāo)記物熒光素不穩(wěn)定和熒光素發(fā)出的信號(hào)值的檢測(cè)范圍窄等問題，對(duì)于定量和快速這兩種檢測(cè)需求無(wú)法滿足，為了解決傳統(tǒng)熒光免疫層析法的問題，在上世紀(jì)80年代，科學(xué)家Soini和Kojola等[18-20]采用鑭系元素及其熒光配合物作為標(biāo)記物，建立了一種新型非放射性微量免疫分析技術(shù)-時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)。時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法與化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法并稱為三大超敏免疫分析方法[21]。這種方法中用到的熒光標(biāo)記物為時(shí)間分辨熒光微球，它是一種特殊功能的微球，每個(gè)微球中包裹著成千上萬(wàn)個(gè)熒光分子，從而大幅度提高了熒光的標(biāo)記效率，有效提高了檢測(cè)靈敏度，同時(shí)熒光微球表面修飾了一定數(shù)量的羧基功能團(tuán)，可以有效地將蛋白或抗體表面的氨基和熒光微球表面的羧基通過共價(jià)結(jié)合偶聯(lián)在一起，提高了標(biāo)記過程的穩(wěn)定性[22,23]。微球的粒徑一般在50nm-400nm之間。到目前為止，一共有5種鑭系元素被用于時(shí)間分辨熒光微球，其中銪（Europium，Eu）、鋱（Terbium，Tb）、釤（Samarium，Sm）、鏑（Dysprosium，Dy）這四種元素由于具有獨(dú)特的熒光光譜特征，應(yīng)用較為廣泛，元素銪在抗體標(biāo)記檢測(cè)中應(yīng)用最廣。鑭系元素在游離的狀態(tài)下的熒光信號(hào)較弱，通常能量傳遞依靠分子間共振能，但是螯合后的鑭系元素可以在紫外光源的照射激發(fā)下發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。而且鑭系元素有較窄的發(fā)射光譜和較寬的激發(fā)光譜，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)間Stocks位移較大[24,25]。因此利用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)方法可以有效降低外界熒光、激發(fā)光和非特異性熒光所造成的干擾，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和減少了誤差率。隨著食品安全各種問題的日益突出，對(duì)食品安全的檢測(cè)技術(shù)也在不斷完善，人們將免疫層析技術(shù)和時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)相結(jié)合創(chuàng)建了更為簡(jiǎn)單快速的定量檢測(cè)技術(shù)-時(shí)間分辨熒光免疫層析分析技術(shù)。該技術(shù)將免疫層析和時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)的各自特點(diǎn)結(jié)合在一起發(fā)揮出更多的優(yōu)勢(shì)，例如該技術(shù)可以對(duì)需要檢測(cè)的樣本進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)并且具有準(zhǔn)確定量、干擾性小、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、標(biāo)記物儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等等優(yōu)點(diǎn)[26]。時(shí)間分辨熒光層析分析技術(shù)在POCT定量檢測(cè)中具有很大的優(yōu)勢(shì)與潛力，對(duì)于那些需要現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)的單位具有良好的應(yīng)用前景[27]。因此，在鑒別快速檢測(cè)地溝油并且定量檢測(cè)出地溝油中辣椒堿含量的需求上，時(shí)間分辨熒光層析分析技術(shù)可以很好滿足以上的需求。1.4地溝油檢測(cè)鑒別的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀1.4.1國(guó)外地溝油的研究現(xiàn)狀在國(guó)外一些發(fā)達(dá)國(guó)家例如美國(guó)、德國(guó)、日本，它們針對(duì)地溝油頒發(fā)了一系列完整的法律法規(guī)和嚴(yán)格有效的回收地溝油的政策，因此在國(guó)外地溝油基本不會(huì)再次進(jìn)入食品市場(chǎng)從而危害人們的身體健康。例如:日本政府的政策是使用政府補(bǔ)貼的模式以較高的價(jià)格回收地溝油，再經(jīng)過加工使地溝油搖身一變生成生物柴油在工業(yè)上提供使用。而在美國(guó)，相關(guān)方面的科學(xué)家們利用地溝油制成一種新型材料，這種材料可以吸收周圍環(huán)境的熱量，通俗來說就是一種保暖材料，可以說是變廢為寶[29]。因此國(guó)外對(duì)于地溝油的鑒別方面的研究報(bào)道比較少，國(guó)外科研人員對(duì)如何更好利用廢棄油脂、各種植物油例如利用低價(jià)植物油混合在高價(jià)植物油里的質(zhì)量的鑒別。1.4.2國(guó)內(nèi)地溝油的研究現(xiàn)狀目前國(guó)內(nèi)并沒有制定完全統(tǒng)一鑒別地溝油的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，其主要原因是地溝油來源的渠道多樣、精煉工藝和加工手法不同，導(dǎo)致地溝油中的有害成分也有很大不同，于是相關(guān)技術(shù)部門通常要結(jié)合多種檢測(cè)技術(shù)才能對(duì)地溝油進(jìn)行判別，常規(guī)檢測(cè)主要依據(jù)國(guó)標(biāo)GB2716--2005食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[30,31]。隨著地溝油精煉技術(shù)和加工手段的不斷進(jìn)步，精煉加工后的地溝油可能依然符合油脂水分、酸價(jià)、過氧化值、羰基價(jià)這個(gè)四項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)，這樣只能鑒別檢測(cè)樣品中的指標(biāo)是否符合，而不能作為鑒別油樣是否為地溝油的主要依據(jù)。我國(guó)針對(duì)關(guān)于地溝油的的檢測(cè)技術(shù)研究方向主要有以下幾個(gè)方向：酸價(jià)檢測(cè)酸價(jià)的定義是中和lg油脂中游離脂肪酸所需要?dú)溲趸浀馁|(zhì)量，根據(jù)國(guó)家相關(guān)規(guī)定合格的食用油中的酸價(jià)值小于4mg/g(KOH)。地溝油的來源渠道復(fù)雜多樣，高溫煎炸和儲(chǔ)存不當(dāng)這些條件均會(huì)引起油脂的加速酸敗，因此一般地溝油與正常食用油相比酸敗程度高，有實(shí)驗(yàn)表明大部分地溝油的酸價(jià)高出正常食用油標(biāo)準(zhǔn)的幾十倍，對(duì)于這一現(xiàn)象，很多科研人員測(cè)油脂中的酸價(jià)作為地溝油的鑒別標(biāo)準(zhǔn)。例如潘劍宇[32-36]等測(cè)得在泔水油中的酸價(jià)可以高達(dá)149mg/g(KOH)，經(jīng)過煎炸過后的油脂中的酸價(jià)為15.54mg/g(KOH)，而正常提取的油脂中的酸價(jià)都低于lmg/g(KOH)。因而科研人員認(rèn)為可以將酸價(jià)作為檢測(cè)食用油是否合格的理化指標(biāo)之一。但是目前地溝油的精煉技術(shù)可以在精制過程中對(duì)油脂進(jìn)行脫酸處等一系列的處理。而潘劍宇等在實(shí)驗(yàn)室中測(cè)得的地溝油是之間從酒店拿到的潲水油，并未進(jìn)行油脂精制過程中的脫酸步驟，而地溝油經(jīng)過脫酸等一系列步驟處理后，油脂的酸價(jià)會(huì)大幅度下降與正常食用油基本一樣。正如柳立國(guó)案件中，浙江警方在一些不法加工車間里查獲了一批精煉地溝油，相關(guān)部門檢測(cè)人員在這批查獲的精煉地溝油中通過隨機(jī)抽樣檢測(cè)了10個(gè)精煉地溝油樣本，根據(jù)目前國(guó)家規(guī)定的《食用植物油衛(wèi)生指標(biāo)》的指標(biāo)進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，其中包括酸價(jià)在內(nèi)的共9項(xiàng)指標(biāo)，但最終結(jié)果顯示有8個(gè)樣本符合衛(wèi)生指標(biāo)中酸價(jià)這一項(xiàng)指標(biāo)，有些樣本的酸價(jià)檢測(cè)結(jié)果可以達(dá)到所謂的優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[37,38]。從上述事件可以看出利用酸價(jià)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于準(zhǔn)確鑒別通過一系列精制加工的地溝油不具有準(zhǔn)確的特異性。表1.1勾兌油脂樣品酸價(jià)測(cè)定結(jié)果Table1.1Resultsofacidvalueofblendingoil極性組分（polarcompound，PC）極性組分（polarcompound，PC）是食用油在煎炸或高溫加熱條件下發(fā)生劣變，熱氧化反應(yīng)和水解反應(yīng)，產(chǎn)生比正常動(dòng)、植物油脂分子（甘油三酯）極性較大的一些成分，如甘油三酯熱氧化產(chǎn)物（含有醛基、酮基、羥基、過氧化氫基和羧基的甘油三酯）、熱聚產(chǎn)物、熱氧化聚合物、水解產(chǎn)物（游離脂肪酸、單甘油酯和雙甘油酯）總稱[39]。這些成分可以攻擊人體酶系統(tǒng)，尤其是在人體內(nèi)會(huì)分解產(chǎn)生一些如丙烯酰胺、多環(huán)芳烴類可以引起人體癌變的物質(zhì)。根據(jù)這一特性，在2008年黃軍[40-42]等采用薄層色譜法（TLC）和柱色譜法（CC）的檢測(cè)技術(shù)對(duì)潲水油與超市里正常售賣的合格油樣及其通過復(fù)雜加工工藝后的地溝油樣中的極性成分進(jìn)行檢測(cè)對(duì)。黃軍[43,44]等利用色譜柱分離拖尾成分，然后對(duì)成分進(jìn)行紅外分析，該結(jié)果顯示地溝油中的極性化合物的含量普遍高于市場(chǎng)上售賣的正常植物油，因此將油脂中極性組分的含量作為鑒別地溝油的指標(biāo)。但如果將地溝油進(jìn)行特別的精煉后，可以改變油脂中的一些性狀（如油脂的極性組分），另外在食用油的生產(chǎn)加工各個(gè)步驟、運(yùn)輸貯存和使用存放過程中會(huì)有很多不確定因素的發(fā)生，這些均可能導(dǎo)致油脂中的極性組分百分含量過高，這將會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果屬于不合格的食用油而并不是地溝油。因此不能將這作為地溝油的特異性物質(zhì)，也給相關(guān)檢測(cè)人員的檢測(cè)帶來一定的困擾[45]。表1.2勾兌油脂樣品極性組分測(cè)定結(jié)果Table1.2Resultsofpolarcomponentofblendingoil電導(dǎo)率地溝油雖然來源渠道復(fù)雜，但大部分是經(jīng)過烹飪后的剩余油脂，因此油脂中便會(huì)含有各種調(diào)味劑和洗滌劑，使油脂中的鹽離子和一些金屬離子的含量增多，同時(shí)由于地溝油的成分復(fù)雜，油脂容易發(fā)生不同程度的酸化水解，這些都會(huì)導(dǎo)致油脂的導(dǎo)電性能增強(qiáng)，因此有科研人員將電導(dǎo)率作為判別地溝油的指標(biāo)之一[46,47]。例如黃偉[48-49]等人測(cè)合格食用油和地溝油的電導(dǎo)率分別在16uS/cm以下和28.28uS/cm以上，從黃偉等人測(cè)得的結(jié)果可以看出正常食用油油與地溝油的電導(dǎo)率有一定的差距。因此科研人員將電導(dǎo)率作為檢測(cè)地溝油的標(biāo)準(zhǔn)之一，但是由于現(xiàn)在地溝油的精煉技術(shù)越來越精細(xì)，可以過濾掉油脂中大部分水溶性物質(zhì)，這一步驟會(huì)極大影響油脂中電導(dǎo)率的數(shù)值，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的判斷出現(xiàn)誤差，所以將電導(dǎo)率作為鑒別地溝油的特異性指標(biāo)不夠準(zhǔn)確。表1.3不同油脂樣品電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果Table1.3Resultsofconductivitydeterminationofdifferentoilandgreasesamples膽固醇含量合格的植物油中不會(huì)存在膽固醇這一物質(zhì)，然而動(dòng)物油脂中的膽固醇含量十分豐富。眾所周知地溝油大部分是餐桌上廢棄的油混合在一起，因此由科研人員將油脂中膽固醇的含量作為鑒別地溝油的指標(biāo)之一[50-52]。例如陳紅[53-57]等人創(chuàng)立利用超高液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜的方法來檢測(cè)地溝油中膽固醇的含量。郭濤[58-66]等人建立了利用高效液相色譜法來檢測(cè)地溝油中膽固醇的含量。還有學(xué)者利用近紅外光譜或者薄層色譜的方法來檢測(cè)膽固醇的含量，這兩種方法相比較與之前的方法更為快速簡(jiǎn)便。但是將膽固醇的含量作為鑒別指標(biāo)之一也容易形成誤判，原因在于廢棄的油中可能只含有植物油，例如煎炸面食的煎炸老油并未含有動(dòng)物油。圖1.1餐飲廢棄油脂和正常食用油的紅外光譜圖Fig1.1Infraredspectrumofwasteoilsandfatsandnormalcookingoilsfromrestaurants辣椒堿含量為了有效打擊和遏制利用地溝油制售食用油的犯罪行為，2011年9月以后，衛(wèi)生部在全國(guó)范圍內(nèi)兩次征集檢測(cè)方法，各相關(guān)領(lǐng)域的研究及檢測(cè)機(jī)構(gòu)均積極參與其中，開展了規(guī)?？涨暗牡販嫌蜋z測(cè)技術(shù)的研究工作，并先后驗(yàn)證了經(jīng)各方人員提交的數(shù)百種地溝油鑒定指標(biāo)和檢測(cè)方法，而將辣椒堿的含量作為鑒別地溝油的指標(biāo)這個(gè)方案通過了衛(wèi)生部國(guó)家食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心組織的多輪驗(yàn)證檢測(cè)，最終從281個(gè)科研院所和個(gè)人提交的315項(xiàng)地溝油檢測(cè)方法技術(shù)中脫穎而出，作為鑒別地溝油的四種檢測(cè)方法之一，并向公安部、質(zhì)監(jiān)和工商總局等國(guó)家十一部委推廣使用，這一方法也在多起打假地溝油煉制的案件中起到了至關(guān)重要的作用[67]。將辣椒堿含量作為鑒別地溝油是根據(jù)中國(guó)的菜系及餐飲習(xí)慣，辣椒作為十分常用的調(diào)料在烹飪過程中被加入，辣椒堿作為辣椒調(diào)料的有效成分能在烹飪過程中基本不會(huì)破壞并溶于油脂中。基于辣椒堿的本身的特性，地溝油即使經(jīng)歷水洗、土吸、真空、高溫等一系列的精煉步驟，辣椒堿始終溶于油脂中，無(wú)法將辣椒堿和油脂分離開來。因此將辣椒堿的含量作為辨別地溝油的標(biāo)準(zhǔn)是鑒別地溝油的方法的一大突破[68]。國(guó)內(nèi)有很多研究[69-72]報(bào)道使用液質(zhì)聯(lián)用儀的方法檢測(cè)辣椒堿，也證明了以辣椒堿的含量作為目標(biāo)物鑒別地溝油方法的可靠性，而對(duì)于以辣椒堿為目標(biāo)物的免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的方法研究基本沒有，液質(zhì)聯(lián)用儀的方法與試紙條的方法檢測(cè)食用油中的辣椒堿相比有很多不足，前者只能在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而且液質(zhì)聯(lián)用儀價(jià)格昂貴、操作難度高，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)使該項(xiàng)技術(shù)難以在全國(guó)范圍內(nèi)普及同時(shí)也對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求。之前也有關(guān)于膠體金直接鑒別地溝油的報(bào)道，但此方法的原理在于地溝油的成分復(fù)雜容易引起膠體金的聚集從而發(fā)生顏色上的改變，對(duì)于精煉的地溝油引起膠體金的聚集十分困難[73]。試紙條的方法是在以辣椒堿為目標(biāo)物，利用辣椒堿的特性很難與油脂分離的特性，即使是精煉地溝油也可以檢測(cè)出來，同時(shí)試紙條法可以在保證靈敏度的前提下，檢測(cè)成本低，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)操作步驟簡(jiǎn)便，檢測(cè)出結(jié)果時(shí)間短，非常符合檢測(cè)人員現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。2.1膠體金免疫側(cè)向?qū)游隼苯穳A檢測(cè)原理膠體金免疫側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)方法是快速檢測(cè)的方法之一，因其具有操作方便、檢測(cè)和特異性優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛的認(rèn)可。通常膠體金免疫側(cè)向?qū)游鲇懈?jìng)爭(zhēng)法和夾心法兩種方法，但由于辣椒堿是小分子物質(zhì)，因此檢測(cè)辣椒堿的方法的原理是競(jìng)爭(zhēng)法識(shí)別原理，具體檢測(cè)原理示意圖如下圖：圖2.SEQ圖2.\*ARABIC1膠體金免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埨苯穳A檢測(cè)原理圖Fig2.1Theschematicdiagramofcapsaicinimmunochromatographictechnology由原理圖所示：金標(biāo)墊上滴加可以與辣椒堿特異性結(jié)合的辣椒堿單克隆抗體與金納米粒子的偶聯(lián)物。試紙條中間部分的材料為硝酸纖維素膜（Nitrocellulosefiltermembrane,NC膜），NC膜上噴涂?jī)蓷l線分別為檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），T線位置上噴涂人工合成的辣椒堿包被原，C線上噴涂有羊抗鼠二抗，T線上的辣椒堿抗原和辣椒堿分子均可以和金標(biāo)墊上的辣椒堿抗體上的同一位置結(jié)合，因此兩者形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。在檢測(cè)樣品時(shí)，將待測(cè)樣品滴加到樣品墊上，液體會(huì)由毛細(xì)管作用力和吸水墊強(qiáng)大的吸水作用力下側(cè)向?qū)游?，檢測(cè)液體依次經(jīng)過金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜最后液體由吸水墊吸收。若待測(cè)樣品中不含有辣椒堿分子，則液體并不會(huì)與金標(biāo)墊上的辣椒堿抗體結(jié)合，因此金標(biāo)墊上的辣椒堿抗體與金納米粒子偶聯(lián)物會(huì)在檢測(cè)液體的帶動(dòng)下流經(jīng)T線與T線上的辣椒堿包被原結(jié)合，由于金納米粒子本身的顏色使T線顯色為紅色，同時(shí)液體繼續(xù)向前流動(dòng)到C線位置，金納米粒子和辣椒堿抗體偶聯(lián)物與羊抗鼠二抗結(jié)合，使C線呈現(xiàn)紅色，最終在NC膜上呈現(xiàn)兩條紅線即樣品為陰性樣品。若待測(cè)樣品中含有辣椒堿分子，則液體流動(dòng)到金標(biāo)墊位置時(shí)便會(huì)與辣椒堿抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，因此辣椒堿抗體無(wú)法與T線上的辣椒堿包被原從而T線上的顏色消失或減弱，液體繼續(xù)向前流動(dòng)到C線位置，金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)與羊抗鼠二抗正常結(jié)合，使C線呈現(xiàn)紅色，最終在NC膜上T線不顯色或者顏色較弱，C線的顏色正常即為陽(yáng)性樣品。C線為質(zhì)控線，若C線位置上不顯色則不論T線是否顯色均表明該試紙條已經(jīng)失效，檢測(cè)結(jié)果屬于無(wú)效，需要重新檢測(cè)。2.2實(shí)驗(yàn)主要試劑材料和設(shè)備2.2.1主要試劑材料氯金酸（HAuCl4·3H2O）購(gòu)自百靈威科技有限公司；檸檬酸三鈉，碳酸鉀（K2CO3），曲拉通X-100（TritonX-100），三羥甲基氨基甲烷（Tris），硼酸，氫氧化鈉（NaOH），氯化鈉（NaCl），濃鹽酸（HCl），濃硝酸（HNO3），濃硫酸（H2SO4），磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O），磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O），聚乙二醇-20000,（PEG-20000）,吐溫-80（Tween-80），吐溫-20（Tween-20）和表面活性劑S9（Tetronic1037）均是分析純級(jí)別，購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（Albuminfrombovineserum,BSA）購(gòu)自于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；酪蛋白（Casein,98%）購(gòu)自于Sigma-Aldrich中國(guó)公司；酪蛋白鈉（Na-Casein）購(gòu)自于百靈威科技有限公司；卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）購(gòu)自于百靈威科技有限公司；人血清蛋白（Humanserumalbumin,HSA）購(gòu)自于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、吸水紙、PVC支撐底板和羊抗鼠二抗均購(gòu)自于上海捷寧生物科技有限公司；辣椒堿單克隆抗體和辣椒堿包被原由提供；辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)品由成都檢驗(yàn)檢疫研究院提供，已通過高效液相檢測(cè)。金龍魚1:1:1調(diào)和油購(gòu)于中環(huán)大潤(rùn)發(fā)超市。2.2.2主要設(shè)備表2.SEQ表2.\*ARABIC1本章所用儀器設(shè)備Table2.1Themaininstrumentsinthischapter設(shè)備名稱設(shè)備型號(hào)生產(chǎn)廠家加熱磁力攪拌器RCT廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司電子天平FA1104B上海精天電子儀器有限公司微型旋渦混合儀WH-1上海滬西分析儀器廠有限公司移液器各量程芬蘭雷勃公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9109-25A上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司美的電冰箱BCD-196SMA美的集團(tuán)低溫高速離心機(jī)HeraeusFresco17德國(guó)賀利氏公司Milli-QA10SystemMilli-QA10美國(guó)密理博公司試紙條噴膜儀試紙條切條機(jī)相機(jī)XYZCM4000A6100L美國(guó)伯樂公司美國(guó)伯樂公司索尼（中國(guó)）有限公司2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1實(shí)驗(yàn)所需緩沖液及處理液配制（1）0.01MpH7.4PB緩沖液配制0.2MpH7.4磷酸氫二鈉溶液配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取35.8gNa2HPO4·2H2O置于500mL干燥潔凈錐形瓶中，之后緩慢加入400mL超純水，將錐形瓶放入超聲儀中使其溶解更加充分，再將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，再用超純水清洗錐形瓶并將所有液體轉(zhuǎn)移至容量瓶中，最后定容至500mL，配制完成，標(biāo)記為母液1；0.2MpH7.4磷酸二氫鈉溶液配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取15.6gNaH2PO4·2H2O置于500mL干燥潔凈錐形瓶中，之后緩慢加入400mL超純水，將錐形瓶放入超聲儀中使其溶解更加充分，再將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，再用超純水清洗錐形瓶并將所有液體轉(zhuǎn)移至容量瓶中，最后定容至500mL，配制完成，標(biāo)記為母液2；準(zhǔn)確量取19mL母液1和81mL母液2于100mL燒杯中，制得0.2MpH7.4PB緩沖液。再取5mL0.2MPB于100mL容量瓶中，再加入95mL超純水定容至100mL，制得0.01MpH7.4PB緩沖液。緩沖液配制完成后放入4℃冰箱保存。（2）0.01MpH7.4PBS緩沖液配制：用天平準(zhǔn)確稱取7.9gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4·2H2O和1.8gK2HPO4·2H2O置于干燥潔凈的燒杯中，緩緩加入800mL的超純水，將燒杯放入超聲儀中使其溶解更加充分，再用0.1M的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，最后用超純水定容至1L，制得0.01MpH7.4PBS緩沖液。緩沖液配制完成后放入4℃冰箱保存。（3）0.01MpH8.0Tris-HCl緩沖液配制：用分析天平稱取1.215gTris粉末于潔凈干燥的錐形瓶中，然后緩慢加入500mL超純水，將其超聲溶解后后再向Tris溶液中加入少量0.1M鹽酸溶液，pH儀測(cè)定Tris溶液pH，到溶液pH8.0時(shí)停止加入鹽酸溶液，再將調(diào)節(jié)完pH的Tris溶液轉(zhuǎn)移至1L容量瓶，用超純水定容至1L，制得0.01MpH8.0Tris-HCl緩沖液。緩沖液配制完成后放入4℃冰箱保存。（4）金標(biāo)墊處理液：用電子天平準(zhǔn)確稱取5g蔗糖，1g海藻糖，0.25gPEG20000，300μLTween20于100mL燒杯中，加入5mL0.2MpH7.4PB緩沖液后，準(zhǔn)確量取45mL超純水加入燒杯中，超聲攪拌使其充分溶解，之后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用超純水定容至100mL，將配制好的金標(biāo)墊處理液置于4℃冰箱保存。（5）樣品墊處理液：用電子天平準(zhǔn)確稱取0.8766gNaCl于100mL燒杯中，加入50mL0.01MpH8.0Tris-HCl，再加入250μL曲拉通X-100，將燒杯放入超聲儀中使其溶液充分溶解。將溶解完畢的溶液全部移至100mL容量瓶中，用0.01MpH8.0Tris-HCl溶液定容至100mL，將配制好的樣品墊處理液置于4℃冰箱保存。（6）牛血清白蛋白、人血清蛋白和卵清蛋白溶解：牛血清白蛋白和人血清蛋白在實(shí)驗(yàn)中所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常為10%，卵清蛋白所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常為0.5%。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的牛血清白蛋白的溶液配制：在電子天平上稱取0.7gBSA粉末放于干燥潔凈的10mL的離心管中，加入7mL超純水后放入超聲儀中使其充分溶解。溶解后將配置好的BSA置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的人血清白蛋白的溶液配制：在電子天平上稱取0.7gHSA粉末放于干燥潔凈的10mL的離心管中，加入7mL超純水后放入超聲儀中使其充分溶解。溶解后將配置好的HSA置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的卵清白蛋白的溶液配制：在電子天平上稱取0.030gOVA粉末放于干燥潔凈的10mL的離心管中，加入6mL超純水后放入超聲儀中使其充分溶解。溶解后將配置好的OVA置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫唬?）酪蛋白和酪蛋白鈉溶解酪蛋白和酪蛋白鈉在實(shí)驗(yàn)中所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常為0.5%。配制所用的容器為20mL的帶蓋玻璃瓶，配制之前需要對(duì)玻璃瓶進(jìn)行嚴(yán)格的清洗，在放置于37℃烘箱烘干后使用。在電子分析天平上準(zhǔn)確稱取0.0005g酪蛋白粉末放于已干燥的玻璃瓶子，同時(shí)加入100μL1M氫氧化鈉溶液，再加入10mL的超純水，將玻璃瓶放在加熱磁力攪拌器上用180℃加熱直至溶液內(nèi)無(wú)明顯可見顆粒物質(zhì)呈現(xiàn)透明狀態(tài)說明酪蛋白已全部溶解，關(guān)閉加熱電源，取下玻璃瓶，待溶液冷卻到室溫后加水補(bǔ)足溶液體積至10mL，將配制后的酪蛋白置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3.2金納米粒子的制備（1）取250mL錐形瓶用自來水沖洗干凈后，用新配制的王水（濃鹽酸和濃硝酸的體積比例為3:1均勻混合）浸泡24h后再用超純水沖洗后再將錐形瓶中裝滿雙蒸水煮沸，重復(fù)煮沸五次后開始制備膠體金。（2）首先在錐形瓶中加入100mL氯金酸溶液（0.1g/L）放到磁力攪拌器上加熱至沸騰，將磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速調(diào)至1500r/min迅速加入一定體積質(zhì)量濃度為10g/L的檸檬酸三鈉，一分鐘后溶液將會(huì)發(fā)生明顯的顏色變化。通常首先是從淡黃色的氯金酸溶液變?yōu)榛疑俚胶谏?，隨后變?yōu)樽仙詈箢伾€(wěn)定在酒紅色，整個(gè)變色過程大約4min。（3）等到溶液顏色不再發(fā)生變化后關(guān)閉熱源，繼續(xù)攪拌旋轉(zhuǎn)五分鐘。將冷卻后的膠體金放在2-4℃的條件下保存。加入不同體積的檸檬酸三鈉得到膠體金的粒徑大小也不同。本實(shí)驗(yàn)中制備不同粒徑的金納米粒子所加的氯金酸溶液體積是固定的，所加的檸檬酸三鈉體積如下表2.2所示：表2.SEQ表2.\*ARABIC2不同粒徑金納米粒子的制備Table2.2Preparationofdifferentparticlesizeofgoldnanoparticles金納米粒子粒徑100mL氯金酸溶液（0.1g/L）加入的1%檸檬酸三鈉的量金納米粒子溶液的顏色20nm1.2mL橙紅色30nm1.0mL酒紅色45nm0.85mL深紅色55nm0.75mL紫紅色2.3.3辣椒堿抗體與金納米粒子偶聯(lián)成功的表征本實(shí)驗(yàn)的核心在于辣椒堿抗體可以與標(biāo)記物金納米粒子的成功偶聯(lián)，為了驗(yàn)證兩者偶聯(lián)成功，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征，具體步驟如下：（1）向兩個(gè)1.5mL的離心管中加入1mL的膠體金溶液，再加入20μL0.1M碳酸鉀充分震蕩混勻30s，調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至7.5，分別編號(hào)1和2，再向2號(hào)離心管中加入1μL的1mg/mL辣椒堿抗體，在渦旋儀上震蕩混勻30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育1h（室溫條件下即可）；（2）將偶聯(lián)完成的兩管離心管進(jìn)行離心重懸，離心管對(duì)稱放入高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，在11000r/min轉(zhuǎn)速下，溫度為4℃的條件下離心10min后取出，將離心管內(nèi)的下層沉淀用100μL蒸餾水進(jìn)行重懸，在渦旋儀上將溶液充分混勻30s；（3）制膠：首先向100mL錐形瓶中準(zhǔn)確添加20mL1×TBE溶液，再向錐形瓶中加入事先稱量好的0.4g瓊脂糖，將其搖勻并加熱溶解，將溶解后的液體倒入模具內(nèi)在室溫條件下等待冷卻凝固，再放入4℃靜置1小時(shí)，完成2%的瓊脂糖膠；（4）制樣：將（2）中重懸后的重懸液分別與40%蔗糖溶液按2:1的比例混合均勻后上膠點(diǎn)樣；（5）電泳：將制好的樣品在100V條件下電泳30分鐘，跑完后觀察結(jié)果拍照記錄。2.3.4免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埖闹苽淠z體金免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垙南碌缴弦来斡蓸悠穳|、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊4個(gè)部分組成，其中樣品墊和金標(biāo)墊需要浸泡在樣品墊處理液和金標(biāo)墊處理液中。試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水墊4個(gè)部分組成。樣品墊的前處理：將玻璃纖維素膜切成18mm×300mm的形狀，放入樣品墊處理液中充分浸泡2h，取出后放入37℃烘箱中，烘干備用；金標(biāo)墊的前處理：將玻璃纖維素膜切成6mm×300mm的形狀。放入金標(biāo)墊處理液中充分浸泡2h，取出后放入37℃烘箱中烘干，用切條機(jī)切成寬6mm，長(zhǎng)3mm的長(zhǎng)方形，裝入密封袋內(nèi)備用；劃膜：將羊抗鼠二抗、辣椒堿包被原用PB（10mol/L，pH7.4）分別稀釋至1g/L，用噴膜儀包被在NC膜上，形成間隔5mm的檢測(cè)線（TestLine，T線）和質(zhì)控線（ControlLine，C線），C線和T線噴膜速度均為0.5μL/cm，37℃條件下烘干2h，取出置于4℃避光干燥保存。試紙條組裝：最后將樣品墊、NC膜和吸水墊依次粘貼在PVC底板上，樣品墊與NC膜之間需要預(yù)留出3mm的空隙以便后續(xù)將滴加偶聯(lián)物的金標(biāo)墊放置于兩者之間，組裝好后用切條機(jī)切割成3mm寬的試紙條保存?zhèn)溆谩?2.3.5實(shí)際樣品食用油脂中辣椒堿的檢測(cè)步驟（1）取10mL待檢測(cè)的食用油油樣；量取1mL無(wú)水甲醇，加入到10mL油樣中，充分震蕩渦旋混合1min，將混合的油樣通過離心機(jī)以6000r/min速率離心10min；（2）離心完成后，吸取上層甲醇相溶液20μL，加入到80μL稀釋緩沖液中，充分混合均勻后，取80μL，滴加到辣椒素膠體金試紙條的加樣孔內(nèi)。（3）將溫育器溫度設(shè)定為37℃，將加樣的辣椒素膠體金試紙條置于孵育器中溫育10min。（4）溫育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)，對(duì)辣椒素膠體金試紙條上的顯色結(jié)果進(jìn)行判斷。2.3.6金納米粒子與辣椒堿單克隆抗體偶聯(lián)金納米粒子與蛋白質(zhì)結(jié)合通常是通過靜電吸附，其原理為在于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與膠體金溶液的pH值之間的關(guān)系。金納米粒子表面帶負(fù)電，調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值可以使蛋白質(zhì)表現(xiàn)出整體正電局部負(fù)電的狀態(tài)這樣便于與金納米粒子通過靜電吸附和疏水作用偶聯(lián)結(jié)合，這種偶聯(lián)結(jié)合可以保證抗體的生物活性和膠體金的穩(wěn)定性，也是免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埛€(wěn)定性的保證。膠體金溶液pH值調(diào)節(jié)：取1mL膠體金溶液于干1.5mL的干燥潔凈的離心管內(nèi)，再向膠體金溶液中加入0.1M的碳酸鉀溶液，在渦旋儀上將溶液充分混勻；抗體偶聯(lián)過程：加入碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH值后，加入一定體積的1mg/mL的辣椒堿抗體，在渦旋儀上將溶液充分混勻后，將離心管放在混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育1h（室溫下即可）；封閉過程：抗體與膠體金偶聯(lián)1h后，拿下離心管，并且向離心管內(nèi)加入一定體積的封閉劑，在渦旋儀上將溶液充分混勻后，將離心管放在混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育0.5h（室溫下即可）；離心重懸：封閉過程完成后，將離心管從旋轉(zhuǎn)混合儀上取下進(jìn)行離心，離心之前需要遵循離心機(jī)對(duì)稱原則對(duì)離心管稱重，對(duì)稱放入高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，在11000r/min轉(zhuǎn)速下，溫度為4℃的條件下離心10min后取出，離心管內(nèi)的下層沉淀為金納米粒子與抗體的偶聯(lián)物，將全部沉淀吸出加入到事前準(zhǔn)備好的重懸液中，在渦旋儀上將溶液充分混勻30s；滴墊：以上所有步驟完成后，將重懸液以4μL/pad滴加到經(jīng)過預(yù)處理的金標(biāo)墊上，金標(biāo)墊放置在30℃恒溫烘箱內(nèi)烘干以供后續(xù)使用。2.3.7膠體金免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埛磻?yīng)體系優(yōu)化（1）金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)量?jī)?yōu)化辣椒堿抗體與金納米粒子偶聯(lián)物是影響膠體金試紙條靈敏度最關(guān)鍵的因素，一般來說，在偶聯(lián)過程中金納米粒子都是處于過量狀態(tài)，因此優(yōu)化辣椒堿抗體與金納米粒子的偶聯(lián)量關(guān)鍵在于優(yōu)化辣椒堿抗體體積，優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)為兼顧C(jī)、T線顯線強(qiáng)度與靈敏度，優(yōu)化方案如下：A.向三個(gè)1.5mL的離心管中加入1mL的膠體金溶液，再加入25μL0.1M碳酸鉀充分震蕩混勻30s，調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至7.5，再分別在向離心管中加入1μL、2μL和3μL的1mg/mL辣椒堿抗體，在渦旋儀上震蕩混勻30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育1h（室溫條件下即可）；B.偶聯(lián)1h后再向離心管中加入100μL10%BSA溶液封閉金納米粒子上的多余位點(diǎn)，在渦旋儀上充分震蕩30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育0.5h（室溫條件下即可）；C.封閉過程完成后，將離心管從旋轉(zhuǎn)混合儀上取下進(jìn)行離心，離心之前需要遵循離心機(jī)對(duì)稱原則對(duì)離心管稱重，對(duì)稱放入高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，在11000r/min轉(zhuǎn)速下，溫度為4℃的條件下離心10min后取出，離心管內(nèi)的下層沉淀為金納米粒子與抗體的偶聯(lián)物，將全部沉淀吸出加入到事前準(zhǔn)備好的100μL10%BSA重懸液中，在渦旋儀上將溶液充分混勻30s；D.將重懸好的沉淀液體以4μL/pad滴加到已經(jīng)過預(yù)處理的金標(biāo)墊上，金標(biāo)墊放置在30℃恒溫烘箱內(nèi)烘干備用；E.將完全烘干后的金標(biāo)墊按照試紙條組裝原理組裝好，將待測(cè)樣品滴加在樣品墊上，10min后比較這三組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（2）金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)pH優(yōu)化金納米粒子與蛋白質(zhì)結(jié)合通常是通過靜電吸附，疏水作用和配價(jià)作用，其原理為在于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與膠體金溶液的pH值之間的關(guān)系。金納米粒子表面帶負(fù)電，調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值可以使蛋白質(zhì)表現(xiàn)出整體正電局部負(fù)電的狀態(tài)這樣便于與金納米粒子通過靜電吸附和疏水作用偶聯(lián)結(jié)合，通常，在膠體金溶液的pH值接近或者稍高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)兩者之間的吸附最為穩(wěn)定，吸附力最強(qiáng)。因此一般調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值在7.0以上。具體優(yōu)化方案如下：A.向三個(gè)1.5mL的離心管中加入1mL的膠體金溶液，再分別加入20μL、30μL和40μL0.1M碳酸鉀充分震蕩混勻30s調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至7.0、8.0和9.0，再在向離心管中加入第一個(gè)優(yōu)化后選擇的辣椒堿抗體的量，在渦旋儀上震蕩混勻30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育1h（室溫條件下即可）；B.偶聯(lián)1h后再向離心管中加入100μL10%BSA溶液封閉金納米粒子上的多余位點(diǎn)，在渦旋儀上充分震蕩30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育0.5h（室溫條件下即可）；C.封閉過程完成后，將離心管從旋轉(zhuǎn)混合儀上取下進(jìn)行離心，離心之前需要遵循離心機(jī)對(duì)稱原則對(duì)離心管稱重，對(duì)稱放入高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，在11000r/min轉(zhuǎn)速下，溫度為4℃的條件下離心10min后取出，離心管內(nèi)的下層沉淀為金納米粒子與抗體的偶聯(lián)物，將全部沉淀吸出加入到事前準(zhǔn)備好的100μL10%BSA重懸液中，在渦旋儀上將溶液充分混勻30s；D.將重懸好的沉淀液體以4μL/pad滴加到已經(jīng)過預(yù)處理的金標(biāo)墊上，金標(biāo)墊放置在30℃恒溫烘箱內(nèi)烘干備用；E.將完全烘干后的金標(biāo)墊按照試紙條組裝原理組裝好，將待測(cè)樣品滴加在樣品墊上，10min后比較這三組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)重懸液優(yōu)化在金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)結(jié)合后經(jīng)過離心得到紫紅色沉淀物需要重懸液復(fù)溶，重懸液可以確保金標(biāo)沉淀物復(fù)溶后的穩(wěn)定性、金標(biāo)偶聯(lián)物放置在烘箱干燥后的穩(wěn)定性和確保金標(biāo)偶聯(lián)物在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間放置后檢測(cè)樣品時(shí)金標(biāo)墊上的偶聯(lián)物可以充分釋放且依然保持抗體的活性。因此重懸液的選擇對(duì)于免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埖姆€(wěn)定性尤為重要，具體優(yōu)化方案如下：A.向五個(gè)1.5mL的離心管中加入1mL的膠體金溶液，再加入一定量的碳酸鉀的體積充分震蕩混勻30s調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值，再在向離心管中加入一定量的辣椒堿抗體，在渦旋儀上震蕩混勻30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育1h（室溫條件下即可）；B.偶聯(lián)1h后再向離心管中加入100μL10%BSA溶液封閉金納米粒子上的多余位點(diǎn)，在渦旋儀上充分震蕩30s后，將離心管放置混合旋轉(zhuǎn)儀上搖晃孵育0.5h（室溫條件下即可）；C.封閉過程完成后，將離心管從旋轉(zhuǎn)混合儀上取下進(jìn)行離心，離心之前需要遵循離心機(jī)對(duì)稱原則對(duì)離心管稱重，對(duì)稱放入高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，在11000r/min轉(zhuǎn)速下，溫度為4℃的條件下離心10min后取出，離心管內(nèi)的下層沉淀為金納米粒子與抗體的偶聯(lián)物，將全部沉淀吸出加入到事前準(zhǔn)備好的100μL10%BSA，10%HSA，0.5%Na-Casein，0.5%Casein，0.5%OVA重懸液中，在渦旋儀上將溶液充分混勻30s；D.將重懸好的沉淀液體以4μL/pad滴加到已經(jīng)過預(yù)處理的金標(biāo)墊上，金標(biāo)墊放置在30℃恒溫烘箱內(nèi)烘干備用；E.將完全烘干后的金標(biāo)墊按照試紙條組裝原理組裝好，將待測(cè)樣品滴加在樣品墊上，10min后比較這五組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（4）樣品墊處理液成分的優(yōu)化通常在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)會(huì)出現(xiàn)待測(cè)樣品在樣品墊上的流動(dòng)不流暢，硝酸纖維素膜上的背景顏色偏紅或者C、T線的顯色不夠完整等等狀況，因此樣品墊的處理液的配方優(yōu)化至關(guān)重要。一般可以通過向樣品墊處理液中添加一定濃度的表面活性劑解決上述問題。表面活性劑是能夠吸附在溶液的表（界）面上，在低濃度時(shí)就能高效降低表（界）面張力，分為離子表面活性劑和非離子表現(xiàn)活性劑。不同的表面活性劑的功效也不盡相同，因此我們選用了最常用的四種非離子表面活性劑，具體優(yōu)化方案如下：A.配制4種不同的樣品墊處理液：①0.05MTris-HCl（pH8.0），0.15mMNaCl，0.25%曲拉通X-100，1%Tween80；0.05MTris-HCl（pH8.0），0.15mMNaCl，0.25%曲拉通X-100，1%Tween20；0.05MTris-HCl（pH8.0），0.15mMNaCl，0.25%曲拉通X-100，1%PEG20000；0.05MTris-HCl（pH8.0），0.15mMNaCl，0.25%曲拉通X-100，1%S9；B.將玻璃纖維素膜切成18mm×300mm的長(zhǎng)條形，將切好的樣品墊分別放入以上四種樣品墊處理液中充分浸泡，2h后取出樣品墊將其放置在37℃恒溫烘箱中過夜烘干；C.將烘干后的四種樣品墊按照試紙條組裝原理進(jìn)行組裝，得到完整試紙條后將待測(cè)樣品滴加在樣品墊上，10min后比較這四組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（5）上樣稀釋緩沖液的優(yōu)化由于從食用油中提取辣椒堿采用的是有機(jī)試劑提取法，利用辣椒堿可以很好地溶于甲醇這一特性，將甲醇與食用油按1:10的比例混合后離心取上層液體，此時(shí)上層液體是包含著辣椒堿的甲醇溶液，純度為100%的甲醇由于極性的關(guān)系不能直接在試紙條上直接上樣，因此需要有緩沖液稀釋甲醇降低極性使其可以直接在試紙條上流動(dòng)，不同的緩沖液對(duì)試紙條NC膜上的C、T線顯色的影響也不同，因此上樣稀釋緩沖液的選擇十分重要，具體優(yōu)化方案如下：A.取10mL待檢測(cè)的食用油油樣；量取1mL無(wú)水甲醇，加入到10mL油樣中，充分震蕩渦旋混合1min，將混合的油樣通過離心機(jī)以6000r/min速率離心10min；B.離心完成后，吸取上層甲醇相溶液20μL，分別加入到80μL0.01MpH7.4PB緩沖液、0.01MpH8.0Tris-HCl、0.01MpH7.4PBS和0.01MpH7.4RunningBuffer四種稀釋緩沖液中，充分混合均勻后，取80μL，滴加到辣椒素膠體金試紙條的加樣孔內(nèi)。C.將溫育器溫度設(shè)定為37℃，將加樣的辣椒素膠體金試紙條置于孵育器中溫育10min。D.溫育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)，比較這四組辣椒素膠體金試紙條上的顯色結(jié)果。2.3.8特異性檢測(cè)為了確定該試紙條的特異性，本文選取了地溝油中可能存在的幾種物質(zhì)，分別為二噁英（Dioxin），黃曲霉毒素B1（AFB1），嘔吐毒素（DON），苯并芘（BAP），辣椒堿（Capsaicin）以及上述幾種物質(zhì)的混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS），滴加到組裝好的增敏型免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰堖M(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試時(shí)長(zhǎng)10分鐘，觀察試紙條C線和T線顯示結(jié)果，測(cè)試完成后相機(jī)拍攝記錄結(jié)果。2.3.9試紙條的檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線建立用膠體金免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測(cè)食用油中的辣椒堿時(shí)，肉眼直接觀測(cè)NC膜上的C、T線顯色結(jié)果，可以對(duì)食用油中辣椒堿的含量進(jìn)行半定量檢測(cè)，判斷檢測(cè)樣品中是否含有辣椒堿目標(biāo)物。如果對(duì)試紙條的檢測(cè)結(jié)果用照相機(jī)進(jìn)行拍攝記錄后再用用ImageJ軟件掃描該圖片，便可對(duì)食用油中辣椒堿的含量進(jìn)行定量檢測(cè)。具體步驟如下：（1）將優(yōu)化組裝好的膠體金試紙條整齊放在塑膠板上，每根試紙條之間需要有一定的間隙以免每根試紙條之間的待測(cè)液體相互干擾。將辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)品用金龍魚1:1:1調(diào)和油進(jìn)行溶解至濃度為100ppm，在渦旋儀上充分震蕩3min使辣椒堿完全溶于食用油中，再將含有100ppm辣椒堿的食用油繼續(xù)用金龍魚1:1:1調(diào)和油進(jìn)行稀釋至濃度為0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、75μg/L、100μg/L、150μg/L；（2）按2.34中食用油中辣椒堿的提取步驟，將提取出的甲醇液體與稀釋緩沖液混合后濃度由低至高分別吸取80μL待測(cè)液，進(jìn)行試紙條上樣，將溫育器溫度設(shè)定為37℃，將加樣的辣椒素膠體金試紙條置于孵育器中溫育10min。溫育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)，對(duì)辣椒素膠體金試紙條上的C、T線顯色結(jié)果進(jìn)行觀測(cè)。（3）觀測(cè)完成后，用單反相機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照記錄，將拍照結(jié)果導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，用ImageJ軟件對(duì)拍照結(jié)果掃描，得到C、T線灰度值；（4）將T線灰度值和所對(duì)應(yīng)濃度用Origin軟件處理，做出關(guān)于灰度值和濃度值相關(guān)的辣椒堿檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2.4結(jié)果與討論2.4.1金納米粒子制備及與抗體偶聯(lián)表征結(jié)果圖2.SEQ圖2.\*ARABIC2金納米粒子與抗體偶聯(lián)表征圖Fig2.2Characterizationofgoldnanoparticles-antibody圖2.2為金納米粒子與辣椒堿抗體標(biāo)記物的瓊脂糖凝膠電泳表征圖。泳道1是單獨(dú)的金納米粒子，泳道2是金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)物。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不同大小的物質(zhì)分子通過時(shí)受到的阻力大小也不相同，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，大分子物質(zhì)在瓊脂糖凝膠電泳的泳道中遷移速度會(huì)比小分子物質(zhì)慢，因此來區(qū)別兩種不同分子大小的物質(zhì)。由圖2.2可以看出泳道1和2的遷移速度明顯不同，說明金納米粒子和抗體偶聯(lián)物成功偶聯(lián)在一起。2.4.2金納米粒子與萊克多巴胺抗體偶聯(lián)量?jī)?yōu)化試紙結(jié)果圖2.SEQ圖2.\*ARABIC3抗體標(biāo)記量?jī)?yōu)化Fig2.3OptimizationofthevolumesoftheCAPantibody圖2.3是金納米粒子與不同體積辣椒堿抗體偶聯(lián)的試紙條優(yōu)化結(jié)果圖。由試紙條結(jié)果可以看出隨著辣椒堿抗體量的增多，NC膜上T線的強(qiáng)度越強(qiáng)，但隨之靈敏度也逐漸降低，在保證陰性T線的顯色度同時(shí)也確保試紙條的靈敏度，因此選擇辣椒堿抗體的體積為2μL為最終優(yōu)化抗體量的結(jié)果。2.4.3偶聯(lián)時(shí)碳酸鉀添加量?jī)?yōu)化試紙結(jié)果圖2.SEQ圖2.\*ARABIC4碳酸鉀添加量?jī)?yōu)化Fig2.4OptimizationofthevolumesofK2CO3圖2.4是金納米粒子與辣椒堿單克隆抗體偶聯(lián)是加入碳酸鉀溶液體積優(yōu)化結(jié)果，溶液的pH值分別為7.0，7.5，8.0。由圖中試紙條結(jié)果可以看出隨著溶液pH值的變大，C線的顯色強(qiáng)度基本保持不變但T線的顯色強(qiáng)度會(huì)隨之變?nèi)?，在保證陰性T線的顯色度同時(shí)也確保試紙條的靈敏度，因此選擇溶液pH值為7.5作為優(yōu)化碳酸鉀的體積的最終結(jié)果，此時(shí)溶液的pH值可以有效減少后續(xù)上樣時(shí)樣品中的雜質(zhì)與金標(biāo)抗體的非特異性吸附，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.4.4偶聯(lián)后重懸液種類優(yōu)化試紙結(jié)果圖2.SEQ圖2.\*ARABIC5重懸液的優(yōu)化Fig2.5Optimizationofthetypesofblockingagent圖2.5是金納米粒子與辣椒堿抗體偶聯(lián)離心后重懸液的選擇，將五種不同的重懸液的試紙條檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，可以看出金標(biāo)墊上的金標(biāo)偶聯(lián)物的釋放狀態(tài)都很好，沒有出現(xiàn)金標(biāo)墊或者NC膜上有金標(biāo)粒子堆積的情況，C線和T線的出線顏色都十分完整，顏色均一。但是重懸液OVA的試紙條在陰性顯色深度與其他四組基本一致的情況下，靈敏度卻明顯優(yōu)于其他四組，因此選擇OVA溶液作為膠體金試紙條的重懸液。2.4.5樣品墊處理液成分的優(yōu)化圖2.SEQ圖2.\*ARABIC6樣品墊處理液成分的優(yōu)化標(biāo)Fig2.6Optimizationofcompositionoftreatmentfluid圖2.6是不同成分樣品墊處理液成分優(yōu)化結(jié)果，這四種樣品墊處理液的主要成分相同，不同的是加入了性能不同的表面活性劑。其中①中含有總濃度為1%Tween80，②含有總濃度為1%Tween20，③含有總濃度為1%S9④含有總濃度為1%PEG20000。從圖中四種不同樣品墊的試紙條結(jié)果可以看出，樣品墊處理液對(duì)結(jié)果的影響十分明顯，適合的樣品墊可以在加強(qiáng)陰性強(qiáng)度的同時(shí)提高試紙條檢測(cè)線的靈敏度。四種樣品墊中含有總濃度為1%S9的樣品墊靈敏度最好且陰性顯色結(jié)果最強(qiáng)，而且沒有背景殘留的現(xiàn)象，因此選擇含有1%S9的樣品墊處理液作為最終選擇。2.4.7上樣稀釋緩沖液的優(yōu)化圖2.7上樣稀釋緩沖液的優(yōu)化標(biāo)Fig2.7OptimizationofSampledilutionbuffer圖2.7是上樣稀釋緩沖液的優(yōu)化的試紙條結(jié)果，緩沖液中的成分十分復(fù)雜，不同的上樣緩沖液有不同的離子濃度和不同的pH環(huán)境，正是由于這復(fù)雜的緩沖體系極大影響了上樣稀釋緩沖液與金標(biāo)偶聯(lián)物的結(jié)合和金標(biāo)偶聯(lián)物在上樣緩沖液中的活性大小。因此上樣稀釋緩沖液的選擇至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)選擇了最常用的三種緩沖液分別為0.01MpH7.4PB緩沖液、0.01MpH8.0Tris-HCl、0.01MpH7.4PBS緩沖液和pH6.2RunningBuffer，有試紙條檢測(cè)結(jié)果可知0.01MpH7.4PB緩沖液、0.01MpH8.0Tris-HCl和pH6.2RunningBuffer對(duì)于金標(biāo)墊釋放雖然沒有影響但是卻阻礙了金標(biāo)抗體與NC膜上T線中的抗原的結(jié)合導(dǎo)致T線不顯色，而0.01MpH7.4PBS緩沖液可以很好的維持了試紙條結(jié)果的穩(wěn)定性，T、C線的顯色完整且均一，因此0.01MpH7.4PBS緩沖液是最佳的上樣稀釋緩沖液。2.4.7特異性檢測(cè)試紙結(jié)果圖2.8特異性檢測(cè)Figure2.7Specifictestingwiththismethod圖2.8是膠體金試紙條的特異性檢測(cè)結(jié)果，為了確定該試紙條的特異性，本實(shí)驗(yàn)特意選取了地溝油中可能存在的幾種物質(zhì)，分別為二噁英（Dioxin），黃曲霉毒素B1（AFB1），嘔吐毒素（DON），苯并芘（BAP），辣椒堿（Capsaicin）以及上述幾種物質(zhì)的混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖溶液（pH7.40.01MPBS），結(jié)果上述圖片所示，由圖2.8.a可知只有在辣椒堿存在的情況下，辣椒堿試紙條T線會(huì)消線，只有C線存在；其余條件時(shí)T線和C線兩條線均存在。圖2.8.b和2.8.c分別是根據(jù)圖2.8.a中T線處信號(hào)強(qiáng)度的峰面積得出的灰度掃描圖和特異性柱狀圖，表明了辣椒堿膠體金試紙條具有極好的特異性。2.4.7試紙條的檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線建立圖2.9傳統(tǒng)型試紙條檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig2.8Thedetectionandestablishthestandardcurveoftraditionalstrip由圖2.9是根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)步驟所得到的最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)結(jié)果結(jié)合得到的試紙條檢測(cè)結(jié)果，由試紙條結(jié)果可以看出，隨著檢測(cè)樣品中辣椒堿含量的增加，試紙條上的檢測(cè)線（T線）的顏色就會(huì)隨之變淺，當(dāng)樣品中的濃度為50μg/L的時(shí)候,就可以明顯看出該濃度檢測(cè)線顏色與陰性樣本檢測(cè)線顏色的差異，因此可以判斷該樣品中含有少量辣椒堿，當(dāng)樣品中的辣椒堿濃度達(dá)到100μg/L，試紙條不再出現(xiàn)檢測(cè)線。由圖中2.9.b是試紙條NC膜上T、C線由軟件ImageJ掃描得出的結(jié)果，可知隨著樣品濃度的增大，檢測(cè)線（T線）的峰值面積越來越小，在75μg/L處時(shí)檢測(cè)線的峰面積顯著減小，并且在100μg/L峰面積基本為零，這與圖2.8.a中肉眼觀察試紙條結(jié)果檢測(cè)線變化趨勢(shì)保持一致，進(jìn)一步說明了在辣椒堿含量為100μg/L時(shí)可以用該試紙條通過肉眼判定檢測(cè)結(jié)果。圖2.9.c是由b圖中T線的峰面積的值與檢測(cè)樣品中辣椒堿的濃度繪制的線性曲線圖，表明隨著檢測(cè)樣品中的辣椒堿濃度的逐漸增加，檢測(cè)線的峰面積也對(duì)應(yīng)著逐漸減小，線性曲線圖結(jié)果符合辣椒堿試紙條的檢測(cè)原理，而且可以看出在一定的范圍內(nèi)兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.9935）。2.5小結(jié)綜上可知，基于利用競(jìng)爭(zhēng)法原理的膠體金方法的免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)食用油中的辣椒堿的方法是完全可行的。金納米粒子和辣椒堿單克