第四章生產(chǎn)菌種的制備和保藏生產(chǎn)菌種的制備過程生產(chǎn)菌種的保藏生產(chǎn)菌種的質(zhì)量限制

第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程菌種→母斜面→子斜面→搖瓶菌絲→種子罐→發(fā)酵罐

試驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培育箱、搖床等試驗室常見設(shè)備，在工廠這些培育過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培育過程稱為試驗室階段的種子培育。生產(chǎn)車間階段：種子培育在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培育過程為生產(chǎn)車間階段。種子擴(kuò)大培育是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培育,最終獲得確定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培育物稱為種子。種子擴(kuò)培的目的接種量的須要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個體與群體活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠快速生長

無雜菌污染一、孢子的制備放線菌孢子的制備：養(yǎng)分要求：養(yǎng)分物質(zhì)含量要低，特殊是氮源培育基：瓊脂斜面培育基培育溫度：28~37℃培育時間：5~14天斜面含水量：低

棒狀鏈霉菌成熟單菌落生長豐滿，緊密，菌落呈草帽形，中間突起，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子為暗灰綠色，成熟后，孢子易于刮下棒狀鏈霉菌動身菌株單菌落形態(tài)特征棒狀鏈霉菌斜面一般培育四到五天左右產(chǎn)生孢子，六到七天斜面孢子生長成熟，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子呈暗灰綠色棒狀鏈霉菌動身菌株的斜面培育特征霉菌孢子的制備：養(yǎng)分要求：碳、氮含量要低，無機(jī)鹽適量培育基：自然農(nóng)產(chǎn)品培育溫度：25~28℃培育時間：4~14天

細(xì)菌種子的制備：養(yǎng)分要求：養(yǎng)分豐富，氮源含量要高培育基：牛肉膏、蛋白胨培育溫度：37℃培育時間：1~2天（芽孢5~8天）二、搖瓶種子的制備一級搖瓶→二級搖瓶→種子罐三、種子罐種子的制備一級種子罐→二級種子罐→發(fā)酵罐（三級發(fā)酵）級數(shù)的確定：菌種的特性；發(fā)酵罐的體積谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵一般由菌絲體培育起先計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐起先計算發(fā)酵級數(shù)。發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)

級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響級數(shù)大，難限制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是特殊重要的一個方面四、種子制備過程舉例1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培育→二級種子培育→發(fā)酵斜面(AS1.299)培育基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，pH7.0-7.2培育基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)培育條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所運用斜面連續(xù)傳代不超過3次一級種子（搖瓶）培育條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時培育基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培育基特點：有利于菌體的生長，所運用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培育基二級種子(種子罐)培育條件：在種子罐中培育（容積為發(fā)酵罐的1%），32℃培育7-10個小時培育基：和一級種子相像，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培育基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培育基種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小勻整，呈單個或八字排列pH7.0-7.2時結(jié)束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛2、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵斜面孢子培育基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培育基特點：有利于長孢子，用量少而精細(xì)培育條件：25℃、7天,留意濕度50%左右大米孢子培育基：大米及氮源（玉米漿）培育基的特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，養(yǎng)分適當(dāng)（要求大米的白點小）有利于孢子的生長。培育條件：25℃、7天，限制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子一級種子培育基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌體培育條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸二級種子培育基：同上培育條件：27℃、10-14小時接種量：10%種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的實力最強(qiáng)其次節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量限制一、影響孢子質(zhì)量的因素1.培育基養(yǎng)分成分滅菌的質(zhì)量斜面培育基的含水量2.培育溫度和濕度的影響菌體生長溫度范圍寬些28~37℃，孢子形成溫度窄27、28℃3.培育時間過短：孢子不成熟；低溫保藏時、易死亡過長：菌體代謝活力降低，產(chǎn)量低4.保藏時間一般不超過一星期5.接種量在母斜面上形成單菌落，在子斜面上形成一層菌落二、影響種子質(zhì)量的因素及限制措施1.影響因素：①培育基②培育條件③培育時間最適種齡：對數(shù)生長期后期

種齡是指種子罐中培育的菌體起先移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培育時間。原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對較大，但是最終由試驗結(jié)果定。菌齡過小：延遲期長，菌體生長緩慢，生物合成期縮短，產(chǎn)量降低種齡長：易老化④接種量接入種子液的體積接入后培育液體積接種量范圍：1~25%，但是一般認(rèn)為大一點好過大：菌體過度生長，養(yǎng)分物質(zhì)及溶氧不能滿足菌體須要，使菌體蒼老、自溶過小：生產(chǎn)期延長，以產(chǎn)生菌絲結(jié)團(tuán)，產(chǎn)量降低接種量=×100%雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。2.種子質(zhì)量的限制指標(biāo)菌體的形態(tài)碳、氮、磷的代謝狀況菌株的生產(chǎn)實力特殊酶活力3.種子異樣分析菌絲生長過慢：培育基質(zhì)量不好；滅菌質(zhì)量不好；通入空氣的溫度過低菌絲結(jié)團(tuán)：接種量?。慌嘤扯炔划?dāng)；攪拌不好菌絲粘壁：攪拌不好；裝料系數(shù)少；泡沫多第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏一、微生物菌種的保藏要求要求：①是廣泛收集各種探討、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，滿足各方面需求；②高質(zhì)量保藏，即要求保藏的菌種不死亡、活性不蒼老、特性不變異、分類不紊亂；③隨時可供應(yīng)保持有原始特性的菌種用于交換和運用。二、菌種保藏原理原理：將微生物菌種保存在不利于微生物活躍生長和代謝的不良環(huán)境中，如干燥、低溫、缺氧、黑暗、養(yǎng)分饑餓等等，使微生物代謝速率極為緩慢或處于休眠狀態(tài)。而一旦復(fù)原所保存菌種生長的正常環(huán)境和養(yǎng)分條件，即可獲得具有高生理活性和保持原種優(yōu)良性狀的菌種培育物。三、微生物菌種保藏的常用方法菌種保藏的方法有多種多樣，常用方法簡介如下：

1、斜面低溫保藏法

2、

液體石蠟封藏法

3、

沙土管保藏法

4、甘油低溫保存法

5、真空冷凍干燥保藏法

6、液氮超低溫保藏法

1、斜面低溫保藏法

4℃保存，1~3月2、

液體石蠟封藏法石蠟→滅菌→冷卻→加入試管中

3、

沙土管保藏法

1mol/L酸洗→1mol/L堿洗→蒸餾水洗→烘干→過篩→混合（3：2或1：1）→分裝沙土管→

干接法：接孢子后，低溫抽真空濕接法：接孢子懸液后，低溫抽真空取沙取土（沙:20~40目）（土:40~60目）4、

甘油低溫保藏法

等體積混合→-20℃以下保存孢子懸液或菌體30~40%甘油

假如待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培育基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般限制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培育物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必需運用冷凍疼惜劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有應(yīng)用動物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不丟失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運輸。5、真空冷凍干燥保藏法

等體積混合→分裝凍干管→冷凍至15℃以下→抽真空→封口→低溫保存脫脂牛奶孢子懸液（洗凈）凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培育物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培育物的長期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿．(3)在安瓿中加入0.5～1ml養(yǎng)分液體培育基，漸漸旋轉(zhuǎn)安瓿。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培育基的無菌試管中，或干脆接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此干脆振落入盛有l(wèi)～2ml液體培育基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培育基。6、液氮超低溫保藏法

10%甘油懸液→降溫至0℃→緩慢降溫至-35℃→放入液氮缸中→

液相：-196℃

（氣相：-150℃

）孢子懸液、(一)冷凍疼惜劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍疼惜劑是二甲亞砜和甘油，最終運用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所運用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟1．待冷凍保藏菌種懸液的制備(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的養(yǎng)分液體培育；吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，(2)從浸沒培育物制備菌懸液：在浸沒培育液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培育液，假如菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將全部封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培育基之間達(dá)到平衡。

2．控速冷凍(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加確定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點時盡可能快地發(fā)生相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿快速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。假如無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后快速移入液氮罐中保存。(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立刻置于冰浴中；2．快速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動以加速解凍；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培育物移接入含有2ml無菌液體培育基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。常用菌種保藏方法的比較方法原理適宜菌種保藏時間特點冰箱低溫（4℃）低溫各大類微生物3-6個月簡便石蠟油封藏低溫、缺氧各大類微生物1-2年簡便砂土保藏干燥、無營養(yǎng)產(chǎn)芽孢細(xì)菌、產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌1-10年簡便有效冷凍干燥保藏干燥、低溫、無氧各大類微生物5-15年以上繁而高效基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜