實驗五細菌的革蘭氏染色第一頁，共十四頁，2022年，8月28日一、實驗?zāi)康牧私飧锾m氏染色法的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色方法。第二頁，共十四頁，2022年，8月28日二、實驗原理：細菌的涂片和染色是微生物學(xué)實驗中的一項基本技術(shù)。細菌的細胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。常用堿性染料進行簡單染色，這是因為細菌的等電點較低，約在pH2～5之間，故在中性、堿性或弱堿性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負電荷，易與帶正電荷的堿性染料如結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃（番紅）等結(jié)合，使細菌被染成紫色或紅色。第三頁，共十四頁，2022年，8月28日

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。

第四頁，共十四頁，2022年，8月28日G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細胞膜上，因此細菌仍保留初染時的顏色紫色。第五頁，共十四頁，2022年，8月28日三、實驗儀器及材料1.儀器：顯微鏡、酒精燈等2.實驗材料：菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌染色劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、番紅、95%乙醇

第六頁，共十四頁，2022年，8月28日四、實驗內(nèi)容與步驟革蘭氏染色流程圖涂片干燥結(jié)晶紫染色碘液媒染水洗95%酒精脫色水洗番紅染色水洗晾干鏡檢固定水洗

第七頁，共十四頁，2022年，8月28日1．涂片

取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥

涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。第八頁，共十四頁，2022年，8月28日3．固定

固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。4．初染用草酸銨結(jié)晶紫染色1-2min后傾去染液，水洗至流出水無色。5、媒染先用碘液沖去殘留水跡，再加碘液覆蓋媒染1min后水洗。6．脫色

斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。第九頁，共十四頁，2022年，8月28日7．復(fù)染將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅染液復(fù)染1min，水洗，吸去殘水晾干。8、鏡檢

待標本片置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。繪出細菌的形態(tài)圖并說明革蘭氏染色的結(jié)果。9.混合涂片染色第十頁，共十四頁，2022年，8月28日注意事項：

1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。

2.菌齡也有影響。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。

3.不要涂片太厚，會造成假陰性或假陽性。

第十一頁，共十四頁，2022年，8月28日五、實驗結(jié)果：紫色菌：革蘭氏陽性菌紅色菌：革蘭氏陰性菌第十二頁，共十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共十四頁，20