動(dòng)物行為學(xué)的研究方法第一節(jié)

概述行為是基因與環(huán)境相互作用的結(jié)果?；虻淖兓ㄈ甾D(zhuǎn)基因，基因敲除或下調(diào)等）最終表現(xiàn)為與基因相關(guān)的行為變化；環(huán)境的變化（如聲、光、電的刺激和藥物的處理）不僅其本身可直接影響動(dòng)物的行為，而且可通過對(duì)相關(guān)基因的影響而改變動(dòng)物的行為。學(xué)習(xí)和記憶更是這種相關(guān)基因與環(huán)境相互作用的行為表現(xiàn)的一種形式。學(xué)習(xí)是一個(gè)獲得外界環(huán)境信息（對(duì)動(dòng)物而言）或有關(guān)世界知識(shí)（對(duì)人類而言）的過程；記憶則是對(duì)這種信息或知識(shí)進(jìn)行加工（encoding）、儲(chǔ)存（storage）和再現(xiàn)（retrieval）的過程。人類的記憶復(fù)雜，包括對(duì)事件與物體的明晰記憶（explicitmemory）或描述性記憶（declarativememory）和與學(xué)習(xí)無關(guān)（如適應(yīng)性和敏感性）或有關(guān)（如操作技術(shù)和習(xí)慣養(yǎng)成）的模糊記憶（implicitmemory）或非描述性記憶（nondeclarativememory）。而動(dòng)物記憶相對(duì)較為簡(jiǎn)單，包括短期記憶（shorttermmemory）和長(zhǎng)期記憶(long-termmemory)；前者一般持續(xù)幾分鐘到幾小時(shí)，后者則持續(xù)24小時(shí)到數(shù)天.數(shù)周甚至更長(zhǎng)時(shí)間。與此相對(duì)應(yīng)得是工作記憶(workingmemory)和參考記憶(referencememory)。工作記憶是將獲得的信息進(jìn)行加工并儲(chǔ)存較短的時(shí)間，因而代表短期記憶；參考記憶是指對(duì)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中（測(cè)試的任何一天）均有用的信息進(jìn)行加工儲(chǔ)存的過程，因而代表長(zhǎng)期記憶。記憶的腦機(jī)制非常復(fù)雜，迄今仍不清楚。早在20世紀(jì)40年代末，著名神經(jīng)外科醫(yī)生WilderPenfield第一個(gè)獲得證據(jù)表明，記憶的加工可能是在人腦的某些特殊部位進(jìn)行。他從上千例的病人觀察到，電刺激病人的腦顳葉皮層（temporallobes）會(huì)產(chǎn)生一連串對(duì)早期經(jīng)驗(yàn)的回憶，病人稱之為“經(jīng)驗(yàn)反應(yīng)”（experientialresponse）。幾年后一次偶然的機(jī)會(huì)，為了給一個(gè)患癲癇長(zhǎng)達(dá)10年的病人施行腦手術(shù)治療，Penfield將病人雙側(cè)的海馬·杏仁核和部分顳葉皮層切除。術(shù)后發(fā)現(xiàn)，病人的癲癇癥狀大為改善。但出乎意料的是，病人的記憶同時(shí)受到破壞性的損害。雖然病人保留了幾秒到幾分鐘的短期記憶，且對(duì)手術(shù)前的事件有非常好的“長(zhǎng)期記憶”，但是，他卻不能將短期記憶轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)期記憶。對(duì)人·地點(diǎn)或物體等信息的保持不超過一分鐘。而且，他的空間定位能力也大大受到削弱，甚至花了長(zhǎng)達(dá)一年時(shí)間才學(xué)會(huì)走一條圍繞一棟新房的路而不至迷路。事實(shí)上，所有因手術(shù)或疾病使內(nèi)側(cè)顳葉的邊緣結(jié)構(gòu)受到廣泛損害的病人都具有類似的記憶缺陷。這些結(jié)果說明，大腦邊緣系統(tǒng)在記憶調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。此后近半個(gè)世紀(jì)的研究表明，腦內(nèi)至少存在5個(gè)不同的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)相對(duì)特異性地參與學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)，包括海馬、杏仁核、皮層（尤其是鼻周皮層，perirhinalcortex）、小腦和背側(cè)紋狀體。針對(duì)這些腦結(jié)構(gòu)建立了相應(yīng)的具有一定特異性地學(xué)習(xí)記憶的行為測(cè)定方法。海馬是空間記憶的最重要的調(diào)節(jié)腦區(qū)，同時(shí)也參與情緒記憶的調(diào)節(jié)。毀損海馬回導(dǎo)致空間記憶的完全缺失，情緒記憶也會(huì)減弱，但不會(huì)完全消失。這是因?yàn)榍榫w記憶主要由杏仁核調(diào)節(jié)。測(cè)定杏仁核依賴的記憶主要用條件恐懼（fearconditioning）法；而測(cè)定海馬依賴的記憶方法則很多，包括各種迷宮和抑制性回避(inhibitoryavoidance)實(shí)驗(yàn)等。鼻周皮層是調(diào)節(jié)視覺物體記憶（visualobjectmemory）的特異性鬧區(qū)，常用物體認(rèn)知模型（objectrecognition）檢測(cè)。小腦是調(diào)節(jié)與骨骼肌反應(yīng)有關(guān)的經(jīng)典反射的特異性腦結(jié)構(gòu)，眨眼反應(yīng)（eyeblinkconditioning）模型對(duì)小腦依賴的記憶有很高的特異性。紋狀體對(duì)刺激-反應(yīng)習(xí)慣（stimulus-responsehabit）的學(xué)習(xí)記憶過程其重要作用，主要調(diào)節(jié)與藥物濫用有關(guān)的學(xué)習(xí)記憶。測(cè)定紋狀體記憶的方法很少，目前主要用贏-留放射臂迷宮（win-stayradialarmmaze）法。紋狀體毀損會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物在這一模型上的記憶操作障礙，而毀損海馬或杏仁核對(duì)這種記憶沒有明顯影響。說明贏-留放射臂迷宮法對(duì)紋狀體記憶具有特異性。盡管記憶的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，但越來越多的證據(jù)表明，環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（cyclicAMP-proteinkinaseA,Camp-PKA）信號(hào)系統(tǒng)對(duì)記憶起著重要的調(diào)節(jié)作用。激活與刺激性G蛋白（Gs）相偶聯(lián)的受體會(huì)刺激腺苷酸化酶的活性，因而使cAMP形成增多，并激活PKA.PKA使cAMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白（cAMP-responsive-element-bindingprotein,CREB）磷酸化并激活，從而促進(jìn)與記憶相關(guān)的基因表達(dá)，最終使記憶增強(qiáng)。此外，分裂素激活蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogenactivatedproteinkinase,MAPK/extracellularsignal-regulatedkinase,ERK）信號(hào)通路也以類似的磷酸化方式調(diào)節(jié)CREB的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)記憶。因此，除了用腦部結(jié)構(gòu)毀損的方法從解剖上去除某一特定的腦內(nèi)結(jié)構(gòu)對(duì)記憶的調(diào)節(jié)功能以外，凡是能影響上述信號(hào)通路功能的藥物（如NMDA受體拮抗劑MK-801和MEK抑制劑U0126減弱記憶；4-型磷酸二脂酶（type-4phosphodiesterase,PDE4）抑制劑則增強(qiáng)記憶）或有關(guān)的處理（如轉(zhuǎn)基因或基因敲除或下調(diào)）均可影響學(xué)習(xí)記憶過程。學(xué)習(xí)記憶研究是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)界最為熱門的領(lǐng)域之一。這方面的發(fā)展可謂日新月異。新的或經(jīng)改良的研究方法和手段層出不窮。因此，本章不可能把所有有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的研究方法逐一進(jìn)行描述，只是選擇一些有代表性的常用方法加以介紹。此外，所用儀器設(shè)備也不只局限于本章所介紹的內(nèi)容。在同一實(shí)驗(yàn)中，不同實(shí)驗(yàn)室所用儀器設(shè)備會(huì)有所不同，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該一致。第二節(jié)

迷宮一、Morris水迷宮本實(shí)驗(yàn)由美國(guó)科學(xué)家RichardGMMorris于1981年建立。最初用于研究腦內(nèi)結(jié)構(gòu)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)節(jié)作用，后來逐步發(fā)展成為目前最為常用的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶的模型。這一實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是，嚙齒類動(dòng)物在水中有強(qiáng)烈的逃避水環(huán)境的動(dòng)機(jī)，并以最快、最直接的途徑逃離水環(huán)境。學(xué)會(huì)逃避水環(huán)境的過程體現(xiàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力；根據(jù)周圍環(huán)境進(jìn)行空間定位，有目的地游往水中安全的地方（平臺(tái)），體現(xiàn)動(dòng)物的空間記憶能力。（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)備實(shí)驗(yàn)用大鼠或小鼠進(jìn)行。大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備由上海欣軟信息科技有限公司制作，包括一個(gè)灰色或黑色圓形水池（直徑200cm，高100cm；小鼠規(guī)格尺寸減半）、一個(gè)平臺(tái)（直徑10cm）、一臺(tái)跟蹤攝像機(jī)以及攝像機(jī)相聯(lián)的計(jì)算機(jī)（圖25-1）。池內(nèi)盛水，深50cm，水溫為攝氏22~24℃。平臺(tái)置于水面下2cm（小鼠為1cm）。在水中加入奶粉或牛奶將水?dāng)嚋喴悦庾寗?dòng)物看清水下平臺(tái)。攝像機(jī)位于水池中央上方200cm，可記錄動(dòng)物的位置、游泳距離和時(shí)間（從而可計(jì)算出游泳速度）以及游泳路徑等。房間周圍墻壁上貼上色彩鮮明、形狀不同的圖畫用為迷宮外暗示（extra-mazecues）。（二）實(shí)驗(yàn)方法分獲得性訓(xùn)練、探查和對(duì)位訓(xùn)練3個(gè)過程。1．獲得性訓(xùn)練（Acquisitionphase）理論上將水池分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于其中一個(gè)象限區(qū)的中央。（1）將動(dòng)物（大鼠或小鼠）頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北四個(gè)起始位置之一。記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間（s）。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個(gè)時(shí)間超過60s，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺(tái)。讓動(dòng)物在平臺(tái)上停留10s.（2）將動(dòng)物移開、擦干。必要時(shí)將動(dòng)物（尤其是大鼠）放在150W的白熾燈下烤5min，放回籠內(nèi)。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔15~20min,連續(xù)訓(xùn)練5d。2．探查訓(xùn)練(probetrial1)

最后一次獲得性訓(xùn)練結(jié)束后的第二天，將平臺(tái)撤除，開始60s的探查訓(xùn)練。將動(dòng)物由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限（原先放置平臺(tái)的象限）所花的時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。3．對(duì)位訓(xùn)練（reveralphase）

測(cè)定動(dòng)物的工作記憶（workingmemory）。探查訓(xùn)練結(jié)束后的第二天，開始維持4天的對(duì)位訓(xùn)練。將平臺(tái)放在原先平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限，方法與獲得性訓(xùn)練相同。每天訓(xùn)練4次。每次記錄找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳距離以及游泳速度。4．對(duì)位探查訓(xùn)練（probetrial2）最后一次對(duì)位訓(xùn)練的第二天進(jìn)行。方法與上述探查訓(xùn)練類似。記錄動(dòng)物60s內(nèi)動(dòng)物在目標(biāo)象限（平臺(tái)第二次所在區(qū)）所花時(shí)間和進(jìn)入該區(qū)的次數(shù)。（三）注意事項(xiàng)1．對(duì)比食物驅(qū)動(dòng)的模型（如放射臂迷宮），水迷宮實(shí)驗(yàn)的最大優(yōu)點(diǎn)在于，動(dòng)物具有更大的、逃離水環(huán)境的動(dòng)機(jī)。而且不必禁食，特別適合老年動(dòng)物的測(cè)試。加上它對(duì)衰老引起的記憶減弱尤其敏感，因此，水迷宮最常用于老年動(dòng)物記憶的研究。2．如用小鼠，除游泳池尺寸約為大鼠的50%以外，平臺(tái)直徑也較少（7.5cm）。實(shí)驗(yàn)方法與大鼠類似，但訓(xùn)練周期較短。一般獲得性訓(xùn)練3天共訓(xùn)16次（第一天4次，后兩天每天6次；兩次訓(xùn)練之間的間隔5~10min，第四天為探查訓(xùn)練，第五、六天為對(duì)位訓(xùn)練，每天訓(xùn)練六次，第七天為第二次探查訓(xùn)練。3.如用肉眼觀察，在所有試驗(yàn)過程中試驗(yàn)著始終坐在同一位置，距離泳池最近的邊緣約60cm。4．每天在固定時(shí)間測(cè)試。操作輕柔，避免不必要的應(yīng)激刺激。5．當(dāng)與其他同類實(shí)驗(yàn)相比較時(shí)，要注意到動(dòng)物的性別、品系、泳池的尺寸和水溫等多種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。此外，當(dāng)以游泳速度作為觀察指標(biāo)時(shí)，要考慮到動(dòng)物的體重、年齡以及骨骼肌發(fā)育狀況等對(duì)游泳速度可能造成影響。6．用老年動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)確認(rèn)動(dòng)物的游泳能力和視力不因年齡增大而影響行為操作。其方法如下：將平臺(tái)露出水面以使動(dòng)物能夠看見平臺(tái)。動(dòng)物放入泳池后如毫無困難地直接游向平臺(tái)，說明動(dòng)物的游泳能力和視力均正常，可以開始實(shí)驗(yàn)。7．游泳對(duì)動(dòng)物是一個(gè)較大的應(yīng)激刺激，可引起神經(jīng)內(nèi)分泌的變化。這些變化可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。對(duì)老年動(dòng)物，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)心血管疾病而導(dǎo)致卒中甚至死亡。因此，必要時(shí)可將動(dòng)物多次放入泳池或適當(dāng)延長(zhǎng)其游泳時(shí)間以增加動(dòng)物對(duì)游泳的適應(yīng)能力。8．當(dāng)用牛奶或奶粉攪渾泳池的水時(shí)，要定期換水以免水腐敗變質(zhì)；如用白漆達(dá)到同樣目的時(shí)，必須確保白漆對(duì)動(dòng)物沒有毒性。二、

放射臂迷宮放射臂迷宮（radialarmmaze）實(shí)驗(yàn)也是最為常用的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的模型之一，由Olton等人于20世紀(jì)70年代中期建立。其基本依據(jù)是，控制進(jìn)食的動(dòng)物受食物的驅(qū)使對(duì)迷宮各臂進(jìn)行探究；經(jīng)過一定時(shí)間的訓(xùn)練，動(dòng)物可記住食物在迷宮中的空間位置。該方法可同時(shí)測(cè)定動(dòng)物的工作記憶（workingmemory）和參考記憶（referencememory）。所用動(dòng)物包括大鼠、小鼠和鴿子。這一模型對(duì)腦區(qū)毀損和多種藥物均很敏感。后者包括乙醇、東###（抗膽堿能藥）和MK-801(NMDA受體拮抗劑)等。（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)多數(shù)采用八臂放射迷宮，也有采用十二臂或者二十四臂迷宮。這里介紹上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)