實驗四、蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍G250法，紫外吸收法一、基本原理

利用某些物質(zhì)的分子吸收紫外光、可見光、紅外光和激光200~800nm光譜區(qū)的輻射來進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析測定的方法。稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計。這種分光光度計靈敏度高，測定速度快，應用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學研究工作中必不可少的基本手段之一。紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學元件以及氧氣能吸收小于190nm波長的光，因此常規(guī)紫外測定集中在近紫外區(qū)，即200nm-400nm?？梢姽鈪^(qū)為400nm-800nm。

測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標準的紫外光譜圖相對照，對照時須注意測定的條件，如溶劑、濃度等。常用標準的紫處吸收光譜是薩德勒研究實驗公司編制的“Sadtler”紫外標準圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進行化合物定性鑒定時，應注意：化合物相同，其紫外光譜應完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團或基團，因此在鑒定時應與紅外光譜相結(jié)合。

Beer-Lambert定律朗伯-比爾光吸收定律：

A＝－lgT＝εbc

A：吸光度，又稱光密度“O.D”。T：透光度，T＝I/I。（I。為照射到吸收池上的光強，I為透過吸收池的光強）ε：摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（L·mol－1·cm－1）。b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm。c：樣品濃度（mol/L）。

由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。摩爾吸光系數(shù)：，是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強，相應的分光度法測定的靈敏度就越高。ε值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10-105：一般認為ε＞104為強吸收；ε＝103-104

為較強吸收；ε＜102

為弱吸收，此時分光光度法不靈敏。因為通常使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A＝0.001,所以，當b＝1cm,ε＝105時，可檢測的溶液最小濃度是C＝10-8mol/L。吸光度“A”有一個重要性質(zhì)是其具有加和性：即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)ε相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2×103

M－1cm－1（M＝mol/L）?！逜＝εbC∵A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10－5mol/L3.影響吸光系數(shù)的因素ε的大小取決于物質(zhì)的本性和光的波長化學因素：溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合與溶劑間的作用等等原因而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象?；瘜W因素引起的偏離，有時可控制溶液濃度設法減免。比如在強酸性溶液中滴定鉻酸溶液就可以避免偏離現(xiàn)象。光學因素：非單色光、雜散光、散射光、反射光以及非平行光等都會造成偏離現(xiàn)象?？捡R斯亮藍G250法原理：考馬斯亮藍G250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其最大吸收波長從465nm改變?yōu)?95nm,該蛋白－染料復合物吸光系數(shù)很高，所以檢測靈敏度很高，可以測定1μg/mL的蛋白質(zhì)，染料和蛋白結(jié)合只需要2分鐘，顏色在1小時內(nèi)穩(wěn)定。操作簡便，快速，是常用的蛋白含量測定方法之一。去污劑，粘多糖等嚴重干擾該方法的測定試劑:標準蛋白質(zhì)溶液（0.5mg/ml）考馬斯亮藍G250蛋白染色劑操作步驟標準曲線的繪制：取8只試管，分別加入0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足體積至3mL,然后加入5ml考馬斯亮藍試劑，震蕩混勻，2分鐘后于595nm測定吸光值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。樣品測定：樣品液1mL,用水補足體積至3mL,然后加入5ml考馬斯亮藍試劑，

595nm測定吸光值。從標準曲線中查出相應的濃度。計算樣品中蛋白質(zhì)的含量紫外吸收法測定核酸蛋白質(zhì)的含量原理：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，在280nm處有吸收峰。其吸收值與含量成正比關(guān)系。可用作定量測定。紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的π電子和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對的共軛情況等。蛋白質(zhì)濃度（mg/mL)=1.45A280-0.74A260；DNA濃度（μg/mL)＝A260×稀釋倍數(shù)／（0.024×L）試劑：標準蛋白質(zhì)溶液（1mg/ml)操作步驟取兩只小試管，甲管加入1.5mL

樣品（蛋白質(zhì)或核酸）1.5mL蒸餾水，乙管加入3mL蒸餾水，(注意：此實驗與書上步驟不同，直接測試按公式計算即可)

測定樣品在28