實驗一

凝集試驗

目的要求:

1、掌握玻片凝集試驗和試管凝集試驗的操作技術(shù)。

2、掌握凝集反應(yīng)中陰陽性結(jié)果的判定。

凝集試驗：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集試驗（agglutinationtest，agg）反應(yīng)中的抗原——凝集原抗體——凝集素

凝集試驗的類型：直接凝集試驗間接凝集試驗協(xié)同凝集試驗橋梁凝集反應(yīng)病毒的血凝和血凝抑制試驗一、直接凝集試驗

細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合并出現(xiàn)凝集現(xiàn)象稱直接凝集試驗(directagglutinationtest)。按操作方法分玻片法和試管法兩種。（一）試管凝集試驗

實驗材料:

1、布氏桿菌試管凝集抗原

由獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)。該抗原為布氏桿菌死菌混懸液，每1ml約含菌100億。是將牛型、羊型、豬型三型布氏桿菌的培養(yǎng)物殺死，懸浮于0.5%的石炭酸生理鹽水中制成。靜置時上層清亮無色或略呈灰白色，瓶底有菌體沉淀。用時需充分搖勻，并用0.5%的石炭酸生理鹽水按規(guī)定倍數(shù)稀釋（1：20）。

2、布氏桿菌病待檢血清

從被檢動物采取。被檢血清必須新鮮、無明顯蛋白凝塊、無溶血現(xiàn)象和腐敗氣味，采血后不得遲于2～3d檢驗。否則需加防腐劑或冰凍保存。

3、布氏桿菌陽性血清

由獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)。通常取自人工免疫的家畜，也可從送檢血清中選取。其凝集價不能低于1：800。

4、布氏桿菌陰性血清由獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)。

5、0.5％石炭酸生理鹽水自配

實驗方法與步驟:

（一）布氏桿菌試管凝集試驗按下表術(shù)式加樣操作。布氏桿菌試管凝集試驗術(shù)式表

管號1234567最終血清稀釋度1:251:501:1001:200對照

抗原陽性血清陰性血清

1:201:251:250.5%石炭酸生理鹽水（ml）被檢血清（ml）

2.30.50.5

0.50.20.50.5

0.5

棄1.5棄0.5

0.5－

－

－

0.50.51:20抗原（ml）0.5

0.50.50.50.50.50.5混勻，37C溫箱4～l0h，取出后置室溫18～24h，觀察并記錄結(jié)果結(jié)果﹟+++

++

－

－﹟－

加樣：①每份血清用4支試管，另取對照試管3支，置試管架上。②按上表在各管中先加0.5％石炭酸生理鹽水。③以1ml吸管吸取待檢血清0.2ml，加入第1管中，充分混勻，吸出1.5ml棄之，再吸出0.5ml

加入第2管，混勻后吸出0.5ml加入第3管，依此類推至第4管，混勻后棄去0.5ml。④第6管中加1:25稀釋的布氏桿菌陽性血清0.5ml⑤第7管中加1:25稀釋的布氏桿菌陰性血清0.5ml⑥每管各加以0.5％石炭酸生理鹽水稀釋20倍的布氏桿菌試管凝集抗原0.5ml。

作用：在各試管加完抗原后，將7支試管同時充分混勻，置37℃培養(yǎng)箱中4～l0h，取出后置室溫18～24h，然后觀察并記錄結(jié)果。

結(jié)果記錄：

﹟：液體完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀（即100％的菌體被凝集）

+++

液體略呈混濁，菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時情況如上（75％菌體被凝集）。

++

液體不甚透明，管底有明顯的凝集沉淀，振蕩時有塊狀或小片絮狀物（50％凝集）

+

液體透明度不明顯或不透明，有不甚顯著的沉淀或僅有沉淀的痕跡（25％菌體被凝集）

－：液體不透明，管底無凝集，有時管底可見有一部分沉淀，但振蕩后立即散開呈均勻混勻

確定被檢血清凝集價（滴度）：

以出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為終點。布病判定標(biāo)準(zhǔn)：

陽性：牛、馬和駱駝凝集價1:100以上豬、綿羊、山羊和狗1:50以上可疑：牛、馬和駱駝1:50

豬、羊等1:25待檢血清稀釋度：豬、羊、狗

1:25，1:50，1:100，1:200

牛、馬、駝

1:50，1:100，1:200，1:400

大規(guī)模檢疫可只用兩個稀釋度。豬、羊、狗1:25和1:50

牛、馬、駝1:50和1:100

（二）玻片凝集試驗材料：

1、布氏桿菌玻片凝集反應(yīng)抗原

2、布氏桿菌病待檢血清

3、布氏桿菌陽性血清

4、布氏桿菌陰性血清方法與步驟：①取潔凈載玻片一塊，中間滴1滴布氏桿菌待檢血清；另取載玻片一塊，左側(cè)滴1滴布氏桿菌陽性血清，右側(cè)滴1滴布氏