第二章

第二節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)質(zhì)量的

標(biāo)準(zhǔn)化一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物學(xué)分類(lèi)（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物學(xué)控制的分類(lèi)（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物控制的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物學(xué)控制的分類(lèi)按對(duì)微生物學(xué)質(zhì)量的控制，可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四類(lèi)：無(wú)菌動(dòng)物(germfreeanimal,GFA)悉生動(dòng)物(gnotobioticanimal,GNA)無(wú)特定病原體動(dòng)物(specificpatho-genfreeanimal,SPFA)清潔動(dòng)物(cleananimal,CLA)普通動(dòng)物(conventionalanimal,CVA)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在我國(guó)分為四類(lèi)普通動(dòng)物（CVA），一級(jí)動(dòng)物清潔動(dòng)物（CLA），二級(jí)動(dòng)物無(wú)特殊病原體動(dòng)物（SPFA），三級(jí)動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物（GFA）和悉生動(dòng)物（GNA），四級(jí)動(dòng)物二、無(wú)菌動(dòng)物與悉生動(dòng)物(一)無(wú)菌動(dòng)物（germfreeanimal，簡(jiǎn)稱GFA）1.定義：指用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)，動(dòng)物的體表體內(nèi)不攜帶其它生命體（包括一切微生物和寄生蟲(chóng)）的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。飼養(yǎng)條件：無(wú)菌隔離器內(nèi)來(lái)源：第一代通過(guò)無(wú)菌剖腹產(chǎn)術(shù)，人工哺乳獲得。維持：通過(guò)無(wú)菌剖腹產(chǎn)術(shù)，人工哺乳或無(wú)菌動(dòng)物代乳飼育擴(kuò)群。2.無(wú)菌動(dòng)物的發(fā)展過(guò)程⑴1895～1910年解決了無(wú)菌生命能否生存的問(wèn)題。無(wú)菌豌豆動(dòng)物沒(méi)有腸道菌參與下不能生存

無(wú)菌豚鼠無(wú)菌雞⑵1910～1940年解決了無(wú)菌生命必須供給B族維生素才能正常生長(zhǎng)⑶1940年至今系統(tǒng)飼養(yǎng)無(wú)菌動(dòng)物推廣應(yīng)用種類(lèi)培育者及育成時(shí)間小鼠Pleasants,1959大鼠Reyniers1946；Gustafsson,1948豚鼠Miyakawa1958;Tanami,1959;兔Wostmann1959;Luckey,1963狗Glimsedt,1946貓Bleby,1969山羊、綿羊Smith,1961,1966豬Whitenair,1960馬Drummond等,1973猴Reyniers,1942雞Reyniers,1943鵪鶉Woodard等,1965;Miles,1966無(wú)菌動(dòng)物飼養(yǎng)裝置的改進(jìn)不銹鋼隔離器

塑料隔離器

3.無(wú)菌動(dòng)物特點(diǎn)：微生物特點(diǎn)：在動(dòng)物體內(nèi)外任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲(chóng)。

“無(wú)菌”是個(gè)相對(duì)的概念，只是根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)知識(shí)和檢驗(yàn)方法在一定時(shí)期內(nèi)不能檢出病原體而已。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在認(rèn)為是無(wú)菌的動(dòng)物或許將來(lái)可以檢出病原體而不是無(wú)菌動(dòng)物。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：消化系統(tǒng)

(1)盲腸肥大，

(2)腸道肌層薄，腸絨毛變細(xì)變短

(3)肝臟變小循環(huán)系統(tǒng)(1)心臟變小(2)白細(xì)胞數(shù)變少，且數(shù)量波動(dòng)范圍小免疫系統(tǒng)(1)胸腺，淋巴組織，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育不良(2)脾臟小，無(wú)二級(jí)濾泡生理學(xué)特點(diǎn)：免疫功能

(1)血清中IgG、IgM水平低，幾乎不存在丙種球蛋白和特異性抗體

(2)免疫應(yīng)答速度慢，過(guò)敏反應(yīng)、對(duì)異體移植物的排斥反應(yīng)以及自身免疫現(xiàn)象消失或減弱生長(zhǎng)率

(1)不同種屬不同

(2)無(wú)菌鳥(niǎo)類(lèi)生長(zhǎng)率高于同種普通鳥(niǎo)

(3)無(wú)菌大、小鼠與普通鼠差不多

(4)無(wú)菌豚鼠和無(wú)菌兔比普通的慢生殖(1)無(wú)菌大、小鼠略高于普通大小鼠(2)豚鼠和兔繁殖能力比普通級(jí)低代謝和營(yíng)養(yǎng)無(wú)菌動(dòng)物血中含氮量少，腸管對(duì)水的吸收率低，代謝周期比普通動(dòng)物長(zhǎng)體內(nèi)不能合成維生素B和K，易產(chǎn)生這兩種維生素的缺乏癥抗輻射能力無(wú)菌動(dòng)物抗輻射能力強(qiáng)，抗實(shí)驗(yàn)性燙傷和抗休克死亡能力也強(qiáng)于普通動(dòng)物壽命無(wú)菌動(dòng)物的壽命普遍長(zhǎng)于普通動(dòng)物4.無(wú)菌動(dòng)物的應(yīng)用微生物學(xué)研究免疫學(xué)研究放射醫(yī)學(xué)研究營(yíng)養(yǎng)、代謝研究老年病學(xué)研究心血管疾病研究毒理學(xué)研究腫瘤學(xué)研究宇航醫(yī)學(xué)研究寄生蟲(chóng)學(xué)研究口腔醫(yī)學(xué)研究某種疾病的病原研究無(wú)菌貓貓瘟病毒不易受感染普通貓貓瘟病毒易感接種說(shuō)明感染受腸道微生物影響微生物間的拮抗作用研究菌群之間的拮抗作用是生物屏障的一種，生物屏障有時(shí)比物理屏障更有效。1）霍亂弧菌口服無(wú)菌幼豚鼠霍亂弧菌死亡口服無(wú)菌幼豚鼠霍亂弧菌+產(chǎn)氣莢膜桿菌

存活說(shuō)明產(chǎn)生拮抗作用，產(chǎn)氣莢膜桿菌去除了霍亂桿菌，使動(dòng)物不死亡。2）福氏痢疾桿菌口服無(wú)菌幼豚鼠福氏痢疾桿菌死亡口服無(wú)菌幼豚鼠大腸桿菌福氏痢疾桿菌存活，只檢出大腸桿菌口服產(chǎn)生無(wú)菌雛雞白色念珠菌菌絲體侵入腸道粘膜

口服產(chǎn)生普通雛雞白色念珠菌酵母型菌體很少發(fā)病口服口服無(wú)菌雛雞大腸桿菌白色念珠菌得到保護(hù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用無(wú)菌動(dòng)物血中無(wú)特異性抗體，很適合于各種免疫現(xiàn)象的研究。丙種球蛋白和特異性抗體研究無(wú)菌動(dòng)物體內(nèi)既無(wú)抗原也無(wú)特異性抗體，處于一種“原始狀態(tài)”，很適合用于各種免疫功能的研究。如果用無(wú)抗原性的飼料喂無(wú)菌動(dòng)物，體內(nèi)可完全無(wú)抗體。無(wú)菌動(dòng)物暴露于微生物，先產(chǎn)生α球蛋白，再產(chǎn)生β球蛋白，最后產(chǎn)生γ球蛋白。制備高效價(jià)，無(wú)交叉反應(yīng)的特異性抗體在宇航醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用利用悉生動(dòng)物研究腸道菌群的作用及相互關(guān)系，從而研制出一種只有極低殘?jiān)氖称?，宇航員食后，不會(huì)產(chǎn)生腹瀉或胃腸漲氣。(二)悉生動(dòng)物1.悉生動(dòng)物的定義（gnotobioticanimal，簡(jiǎn)稱GNA）定義：又稱已知菌動(dòng)物，指動(dòng)物體內(nèi)帶有明確的微生物種類(lèi)的動(dòng)物。飼養(yǎng)條件：無(wú)菌隔離器內(nèi)來(lái)源：人為將已知的微生物投給無(wú)菌動(dòng)物，使其體內(nèi)帶有已知菌單菌動(dòng)物雙菌動(dòng)物多菌動(dòng)物2.悉生動(dòng)物特點(diǎn)：微生物特點(diǎn)體內(nèi)攜帶有已知微生物來(lái)源無(wú)菌動(dòng)物接種或投入微生物飼養(yǎng)管理

必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的百級(jí)空氣凈化的隔離系統(tǒng)中，實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制。其他與無(wú)菌動(dòng)物比較。悉生動(dòng)物腸道內(nèi)存在細(xì)菌可以合成維生素，不會(huì)像無(wú)菌動(dòng)物一樣發(fā)生維生素缺乏癥。抵抗力、生活力較強(qiáng)，易于飼養(yǎng)管理。3.悉生動(dòng)物的應(yīng)用從悉生動(dòng)物的來(lái)源我們知道，悉生動(dòng)物來(lái)源于無(wú)菌動(dòng)物，所以無(wú)菌動(dòng)物在應(yīng)用于微生物學(xué)研究和抗體制備等領(lǐng)域的時(shí)候已經(jīng)是屬于悉生動(dòng)物的范疇了。微生物學(xué)中的研究

(1)微生物間的拮抗作用

(2)微生物和宿主之間關(guān)系

(3)病毒學(xué)研究用于藥物鑒定：中國(guó)藥檢所利用五聯(lián)菌悉生動(dòng)物（大腸埃希氏桿菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、糞鏈球菌和乳酸桿菌）可替代無(wú)菌動(dòng)物進(jìn)行藥物檢定三、無(wú)特定病原體動(dòng)物1.無(wú)特定病原體動(dòng)物的定義（specificpathogen-freeanimal，簡(jiǎn)稱SPFA)定義：指不攜帶特定病原體（細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)），但帶有未知的微生物群的動(dòng)物。飼養(yǎng)條件：屏障系統(tǒng)內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)/隔離器內(nèi)保種最初來(lái)源：將無(wú)菌動(dòng)物/悉生動(dòng)物轉(zhuǎn)移到屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)繁殖2.SPF動(dòng)物特點(diǎn)：微生物特點(diǎn)

SPF動(dòng)物除一、二級(jí)動(dòng)物應(yīng)排除的病原體外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對(duì)研究實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。來(lái)源

SPF動(dòng)物來(lái)源于無(wú)菌動(dòng)物或剖腹產(chǎn)動(dòng)物。3.SPF動(dòng)物的應(yīng)用：目前國(guó)際上公認(rèn)SPF動(dòng)物適用于所有科研實(shí)驗(yàn)，是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。它的應(yīng)用價(jià)值在于它無(wú)人畜共患病，無(wú)主要傳染病，無(wú)對(duì)實(shí)驗(yàn)研究可能產(chǎn)生干擾的微生物。各種疫苗生產(chǎn)所采用的動(dòng)物應(yīng)為SPF動(dòng)物。四、清潔動(dòng)物和普通動(dòng)物（一）清潔動(dòng)物1.清潔動(dòng)物的定義（cleananimal，簡(jiǎn)稱CLA）定義：微生物控制級(jí)別介于SPF動(dòng)物和普通動(dòng)物之間的動(dòng)物飼養(yǎng)條件：屏障系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)源：其種群來(lái)源于SPF動(dòng)物或剖宮產(chǎn)動(dòng)物。清潔動(dòng)物的引種應(yīng)來(lái)源于微生物控制更高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

應(yīng)用：各種科研、教學(xué)用大小鼠2.清潔級(jí)動(dòng)物特點(diǎn)：清潔級(jí)動(dòng)物比普通級(jí)動(dòng)物要求排除的微生物和寄生蟲(chóng)多，但比SPF動(dòng)物少。清潔級(jí)動(dòng)物除肉眼觀察無(wú)病外，尸體解剖時(shí)，主要臟器、組織無(wú)論是肉眼觀看還是病理組織切片均應(yīng)無(wú)病變。3.清潔級(jí)動(dòng)物的應(yīng)用：清潔級(jí)動(dòng)物是根據(jù)我國(guó)國(guó)情而設(shè)立的等級(jí)動(dòng)物。它較普通級(jí)動(dòng)物健康，又較SPF級(jí)動(dòng)物易達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可免受動(dòng)物疾病的干擾，其敏感性與重復(fù)性亦較好。目前在我國(guó)已成為適用于科研的標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)物。（二）普通動(dòng)物1.普通動(dòng)物的定義（conventionalanimal，簡(jiǎn)稱CVA）定義：不帶有嚴(yán)重危害動(dòng)物自身健康和人獸共患病病原體的動(dòng)物。飼養(yǎng)條件：普通開(kāi)放環(huán)境來(lái)源：經(jīng)微生物學(xué)檢查不帶有上述病原體的動(dòng)物，或SPF動(dòng)物降級(jí)。應(yīng)用：豚鼠、兔、犬、猴等大動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究。普通動(dòng)物特點(diǎn)：1、微生物學(xué)特點(diǎn)要求不攜帶所規(guī)定的人獸共患病病原和動(dòng)物烈性傳染病的病原。2、飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)于開(kāi)放系統(tǒng)。但仍然對(duì)溫度，濕度，飼料，墊料，飲水，衛(wèi)生等有一定控制。3、生理學(xué)特點(diǎn)外觀健康，飲食排泄正常，無(wú)異常分泌物，無(wú)臨床癥狀，臟器無(wú)眼觀病灶。普通動(dòng)物的應(yīng)用：僅可作為生物醫(yī)學(xué)中教學(xué)示教之用，或作為某些科學(xué)研究為探索方法而從事的予試驗(yàn)之用，不可供科研、生產(chǎn)和檢定之用，由于普通級(jí)動(dòng)物繁殖力強(qiáng)，生產(chǎn)量大，生產(chǎn)成本低，適宜作一般性的教學(xué)實(shí)驗(yàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)用。（三）潔凈動(dòng)物與普通動(dòng)物的比較潔凈動(dòng)物通常是指來(lái)源于剖腹產(chǎn)、實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制、飼養(yǎng)于空氣凈化系統(tǒng)設(shè)施內(nèi)的動(dòng)物，包括清潔動(dòng)物、SPF動(dòng)物、悉生動(dòng)物和無(wú)菌動(dòng)物。1、微生物控制比較種類(lèi)飼育說(shuō)明無(wú)菌動(dòng)物隔離系統(tǒng)無(wú)法檢出任何生命體悉生動(dòng)物隔離系統(tǒng)確知帶有的微生物SPF動(dòng)物屏障系統(tǒng)確知不帶有的微生物清潔動(dòng)物屏障系統(tǒng)確知不帶有的微生物普通動(dòng)物開(kāi)放系統(tǒng)微生物情況不明確

2、對(duì)科研實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的比較

GFSPFCLCV傳染病無(wú)無(wú)無(wú)未知寄生蟲(chóng)無(wú)無(wú)無(wú)未知試驗(yàn)結(jié)果明確明確明確有疑問(wèn)用動(dòng)物數(shù)少少較少多或大量統(tǒng)計(jì)價(jià)值很好可能好較好不準(zhǔn)確長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)好好可能好困難死亡率很少少較少高長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)100%90%80%40%成活率實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)可能可能可能不可能設(shè)計(jì)結(jié)果討論很高高較高有疑問(wèn)價(jià)值總之，使用無(wú)菌動(dòng)物、悉生動(dòng)物、及SPF動(dòng)物