第九章：基因敲除與藥學(xué)基因敲除技術(shù)與諾貝爾獎三位在基因敲除技術(shù)方面進行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就的科學(xué)家分享了2007年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎，他們是美國鹽湖城猶他州大學(xué)的MarieCapecchi教授、美國北卡羅來納州大學(xué)的Oliversmithies教授以及英國加蒂夫大學(xué)的MartinEvans教授

基因敲除簡介定義：通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。1234567123456790890RNAi同源重組插入突變基因敲除（geneknock-out）通常所說到的基因敲除，又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，把具有功能的同源序列置換出來，造成功能基因的缺失或失活。應(yīng)用DNA同源重組原理進行基因敲除同源重組插入突變RNAi同源重組插入突變發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。要有將外援基因?qū)胨拗骷毎妮d體2.能接受外援基因的受體（常用胚胎干細胞）基因敲除的必備條件基因敲除載體通常，我們將外源基因DNA片段通過相應(yīng)載體導(dǎo)入ES細胞中，一個好的載體應(yīng)具備以下特點：能在宿主細胞中穩(wěn)定存在2.具有多個限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點，即multiplecloningsite(MCS),便于外源基因的插入。常用質(zhì)粒。3.

具有一個以上的遺傳標志，便于對基因重組的ES細胞進行篩選。常用的篩選標記為正負篩選：Neo（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）基因陽性篩選標記和HSV-tk（單純袍子病毒胸腺嘧啶激酶）基因陰性篩選標記。Neo新霉素基因陽性的ES細胞可以再含有G418（一種新霉素的類似物）的培養(yǎng)基上生長。HSV-tk基因陽性的ES細胞，編碼的基因產(chǎn)物可以將更昔洛韋等轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，將細胞殺死。胚胎干細胞（簡稱ES細胞）胚胎干細胞是早期胚胎中分離出來的一類細胞，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。（1）基因敲除載體的構(gòu)建Step1.獲得目的基因（待敲除基因）的同源片段，將此DNA片段克隆到一般質(zhì)粒中；Step2.從重組質(zhì)粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端；Step3.將neo基因和HSV-tk克隆到質(zhì)粒中；基因敲除的基本程序

根據(jù)載體與靶基因組同源序列雙鏈斷裂位點位置的不同，基因載體通常分為兩種：

1．插入性載體(gene-insertionvector)

2．置換型載體(gene-replacementvector)大多數(shù)的基因敲除中，采用的是置換性載體；而插入性載體則更多的應(yīng)用于基因敲入和對目的基因的精確突變。（2）基因敲除載體導(dǎo)入ES細胞

將基因敲除載體導(dǎo)入ES細胞，以載體上的neo基因置換ES細胞基因組的目的基因，從而得到基因敲除細胞

基因敲除載體導(dǎo)入ES的方法有顯微注射法，電穿孔法，DEAG葡聚糖介導(dǎo)法，脂質(zhì)體法，病毒感染法，精子載體法等1.正負雙向篩選系統(tǒng)（PNS）：Nero基因表達，ES細胞抗新霉素，在G418的培養(yǎng)基中存活。HSV-tk基因表達，在更昔洛韋的培養(yǎng)基中，ES細胞被殺死。

（3）常用的篩選方法有兩類

2.正向篩選

又稱標記基因的特異性表達法，僅有正性選擇性標記的標記基因，而且這種標記方法是缺乏自身的某個表達調(diào)控序列。標記基因因為特異整合，獲得調(diào)控序列，能夠表達?？梢苑譃闊o啟動子篩選法，無增強子篩選法，無poly（A）篩選法。

（2）常用的篩選方法有兩類

3．物理篩選方法主要是PCR篩選方法，優(yōu)點是靈敏，專一性強；。

此外還有富集或篩選率比較高時，可以用Southernblot雜交法，

（2）常用的篩選方法有兩類

（3）基因敲除的ES細胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宮中導(dǎo)入動物胚胎后，可以發(fā)育成嵌合子或完全ES來源的動物。嵌合體動物與正常的動物雜交，子代動物再雜交，有可能產(chǎn)生雜合型突變體。（5）嵌合體的雜交育種

得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。一、條件性基因敲除法：

將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。在傳統(tǒng)基因敲除的基礎(chǔ)上，利用了特異性重組酶系統(tǒng)作為調(diào)控的按鈕，實現(xiàn)對基因的時刻可調(diào)節(jié)敲除。與Cre-loxp重組酶系統(tǒng)有關(guān)。第三節(jié)：基因敲除進展及前景：

條件性基因敲除優(yōu)點：

①目標基因的敲除可以限定在特定的組織、細胞或發(fā)育的特定階段；

②可避免因基因突變而致死胎的問題：

③在2個loxP位點之間的重組率較高；

④

如用病毒或配體／DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物的過程。

常見的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。

二、體細胞基因敲除伴隨核移植和體細胞克隆技術(shù)的發(fā)展，體細胞基因敲除-核移植體系為研究熱點。選擇的體細胞應(yīng)該有較好的繁殖能力和克隆能力。有時用帶端粒酶基因的DNA轉(zhuǎn)染細胞，提高細胞的壽命和活力。三、基因捕獲

又稱隨機基因敲除，又稱隨機基因敲除，是隨機插入突變進行基因敲除的一種新型方法。原理：將外源基因（報告基因、標記基因）的載體通過電穿孔或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法導(dǎo)入ES細胞，并隨機整合到細胞基因組中，建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫。基因誘捕所用的載體一般由報告基因、選擇性標記基因及輔助元件組成。報告基因缺乏自身的某個表達調(diào)控序列，在捕獲內(nèi)源基因的相應(yīng)表達序列后獲得表達。根據(jù)所誘捕的表達調(diào)控序列的不同，廣義的基因誘捕包括：增強子誘捕、基因誘捕、啟動子誘捕、poly（A）誘捕。

基因誘捕的優(yōu)點

利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫，節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費用，更有效迅速地進行小鼠染色體組的功能分析。

基因誘捕的缺點

無法對基因進行精細的遺傳修飾，四、RNAi引起的基因敲除

①、②：雙鏈RNA進入細胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，并在RdRP（以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶RNA）的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除③

：SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物RNAi引起的基因敲除④：上述復(fù)合物同與互補的mRNA結(jié)合，促進mRNA被RNA酶裂解，并且以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈，并在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除⑤：這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應(yīng)，細胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。五、基因敲除的應(yīng)用1.基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究基因的結(jié)構(gòu)功能和其他生命科學(xué)理論問題的重要工具。2．建立生物模型。

基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進行相關(guān)的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。最常見的是小鼠，家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報道。

3.基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類疾病的基因治療提供有力手段。使用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)牖颊叩牟∽兗毎?，糾正機體基因缺陷或調(diào)節(jié)基因表達功能是細胞重新獲得正常的功能，這個過程稱為基因表達。4.基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過改造生物體基因，可以用于研制優(yōu)良的生物反應(yīng)器，培育新的生物品種和提供異種器官移植的供體動物。隨著基