熒光定量PCR儀技術(shù)內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實(shí)驗(yàn)方案的選擇及SYBR法實(shí)驗(yàn)流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光定量PCR原理－－定義同一個(gè)樣品重復(fù)96次起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量起始DNA量是樣本中本來(lái)的量，更有意義； 終點(diǎn)DNA量經(jīng)過(guò)PCR“加工”，不是研究所需要的數(shù)據(jù)起點(diǎn)定量誤差小，終點(diǎn)定量誤差大

擴(kuò)增曲線(xiàn)熒光閾值

Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線(xiàn)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段

真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)閾值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光閾值平臺(tái)期熒光閾值基線(xiàn)范圍閾值標(biāo)準(zhǔn)偏差基線(xiàn)信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差x10Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值Ct值熒光信號(hào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著增長(zhǎng)(即穿過(guò)閾值線(xiàn))時(shí)的循環(huán)次數(shù)從基線(xiàn)到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Ct值半對(duì)數(shù)圖譜Ct值線(xiàn)性圖譜橫軸：PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性CT值基線(xiàn)閾值基線(xiàn)調(diào)整規(guī)則如果Ct值>18，不需調(diào)整，使用自動(dòng)分析結(jié)果如果Ct值<18，修改基線(xiàn)終點(diǎn)，再分析一次起點(diǎn)：進(jìn)口試劑取3，國(guó)產(chǎn)試劑取6終點(diǎn)：最小的Ct值–4，通常為15長(zhǎng)度：大于或等于6個(gè)循環(huán)基線(xiàn)閾值Ct值實(shí)驗(yàn)結(jié)束，軟件根據(jù)默認(rèn)值的基線(xiàn)(3-15)自動(dòng)分析，給出結(jié)果和圖譜如果Ct值>18，使用自動(dòng)分析結(jié)果，出報(bào)告如果有Ct值<18，根據(jù)[最小的Ct值-4]修改基線(xiàn)終點(diǎn)，重新分析數(shù)據(jù)手工數(shù)據(jù)分析方法理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：Log2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線(xiàn)性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系Ct值與模板起始量的關(guān)系Ct值lg起始DNA濃度CT=-klgX0+b標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法標(biāo)準(zhǔn)品未知樣本PCR方程只在指數(shù)期成立Log[DNA]循環(huán)數(shù)線(xiàn)性增長(zhǎng)期平臺(tái)期y=x(1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期Ct值和閾值必須位于指數(shù)增長(zhǎng)階段內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測(cè)靈敏度確認(rèn)Notemplatecontrol確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率:-3－-3.535Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35Cycles內(nèi)無(wú)引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）:0.9-1.2內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實(shí)驗(yàn)方案的選擇及SYBR法實(shí)驗(yàn)流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南非特異性熒光標(biāo)記

SYBRGreenI

SYBRGreenⅡ特異性熒光標(biāo)記

TaqManProbe常用熒光標(biāo)記方法熒光染料法——原理

目前常用的熒光染料有SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、SYTO9、HRM等。其共同性質(zhì)為：（a）結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處（b）與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光（c）在變性條件下雙鏈分開(kāi)，熒光消失SYBRGreenI熱變性引物退火延伸反應(yīng)熒光染料法——作用機(jī)理問(wèn)題點(diǎn)：熒光染料與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時(shí)被檢測(cè)，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。熒光染料法——問(wèn)題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：

設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！

使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時(shí)，由于熒光染料的特性隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，SYBRGreenⅠ/Ⅱ與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越來(lái)越強(qiáng)，當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱，從50℃一直加熱到99℃，在此過(guò)程中PCR產(chǎn)物按照TM值的大小雙鏈被依次打開(kāi)，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開(kāi)依次減弱，如下圖：熒光染料法——融解曲線(xiàn)將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜導(dǎo)數(shù)圖譜熒光染料法——融解曲線(xiàn)融解曲線(xiàn)分析，單一峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線(xiàn)分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確只有染料法才需要做熔解曲線(xiàn)探針?lè)](méi)有必要雙鏈核酸的熔解曲線(xiàn)分析熔解曲線(xiàn)反映的是一定序列長(zhǎng)度的核酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不同，所以通過(guò)熔解曲線(xiàn)，能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，核酸雙鏈哪怕只有一個(gè)堿基的差異，通過(guò)熔解曲線(xiàn)也能分析出來(lái)。

成本低，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針

適合初步篩查：先用SYBR篩查，再用探針?lè)ň_定量少數(shù)關(guān)鍵樣品熔解曲線(xiàn)：鑒定PCR有無(wú)雜帶、引物二聚體優(yōu)點(diǎn)

無(wú)模板特異性：不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號(hào)對(duì)引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量：每孔只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)基因靈敏度相對(duì)較低：適合于5000拷貝以上的基因定量缺點(diǎn)熒光染料法——優(yōu)缺點(diǎn)Taqman探針?lè)ā?/p>

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，R與Q分開(kāi)，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針,熒光產(chǎn)生。Taqman探針?lè)āぷ鳈C(jī)理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探針的設(shè)計(jì)：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20s60℃，30-60s（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針?lè)ā狿CR體系的建立

高度特異性重復(fù)性好靈敏度高可進(jìn)行多重定量?jī)?yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)Taqman探針?lè)ā獌?yōu)缺點(diǎn)

標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類(lèi)－－分子信標(biāo)FRET實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類(lèi)－－分子信標(biāo)高特異性：對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類(lèi)－－分子信標(biāo)

幾種方法的應(yīng)用比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreen染料法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標(biāo))高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對(duì)定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，

GMO定量檢測(cè)等

相對(duì)定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實(shí)驗(yàn)方案的選擇及SYBR法實(shí)驗(yàn)流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南絕對(duì)定量解析方法Sample25絕對(duì)定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線(xiàn)性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量一個(gè)目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針?lè)ň伞?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線(xiàn)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；融解曲線(xiàn)（探針?lè)ú恍枰?。絕對(duì)定量分析幾要素拷貝數(shù)的計(jì)算：待測(cè)樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算相對(duì)定量解析方法相對(duì)定量分析方法比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點(diǎn)：基因的相對(duì)表達(dá)量，而不是基因的絕對(duì)量！一個(gè)參照樣本一個(gè)或一個(gè)以上的未知樣本一個(gè)目的基因內(nèi)參基因——用來(lái)校對(duì)不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針?lè)ň?。?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線(xiàn)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（有些分析方法不需要）；融解曲線(xiàn)（探針?lè)ú恍枰?。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）相對(duì)定量分析幾要素內(nèi)參基因

實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時(shí)樣品的細(xì)胞個(gè)數(shù)不可能完全相同，RNA提取時(shí)得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基因也常被稱(chēng)為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內(nèi)參照，如：GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。相對(duì)定量分析——內(nèi)參基因篩選篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)篩選geNorm內(nèi)參分析軟件選擇相對(duì)定量分析——內(nèi)參基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說(shuō)明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

2-△△Ct法

相對(duì)定量分析——兩種常用的分析方法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法就是對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對(duì)定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對(duì)數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。相對(duì)值=校正值=目的基因定量結(jié)果內(nèi)參基因定量結(jié)果待測(cè)樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值相對(duì)定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法公式：優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目的基因和內(nèi)參基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)用：該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。相對(duì)定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法檢測(cè)樣品內(nèi)參基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對(duì)量對(duì)照樣品6391.5343.40.05371.000待測(cè)樣品18589.717.30.00200.037待測(cè)樣品27432.91946.10.26184.874實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)公式：F=2－相對(duì)定量分析——2－△△Ct法

前提條件：目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開(kāi)始前必須分別對(duì)目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需再做標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用：特別適合于樣品量不大，但是檢測(cè)的基因種類(lèi)很多的情況。待測(cè)組目的基因平均Ct值待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值對(duì)照組目的基因平均Ct值對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實(shí)驗(yàn)方案的選擇及SYBR法實(shí)驗(yàn)流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南一、實(shí)驗(yàn)方案的選擇熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案熒光染料法Taqman探針?lè)p標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法2--△△Ct法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法2--△△Ct法

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案的選擇（1）染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析的基因種類(lèi)很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。（2）探針?lè)ㄟm合常被用作基因含量的精確檢測(cè)(精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝)及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。（3）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法適合樣品量大、檢測(cè)的基因種類(lèi)相對(duì)較少、精度要求較高的實(shí)驗(yàn)。（4）2-△△Ct法適合檢測(cè)精度要求一般，樣品量相對(duì)較少，檢測(cè)的基因種類(lèi)相對(duì)較多的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測(cè)的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經(jīng)費(fèi)情況等來(lái)選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案。二、SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)樣品制備定量體系配備引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)無(wú)RNase環(huán)境使用無(wú)RNase耗材專(zhuān)用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuant下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇高效、全長(zhǎng)的cDNASYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)定量體系配備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)設(shè)定濃度區(qū)間使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對(duì)照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個(gè)堿基重復(fù)＜4個(gè)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長(zhǎng)度：100－200bp反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長(zhǎng)度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量?jī)?yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)擴(kuò)增效率：90％－110