流式細胞術(shù)實驗技巧及數(shù)據(jù)分析

2021/4/171BD公司不同型號流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto2021/4/172一流式細胞儀的基本原理

*穩(wěn)定流動

*激發(fā)光斑

*熒光補償

*熒光素選擇二數(shù)據(jù)分析及開窗2021/4/173FCM原理示意圖2021/4/174

層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件,管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術(shù),使細胞流動穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細胞分析分選提供技術(shù)保證.

層流技術(shù)2021/4/175液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）

流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

2021/4/1762021/4/177

低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

2021/4/178激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)2021/4/179.20um64um32um032um聚焦距離激光束聚焦透鏡強度光束成形與細胞受照方式這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個細胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照

FCM的單細胞照明技術(shù)2021/4/17109、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:41:21PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32021/4/1712熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

2021/4/1713UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用電子技術(shù)或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的方法稱“熒光補償”熒光補償2021/4/1714熒光補償2021/4/1715Mean值判斷補償2021/4/1716雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615

紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+PeCy5+APC488525、575綠色、橙色

633670

紅色

熒光染料激發(fā)波長（nm)發(fā)射波長（nm)顏色2021/4/1717

用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量傳遞染料：2021/4/1718流式細胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液制備熒光抗體標記上機檢測表型測定細胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學分析2021/4/1719單分散細胞2021/4/1720FSCFSC信號的強弱與細胞的大小和活力相關(guān)2021/4/1721SSCSSC信號的強弱與細胞內(nèi)顆粒多少相關(guān)2021/4/1722細胞散色光信號2021/4/1723細胞熒光測量細胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細胞在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒光信號.細胞的特異性熒光

經(jīng)過各種特異染色的細胞在激發(fā)光的照射下可測到較強的熒光信號.2021/4/1724自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發(fā)熒光信號2021/4/1725特異染色的熒光信號2021/4/1726DNA分析比較2021/4/1727排除雙聯(lián)體細胞2021/4/1728細胞阻滯在G2M期2021/4/1729雙克隆細胞周期分析2021/4/1730

溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一種類似物。它可以替代胸腺嘧啶摻入到細胞新合成的DNA分子中，成為S期細胞的一種標記物。流式細胞術(shù)采用抗BrdUrd單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測細胞，不僅可檢測一個細胞群體的動力學參數(shù)和DNA含量，同時可以了解不同細胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA雙標記染色2021/4/17312021/4/1732BrdUrd與PI檢測2021/4/1733BrdUrd與PI檢測2021/4/1734BrdUrd與PI檢測2021/4/1735細胞三色熒光檢測2021/4/1736細胞因子測定*檢測T細胞(CD69)活化2021/4/1737G6=R1*R52021/4/1738*CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4熒光強度下調(diào)2021/4/1739細胞因子分析圖*過敏性鼻息肉與鼻息肉細胞因子比較2021/4/1740純化單核細胞2021/4/1741調(diào)節(jié)性T細胞檢測2021/4/17422021/4/1743G3=R1*R3G4=R1*R42021/4/1744凋亡細胞測定2021/4/1745凋亡細胞測定2021/4/1746細胞凋亡檢測2021/4/1747陰性的設(shè)置2021/4/1748血小板檢測2021/4/1749血小板檢測2021/4/1750血小板檢測2021/4/1751血小板檢測2021/4/1752謝謝2021/4/17539、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:41:21PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/320