分子生物學(xué)與慢性粒細(xì)胞白血病一、概述慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)簡(jiǎn)稱慢粒。概念：是一種發(fā)生在早期多能造血干細(xì)胞上的惡性骨髓增殖性疾病（獲得性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病)。Chronicmyelogenousleukemia,chronicphase.2021/4/272病因：CML的病因比較復(fù)雜，較為公認(rèn)的致病因素是電離輻射，如X射線、γ射線等。暴露于輻射的人群有較高的CML發(fā)病率。日本廣島及長崎原子彈輻射后，慢粒的發(fā)病率較未照射人群高17倍。主要特點(diǎn)：本病病程發(fā)展緩慢，外周血粒細(xì)胞顯著增多且不成熟，脾臟明顯腫大。自然病程可經(jīng)歷慢性期、加速期和急變期，多因急性變而死亡。本病各年齡組均可發(fā)病，以中年最多見。2021/4/273二、CML分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)理Ph染色體與融合基因

90%以上的慢粒患者中可發(fā)現(xiàn)有Ph染色體，即t(9；22)(q34；q11)，9號(hào)染色體q34上的原癌基因c-ABL的片段易位至22號(hào)染色體q11上的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)（breakpointclusterregion，BCR），產(chǎn)生BCR-ABL融合基因。這也是人類在白血病染色體易位中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)融合基因。2021/4/274CytogeneticAbnormalityofCML:

ThePhChromosome9222021/4/2752021/4/276

Bcr/abl融合基因的結(jié)構(gòu)2021/4/277Bcr/abl融合蛋白與白血病1.p210BCR-ABL,見于絕大部分CML及50%以上成人Ph染色體陽性的ALL。2.p190BCR-ABL,常見于50%Ph染色體陽性的成人ALL和80%Ph染色體陽性的兒童ALL。3.p230BCR-ABL,whichisassociatedwithrarecasesofPh-positiveCML.2021/4/278Bcr-abl融合基因致病的分子機(jī)制Bcr/abl融合基因的編碼產(chǎn)物p210、p230等融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活結(jié)構(gòu)性酪氨酸激酶（tyrosinekinase,TK）。而酪氨酸激酶是一種催化ATPγ-磷酸酶轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活細(xì)胞中多種信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生。2021/4/279三、BCR-ABL融合基因的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)1.RT-PCR：是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄出cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR，是在RNA水平上檢測(cè)BCR-ABL融合基因。該方法靈敏度高，可用于MRD的檢測(cè)，但反轉(zhuǎn)錄-PCR是一種定性實(shí)驗(yàn)，不能對(duì)白血病患者的BCR-ABL融合基因給出定量分析，也可能會(huì)因RNA降解而出現(xiàn)假陰性。2021/4/27102.實(shí)時(shí)定量熒光-PCR：是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)，在PCR擴(kuò)增的同時(shí)，加入引物的同時(shí)加入特異性的熒光探針;是通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過程中的熒光強(qiáng)度變化對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的一種定量檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)定量熒光PCR由于其具靈敏度高(10－5～10－6)、可準(zhǔn)確定量觀察、迅速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在MRD檢測(cè)中具有非常重要的優(yōu)勢(shì)。2021/4/27113.CBA法：是指用已知大小及性質(zhì)的磁珠與一組可溶的蛋白分析物結(jié)合，以檢測(cè)人類血液樣本的BCR-ABL融合蛋白。其檢測(cè)試劑為一種結(jié)合藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)的單克隆抗體，可對(duì)BCR-ABL蛋白的ABL特異性結(jié)合，當(dāng)免疫磁珠與BCR-ABL融合蛋白共混時(shí)，則可形成三明治狀的復(fù)合物，蛋白的BCR端為結(jié)合了抗體的微球，ABL端為結(jié)合了藻紅蛋白的抗體?；诳贵w的大小及性質(zhì)，可使用流式細(xì)胞儀對(duì)該種復(fù)合物進(jìn)行研究，從而檢測(cè)出BCR-ABL融合蛋白。2021/4/2712BCR-ABL融合基因可翻譯產(chǎn)生融合蛋白可以被抗BCR的捕獲磁珠及連接PE的抗ABL抗體結(jié)合。在流式細(xì)胞儀上對(duì)捕獲磁珠的檢測(cè)，可檢測(cè)出PE的熒光信號(hào)。2021/4/27134.FISH法：是利用標(biāo)記的DNA或RNA探針直接在染色體、細(xì)胞或組織水平定位特定靶核酸序列的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量。主要應(yīng)用于染色體易位形成的融合基因檢測(cè)、基因缺失的檢測(cè)及MRD檢測(cè)等。具有快速、安全、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)白血病臨床療效的判定及預(yù)測(cè)預(yù)后也具有重要意義。2021/4/27145.Southern印跡(SouthernBlot)法可對(duì)bcr-abl融合基因DNA重排進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。將待測(cè)基因組DNA片段經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相雜交膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探針與之雜交，經(jīng)放射自顯影洗片后即可顯示所要檢測(cè)的條帶，對(duì)于CML患者，除可見到一條與胚系bcr基因組DNA相對(duì)應(yīng)的條帶外，其他的條帶說明存在重排的bcr等位基因。2021/4/2715Southen印記法實(shí)驗(yàn)流程圖2021/4/2716四、分子靶向治療（moleculartargetingtreatment）信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑

(SignalTransductionInhibitor,STI)2021/4/2717分子靶向藥物——酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（imatinibmesylate），商品名為格列衛(wèi)，為治療CML的常用分子靶向藥物。屬小分子化合物，是一種特異性很強(qiáng)的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）。對(duì)體內(nèi)眾多酪氨酸激酶，它僅能抑制BCR-ABL融合基因產(chǎn)物P210和P190、PDGFR（血小板衍化生長因子）與c-Kit受體的酪氨酸激酶。2021/4/2718格列衛(wèi)藥理作用的分子機(jī)制格列衛(wèi)通過特異性地與BCR/ABL激酶結(jié)構(gòu)域的ATP位點(diǎn)結(jié)合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸殘基不能磷酸化，從而抑制其細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,促使細(xì)胞凋亡和抑制Ph陽性白血病細(xì)胞的增殖。格列衛(wèi)是CML治療史上的里程牌,并且對(duì)CML具有很好的療效，可使患者達(dá)到遺傳學(xué)或分子生物學(xué)緩解。2021/4/2719Mechanismofactionofimatinib.ByoccupyingtheATPbindingpocketoftheABLkinasedomain,imatinibpreventssubstratephosphorylationanddownstreamactivationofsignals,