第二部分

高效液相色譜儀及簡(jiǎn)單操作維護(hù)

HPLC技術(shù)的發(fā)展過(guò)程HPLC是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展，同時(shí)是氣相色譜理論的擴(kuò)展和延伸。二十世紀(jì)60年代末期生產(chǎn)出商品化液相色譜儀，其發(fā)展非常快速，經(jīng)過(guò)30多年的努力已成為分離學(xué)科中的骨干技術(shù)。目前，HPLC技術(shù)已趨于成熟。特點(diǎn)：采用高壓泵、高效填料、高靈敏度檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)了快速、高效和操作自動(dòng)化。HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較

高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱柱長(zhǎng)/cm10～2510～200色譜柱柱內(nèi)徑/mm2～10（不銹鋼管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒徑

μm）3～5075～600流動(dòng)相流動(dòng)方式

高壓輸液泵壓入

靠重力流入

溶液的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度

快

緩慢

色譜柱入口壓力/MPa

2～200.001～

0.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2*103～5*1042～50進(jìn)樣量/（g）10-6～10-21～10分析時(shí)間/h0.05～1.01～20高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高：柱效可達(dá)5000~30000塊/米（2）選擇性高：通過(guò)流動(dòng)相的控制來(lái)改善分離過(guò)程的選擇性（3）檢測(cè)靈敏度高：

UV—最小檢出量可以達(dá)到10-9g

FD--最小檢出量可以達(dá)到10-12g（4）分析速度快:采用了高壓泵流動(dòng)相和儲(chǔ)液罐（1）儲(chǔ)液罐

材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）

棕色玻璃瓶會(huì)避免藻類(lèi)的生長(zhǎng)

容積：0.5~2.0L

放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差

注意：密封、過(guò)濾

（2）流動(dòng)相----使用限制避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：

堿金屬鹵化物及其酸溶液，如：碘化鋰、氯化鉀等

高濃度無(wú)機(jī)酸，如硝酸、硫酸.

可能含有過(guò)氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)

在使用前必須用干燥氧化鋁過(guò)濾除去過(guò)氧化物

含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液，如EDTA，乙二胺四乙酸

四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液（2）流動(dòng)相----過(guò)濾流動(dòng)相過(guò)濾的目的

過(guò)濾去除可能存在的微小固體顆粒

保護(hù)色譜高壓泵和色譜柱流動(dòng)相過(guò)濾方法

在線溶劑過(guò)濾抽真空過(guò)濾流動(dòng)相在線過(guò)濾：

清潔方法：1、用水沖洗殘留溶劑后，將過(guò)濾器放在約35％濃硝酸里浸一小時(shí)2、用二次蒸餾水徹底沖洗過(guò)濾器3、將過(guò)濾器重新裝好。4、定期清洗溶劑過(guò)濾器及溶劑瓶（每1～3個(gè)月至少清洗一次）不能用超聲波清洗流動(dòng)相抽真空過(guò)濾過(guò)濾用膜：水系和有機(jī)，孔徑：0.22μm和0.45μm流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化（2）流動(dòng)相----脫氣常用的脫氣方法有：抽真空脫氣法：特點(diǎn)：可以一次完成過(guò)濾和脫氣任務(wù)注意：抽真空會(huì)引起混合溶劑組分的變化，適合單一溶劑體系超聲波脫氣法簡(jiǎn)單，但效果不理想常用的脫氣方法（續(xù)）在線真空脫氣法

流動(dòng)相的要求：(1)使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議不超過(guò)兩天，最好每天更換流動(dòng)相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreehoursc:aftereighthours流動(dòng)相的要求：(2)互溶性流動(dòng)相的要求：(3)紫外吸收甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm乙腈和水@254nm流動(dòng)相的要求：

(4)pH的影響高壓輸液泵和梯度洗脫裝置性能：①泵體材料耐化學(xué)腐蝕②能在高壓下連續(xù)工作③輸液流量范圍寬對(duì)填充柱：分析型輸出流量為0.1~10ml/min

制備型輸出流量為1~100ml/min

對(duì)微孔柱：分析型輸出流量為10~1000μl/min

制備型輸出流量為1~9900μl/min④輸出流量穩(wěn)定、重復(fù)性高流量控制的精密度應(yīng)小于1%（最好為0.5%），重復(fù)性最好為0.5%高壓泵的分類(lèi)往復(fù)型泵

目前使用的是雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵和雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵示意圖輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備

主要有管道過(guò)濾器、脈動(dòng)阻尼器、由壓力傳感器組成的壓力測(cè)量、顯示裝置，以及流動(dòng)相流量的測(cè)量裝置梯度洗脫裝置

梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時(shí)間，改善檢測(cè)器的靈敏度，它類(lèi)似于GC種使用的程序升溫技術(shù)

影響梯度洗脫的主要因素有：溶劑的純度、溶劑的互溶性、檢測(cè)器的種類(lèi)

四元低壓梯度系統(tǒng)四元高壓梯度系統(tǒng)

泵操作注意事項(xiàng)設(shè)定泵運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的高、低壓極限2.

緩沖鹽溶液與有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)必須用去離子水清洗泵3.

緩沖鹽溶液的濃度不能過(guò)高，pH范圍1～13，Cl-的濃度小于0.1mol/L4.清洗柱塞

注意事項(xiàng)：

1、必須設(shè)定高、低壓極限

2、

緩沖溶液與有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)用去離子水清洗泵

3、緩沖鹽溶液的濃度不能過(guò)高，pH范圍1～13，Cl-的濃度小于0.1mol/L；

經(jīng)常使用，每周至少更換一～二次（95%的水）很少使用則每次使用前必須更換泵壓力不正常的主要原因：

氣泡，主動(dòng)閥故障，出口閥故障，密封墊或柱塞桿磨損，滲漏或堵塞，比

例閥故障，傳感器故障，使用比例閥混合時(shí)鹽濃度太高

進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置正面六通閥進(jìn)樣裝置反面連接7725i型六通閥的特點(diǎn)旋轉(zhuǎn)操作時(shí)不中斷流速可部分充滿（可變），也可全部充滿(固定)loop孔角度較寬，改善了操作的容易程度進(jìn)樣從1mL到5ml內(nèi)部有進(jìn)樣信號(hào)線（7725i）;容易使用，可靠一定不能使用尖針！它會(huì)嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈進(jìn)樣針進(jìn)完樣后及時(shí)沖洗進(jìn)樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動(dòng)相

（由于這些溶液會(huì)形成結(jié)晶從而磨損墊圈）沖洗方法：

A.將進(jìn)樣器轉(zhuǎn)至Inject和Load位置，利用液相泵輸送高純水沖洗

(這時(shí)是沖洗樣品環(huán)及溝槽）.

B.用閥清洗接頭和注射器沖洗。

如何判斷手動(dòng)進(jìn)樣器的密封圈漏？

從進(jìn)樣器觀察：進(jìn)樣后將針拔出，若從進(jìn)樣口或排空管有液體冒出，顯示密封圈磨損

從結(jié)果看：通常有壓力不穩(wěn)定，峰面積或保留時(shí)間不穩(wěn)定和殘留嚴(yán)重進(jìn)樣裝置自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶置于進(jìn)樣針下方進(jìn)樣針穿過(guò)墊圈進(jìn)入瓶中注射器抽取所設(shè)定的樣品體積進(jìn)樣針收回轉(zhuǎn)入針端口使之并成為流路的一部分色譜柱柱材料和規(guī)格

﹠不銹鋼管

﹠柱管的內(nèi)徑：0.5～

4.6mm﹠填料粒度：3～

10μm﹠柱長(zhǎng)度：10～

25

cm色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時(shí),會(huì)造成：色譜峰展寬(死體積)、柱效下降或滲漏

錐箍錐度不合適造成滲漏長(zhǎng)度不合適造成柱前死體積

自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭

使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）

錐箍在管上是活動(dòng)的，即stop-depth的長(zhǎng)度可調(diào)，能換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。如PEEK工程塑料的接頭色譜柱色譜性能的評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)內(nèi)容：分離效能、對(duì)指定溶質(zhì)的選擇型、在不同PH介質(zhì)中的穩(wěn)定性、不同批次但同型號(hào)填料間性能的重現(xiàn)性、適宜的操作壓力等。性能評(píng)價(jià)方法：以指定的一組標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)為樣品，測(cè)定它們?cè)谥由系睦碚撍鍞?shù)，作為柱效的衡量指標(biāo)。例：對(duì)于反相色譜填料，可以選擇一組具有不同極性的芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等作為基本組分，再加以苯酚或苯胺等酸、堿性溶質(zhì)。測(cè)柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測(cè)柱效保留在新色譜柱上測(cè)得的色譜圖，并記錄色譜測(cè)試條件

定期檢測(cè)柱效

定期檢測(cè)儀器的譜帶展寬測(cè)柱效的方法色譜柱種類(lèi)繁多,性能各異,測(cè)定方法亦各不相同

各色譜柱均附有說(shuō)明書(shū),可按說(shuō)明書(shū)所述方法測(cè)定

例：Waters反相C18柱的測(cè)定方法

流動(dòng)相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min

樣品:50mgAcenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮進(jìn)樣量5μl

檢測(cè)波長(zhǎng):254nm計(jì)算色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：Wσ方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W3σ

93σW4σ

164σW5σ

255σ

不好的色譜柱的柱效反而比好色譜柱的要高，因?yàn)槠渫衔膊糠譁y(cè)不出來(lái)柱效低--柱外因素系統(tǒng)連接問(wèn)題：連接不好造成死體積

進(jìn)樣器檢測(cè)器管路，連接口保護(hù)柱在線過(guò)濾器堵塞流動(dòng)相問(wèn)題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大“柱效”問(wèn)題，不一定是色譜柱問(wèn)題！色譜柱的正確使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換

流速(壓力)的變化幅度

溫度的變化幅度

專(zhuān)用色譜柱∶樣品及溶劑的要求

記住∶拿到一根從未用過(guò)的色譜柱時(shí)一定要先看其使用說(shuō)明！正確使用色譜柱樣品方面

除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用正確使用色譜柱流動(dòng)相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度

有機(jī)溶劑或水的比例反相C18（硅膠基質(zhì)）色譜柱的清洗在流動(dòng)相中添加了一些酸、堿或緩沖鹽進(jìn)行色譜分離后一般的沖洗方法：第一步：用和流動(dòng)相相同比例的水和有機(jī)相沖洗第二步：增大水的比例到90%~95%（最好用梯度）第三步：增大有機(jī)相比例到100%（最好用梯度）最后保存在有機(jī)相（甲醇或乙腈）中記住∶每種色譜柱可能有特定的方法一定要先看其使用說(shuō)明！柱壓高--柱外因素系統(tǒng)反壓?jiǎn)栴}

阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過(guò)濾器不干凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯(cuò)誤?柱壓過(guò)高，不一定是色譜柱問(wèn)題！色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、緩沖鹽合適的存放溶劑

避免色譜柱床的干涸

避免機(jī)械震動(dòng)

防止細(xì)菌生長(zhǎng)

注意存放的溫度檢測(cè)器主要作用：監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。

紫外檢測(cè)器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光或可見(jiàn)光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，比耳定律光能量∶

I0=入射光強(qiáng)度

I=透過(guò)光強(qiáng)度光通量(透過(guò)率%)∶T=I/I0吸光度∶

A=-log(T)=log(I0/I)吸光度∶

A=abc溶劑的影響不同種類(lèi)溶劑有其截止波長(zhǎng)溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長(zhǎng)有影響何為溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收背景吸收的影響背景吸收減少線性范圍許多溶劑產(chǎn)生背景吸收影響紫外檢測(cè)器靈敏度的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)從比耳定律可看出樣品的種類(lèi)樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測(cè)池的長(zhǎng)度所使用的波長(zhǎng)，檢測(cè)器的

時(shí)間常數(shù)噪音(N)流動(dòng)相所使用的波長(zhǎng)，燈的能量檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)非檢測(cè)器因素-電噪音，泵脈動(dòng)等定波長(zhǎng)檢測(cè)器紫外檢測(cè)器種類(lèi)可變波長(zhǎng)檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器光路示意圖可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器﹠

選用氘燈作為光源，在190—600nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)，選擇不同的波長(zhǎng)檢測(cè)光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）

DAD檢測(cè)器的主要特點(diǎn)

①可以同時(shí)得到多個(gè)波長(zhǎng)的色譜圖，可以計(jì)算不同波長(zhǎng)處的相對(duì)吸收比②可以在色譜分離同時(shí)，對(duì)色譜峰的指定位置實(shí)時(shí)記錄吸收光譜圖，并得到最大吸收波長(zhǎng)③在色譜運(yùn)行期間，可以逐點(diǎn)進(jìn)行光譜掃描，得到時(shí)間—波長(zhǎng)—吸收值為坐標(biāo)的三維圖形例：山梨酸和苯甲酸部分分離的色譜峰a.山梨酸b.苯甲酸c.混合物流通池示意圖

檢測(cè)器的維護(hù)：

保持清潔，每天用后與色譜柱一起清洗

不定期用強(qiáng)溶劑反向沖洗檢測(cè)器（流通池）

使用脫過(guò)氣的流動(dòng)相，防止氣泡滯留池內(nèi)

檢測(cè)器燈有一定壽命

平衡和清洗色譜柱時(shí)不要開(kāi)燈，檢測(cè)中途不要隨意開(kāi)、關(guān)燈

基線噪音大可能由那些原因引起泵壓不穩(wěn)：氣泡，色譜柱污染，系統(tǒng)管路污染，流通池污染，燈強(qiáng)度不足：光學(xué)系統(tǒng)老化或污染，參數(shù)設(shè)置不合理基線噪音可能的原因：

﹠流通池臟

﹠檢測(cè)器燈有問(wèn)題

﹠如果是周期性的，電壓或泵的脈沖

﹠溫度對(duì)檢測(cè)器的影響

﹠氣泡經(jīng)過(guò)檢測(cè)器Time(min.)基線漂移可能的原因：﹠梯度洗脫﹠溫度不穩(wěn)定(示差檢測(cè)器）﹠流動(dòng)相中有污染物﹠柱中的流動(dòng)相沒(méi)有平衡﹠體系中有污染物流出鬼峰問(wèn)題1-流動(dòng)相臟問(wèn)題2-容器污染問(wèn)題3-柱子污染20%-100%MeOH沒(méi)有進(jìn)樣601530150鬼峰——即使不進(jìn)樣也會(huì)出現(xiàn)的峰峰型可能原因：﹠柱中有死體積﹠過(guò)濾片部分堵塞﹠只有一個(gè)雙峰——組分的共洗脫﹠樣品與溶劑不匹配，溶劑與柱子不匹配雙峰柱塌陷

可能原因：正常峰

雙峰峰型可能的原因：部分峰拖尾﹠二次保留效應(yīng)——?dú)埩艄璐蓟姆磻?yīng)﹠小峰緊跟在大峰的后面流出所有峰拖尾﹠額外的柱效應(yīng)﹠柱壞/不適當(dāng)?shù)娜軇┅}柱頭有污染﹠金屬﹠不適當(dāng)?shù)臉悠妨客衔卜宸Q對(duì)性

>1.2NormalTailingNormalTailing峰型可能的原因﹠在大峰前，有小峰流出﹠柱死體積﹠樣品溶劑不適當(dāng)﹠過(guò)濾片部分堵塞﹠柱過(guò)載正常峰伸舌峰前伸峰不對(duì)稱性

<0.9峰寬*在進(jìn)樣口到柱或柱到檢測(cè)器之間，使用細(xì)的短的