高效液相色譜法

HIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY中山高校公共衛(wèi)生學(xué)院肖琴高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）又稱高壓液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法相比較，HPLC優(yōu)點(diǎn)：(1)高效——分別效率高(2)高速——流淌相流淌速度快、分析速度快(3)高靈敏度——10-9～10-11g(4)高自動(dòng)化——自動(dòng)采集和處理數(shù)據(jù)，優(yōu)化選擇和限制分別操作條件第一節(jié)概述缺點(diǎn)：(1)儀器困難、價(jià)格昂貴(2)運(yùn)用有機(jī)溶劑(費(fèi)用較高，有害健康、污染環(huán)境)與GC相比較，HPLC的優(yōu)點(diǎn):應(yīng)用范圍廣——突出優(yōu)點(diǎn)不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的影響流淌相可選用不同極性的液體，參與對(duì)組分的分配作用，分別效率↑(4)HPLC分別分析后的樣品餾分易于收集其次節(jié)液相色譜法的分類一、吸附柱色譜法

(adsorptionchromatography)二、支配柱色譜法(partitionchromatography)三、離子交換色譜法(ion-exchangechromatography)四、尺寸排阻色譜法

(sizeexclusionchromatography)

一、吸附柱色譜法

(adsorptionchromatography)吸附柱色譜示意圖Tswett色譜分離示意圖——又稱液固色譜(1)分別原理吸附色譜的實(shí)質(zhì)就是依據(jù)組分在吸附劑上吸附實(shí)力的不同來進(jìn)行分別吸附劑通常是多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它的表面存在分散的吸附活性位點(diǎn)

100×300×2000×5000×吸附解吸再解吸再吸附競(jìng)爭(zhēng)吸附

Xm+nMsXs+nMmXm:在流淌相中的組分分子Xs:在吸附劑表面的組分分子Ms:在吸附劑表面的流淌相分子Mm:在流淌相中的流淌相分子n:組分分子被吸附而從吸附劑表面頂替出來的溶劑分子數(shù)吸附柱色譜分別原理吸附劑表面被吸附保留的極性組分分子X吸附劑表面的非極性流淌相分子M固體吸附劑表面吸附活性位點(diǎn)Ka的大小取決于組分分子和吸附劑之間以及組分分子和流淌相之間作用力的強(qiáng)弱Ka值大，表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難以洗脫Ka值小，表示組分在吸附劑上保留弱，易于洗脫吸附平衡常數(shù)Ka(adsorptionequilibriumconstant)

Ka=[Xs][Mm]n[Xm][Ms]n平衡時(shí)，通常，吸附等溫線分為以下三種：

(1)直線形等溫線(2)凸形等溫線(3)凹形等溫線

吸附等溫線確定溫度下，組分在固定相中的濃度cS隨組分在流淌相中的濃度cm的變更曲線三種吸附等溫線和對(duì)應(yīng)的色譜峰形態(tài)吸附較堅(jiān)實(shí)導(dǎo)致延遲發(fā)生其他反應(yīng)（如氫鍵作用）擴(kuò)散分布中間密，兩側(cè)疏對(duì)吸附劑的基本要求：不與流淌相和被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)有高的吸附容量不溶于流淌相等(2)固定相

極性吸附劑

非極性吸附劑

酸性吸附劑堿性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等包括氧化鋁和氧化鎂等最常見的是活性炭吸附劑的表面結(jié)構(gòu)是確定色譜柱性能的重要因素，同時(shí)它的粒度大小、分布范圍、裝柱技術(shù)等對(duì)柱效也有很大影響硅膠是最常用的吸附劑，由彈性多聚硅酸脫水制成，其吸附實(shí)力較氧化鋁弱

硅膠(SiO2·xH2O)

硅膠結(jié)構(gòu)示意圖活性基團(tuán)硅醇基

水合硅羥基多孔性硅氧烷交聯(lián)結(jié)構(gòu)

表面(使硅膠失去吸附力)+H2O(能與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而具有吸附性)

Δ,-H2O加熱去水過程稱為活化含水量大，吸附活性(實(shí)力)低，反之吸附活性高氧化鋁

酸性氧化鋁(pH4~5)

堿性氧化鋁(pH9~10)

中性氧化鋁(pH~7.5)

——用途最廣泛

與硅膠一樣，氧化鋁也能猛烈地吸水，水不易被其它化合物置換，因而使其活性降低通常也接受加熱方法使其活化分別實(shí)力強(qiáng)、活性可以限制、應(yīng)用較廣的強(qiáng)極性吸附劑(3)流淌相流淌相又常被稱作洗脫劑對(duì)流淌相的基本要求：純度合格對(duì)樣品有確定的溶解實(shí)力，不與樣品和吸附劑發(fā)生不行逆的化學(xué)反應(yīng)粘度小易流淌性質(zhì)穩(wěn)定，有確定的揮發(fā)性，對(duì)分別組分的回收無干擾作用與檢測(cè)手段相匹配(4)固定相和流淌相的選擇依據(jù)被測(cè)組分、固定相和流淌相的性質(zhì)a.被測(cè)組分性質(zhì)（極性大小）烴＜--------＜羧酸，醇b.吸附劑的活性吸附劑的活性越大，對(duì)被測(cè)組分的吸附實(shí)力越強(qiáng)強(qiáng)極性物質(zhì)——選擇弱吸附劑弱極性物質(zhì)——選擇強(qiáng)吸附劑c.流淌相的極性依據(jù)“相像相溶”的原理，對(duì)極性大的試樣接受極性較強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣則接受極性弱的洗脫劑流淌相極性越大，對(duì)被測(cè)組分的洗脫實(shí)力越強(qiáng)洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（strengthparameter）0來衡量0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)氧化鋁上的洗脫序列在硅膠吸附劑中0值的依次與氧化鋁相同，數(shù)值可按下式換算：可用兩種或兩種以上的溶劑，按確定比例組成混合溶劑進(jìn)行洗脫也可在洗脫過程中接受漸漸變更混合溶劑的比例，使其性質(zhì)漸漸變更，使結(jié)構(gòu)相像的組分得到分別，這種洗脫方式稱為梯度洗脫(gradientelution)梯度洗脫可提高分別效率，削減色譜峰拖尾現(xiàn)象d.被測(cè)組分、吸附劑和流淌相的關(guān)系組分吸附劑流動(dòng)相極性活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性二、支配柱色譜法(partitionchromatography)(1)分別原理依據(jù)試樣各組分在兩種互不相溶的液體中溶解度不同，即具有不同的支配系數(shù)K來實(shí)現(xiàn)的(類似于溶劑萃取)——又稱液液色譜溶解萃取再萃取再溶解分別原理示意圖(反相)被保留的非極性組分分子極性溶劑分子載體（擔(dān)體）固定液(非極性或弱極性)平衡時(shí)，支配系數(shù)=[Xs]/[Xm][Xs]:組分X支配在固定相中的濃度[Xm]:組分X支配在流淌相中的濃度(2)固定相固定相是涂漬在惰性載體表面上的固定液

擔(dān)體(support)擔(dān)體又稱載體，僅起負(fù)載固定液作用，是惰性的多孔固體顆粒。要求其有較大的比表面積，且對(duì)樣品無吸附作用常用的擔(dān)體有吸水硅膠、硅藻土、纖維素和微孔聚四氟乙烯小球等支配色譜法要求固定液是樣品的良好溶劑，不溶或很難溶于流淌相最常用的固定液為：強(qiáng)極性的β,β-氧二丙腈、中等極性的聚乙二醇和非極性的角鯊?fù)榈瘸Ｓ玫墓腆w液涂漬方法主要有三種：溶劑蒸發(fā)法，沉淀法和動(dòng)態(tài)涂漬早期的固定相為機(jī)械涂層固定相——固定液易流失

為了解決固定液流失的問題，改善固定相的功能，常用化學(xué)方法把有機(jī)分子鍵合到載體(硅膠)表面，形成化學(xué)鍵合固定相(chemicalbondedstationaryphase)化學(xué)鍵合固定相——以微粒多孔硅膠為載體硅膠結(jié)構(gòu)示意圖硅膠官能團(tuán)有機(jī)分子按基團(tuán)與硅膠相結(jié)合的化學(xué)鍵類型分類1.酯化型（Si—O—C）2.硅烷化型（Si—O—Si—C）——應(yīng)用范圍廣泛

硅醇基醇酯化反應(yīng)：硅烷化反應(yīng)：硅醇基氯硅烷按有機(jī)基團(tuán)的性質(zhì)分類1.極性鍵合相(正相鍵合相)2.非極性鍵合相(反相鍵合相)——C18(ODS)柱應(yīng)用最廣泛硅膠表面鍵合極性有機(jī)基團(tuán)(如氰基、氨基和二醇基)

常用作正相鍵合相色譜，分析極性較強(qiáng)的化合物硅膠表面鍵合烴基硅烷常用作反相鍵合相色譜，分別非極性和極性較弱的化合物化學(xué)鍵合固定相的優(yōu)點(diǎn)：①傳質(zhì)速度快，柱效高②柱穩(wěn)定性好，運(yùn)用壽命長(zhǎng)③可鍵合不同性質(zhì)的官能團(tuán)，提高選擇性④可利用梯度洗脫，提高分析效率對(duì)流淌相的基本要求：與固定液不互溶，極性相差較大；對(duì)樣品組分的溶解度足夠大，但又相對(duì)小于固定液對(duì)組分的溶解度(3)流淌相分類極性適用范圍流出順序根據(jù)流動(dòng)相和固定相的極性正相分配色譜(常規(guī)分配色譜)流動(dòng)相<固定相極性化合物極性小的先流出反相分配色譜流動(dòng)相>固定相非極性及弱極性化合物極性大的先流出正相支配色譜和反相支配色譜正相支配色譜(normalphasechromatography)反相支配色譜(reversedphasechromatography)三、離子交換色譜法

(ion-exchangechromatography)以離子交換劑為固定相，利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分別的液相色譜法，主要用于離子型化合物的分別離子交換色譜的柱填料是一種帶電荷官能團(tuán)的固定基質(zhì)。固體基質(zhì)上帶負(fù)電荷的稱為陽(yáng)離子交換劑，帶正電荷的稱為陰離子交換劑為保持交換劑的電中性，基質(zhì)上還存在帶相同電荷數(shù)但正、負(fù)號(hào)相反的離子，稱為反離子（也稱可交換離子）(1)離子交換原理

離子交換原理示意圖待測(cè)組分別子Xm與可交換離子Ym爭(zhēng)奪離子交換劑上帶電荷的交換基團(tuán)Rs，進(jìn)行離子交換溶劑分子待測(cè)組分X（離子型化合物）離子交換劑帶電荷的活性基團(tuán)R可交換離子YXm+RsYYm+RsXKXY=[RsX][Ym][RsY

][Xm]其交換反應(yīng)如下：反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)，平衡常數(shù)為：平衡常數(shù)KXY又稱為離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)(2)固定相分類按可交換的活性基團(tuán)不同分類

分類活性基團(tuán)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑－SO3H弱酸性陽(yáng)離子交換劑－COOH或－PO3H-強(qiáng)堿性陰離子交換劑－N+R3X-弱堿性陰離子交換劑－NH2,－NHR或－NR2按基體不同分類

按物理結(jié)構(gòu)不同分類

按活性基團(tuán)接入基體的制備方式不同分類

合成樹脂(聚苯乙烯)型、纖維素型和硅膠型微孔型(或凝膠型)、大孔型、薄殼型或薄膜型等物理涂漬型和化學(xué)鍵合型離子交換劑的不同物理結(jié)構(gòu)(a)微孔型;(b)大孔型;(c)薄膜型;(d)表面多孔型離子交換樹脂的主要性能指標(biāo)

交聯(lián)度(degreeofcrosslinking)

聚苯乙烯型合成樹脂交聯(lián)劑：二乙烯苯（交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）直鏈中的聚乙烯鏈節(jié)結(jié)構(gòu)交聯(lián)度孔洞交換速率選擇性適用范圍大小慢好分子量較小的離子性物質(zhì)小大快差分子量較大的離子性物質(zhì)交聯(lián)劑是指能在線型結(jié)構(gòu)分子縮聚時(shí)起架橋作用而使其分子中的基團(tuán)相互鍵合成為不溶網(wǎng)狀體的物質(zhì)樹脂中交聯(lián)劑的含量叫交聯(lián)度，以重量百分比表示，范圍從1%到16%交換容量(exchangecapacity)

粒度

每克干樹脂能參與交換反應(yīng)的活性基團(tuán)數(shù)單位：mmol/g或mmol/ml反映了樹脂進(jìn)行交換反應(yīng)實(shí)力的大小離子交換樹脂顆粒的大小用樹脂溶脹態(tài)所能通過的篩孔目數(shù)表示制備純水多用10~50目，色譜分析一般為100~200目

一般來說，離子強(qiáng)度的變更要大于pH值變更對(duì)保留值的影響(3)流淌相離子交換色譜的流淌相大多為水溶液增加離子強(qiáng)度，減弱試樣離子的競(jìng)爭(zhēng)交換實(shí)力，使試樣離子保留值降低流淌相pH值的變更，能導(dǎo)致可解離化合物的電離度發(fā)生變更，如電離度增大，則試樣的保留值也增大在流淌相中添加有機(jī)溶劑（如甲醇或乙醇），可使峰的拖尾得到改善，并能調(diào)整組分的保留值分別原理示意圖不具有吸附、支配和離子交換作用機(jī)理，而是基于分子的尺寸和形態(tài)不同來實(shí)現(xiàn)分別(1)分別原理——又稱凝膠色譜或空間排阻色譜不同尺寸、形態(tài)的組分分子惰性多孔結(jié)構(gòu)的凝膠四、尺寸排阻色譜法

(sizeexclusionchromatography)凝膠色譜法示意圖一般來說，凝膠色譜適用分別分子量從幾千到幾百萬(wàn)的試樣，且分子量差別需在10%以上時(shí)才能得到分別按相對(duì)分子質(zhì)量降低的次序被洗脫

(2)固定相按機(jī)械強(qiáng)度不同軟質(zhì)、半硬質(zhì)及硬質(zhì)凝膠按化學(xué)成分不同有機(jī)和無機(jī)凝膠按制備方法和孔穴結(jié)構(gòu)差異勻整、半勻整和非勻整凝膠按對(duì)溶劑的運(yùn)用范圍不同親水性、親油性和兩性凝膠分類：應(yīng)用最多的是多孔性凝膠依據(jù)機(jī)械強(qiáng)度的不同一般可分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)凝膠三類軟質(zhì)凝膠(如葡聚糖等)在壓強(qiáng)0.1MPa左右即被壓壞，不適宜用在HPLC中對(duì)流淌相的基本要求：能溶解試樣，并且與固定相凝膠性質(zhì)相像，能浸潤(rùn)凝膠溶劑的黏度要低與接受的檢測(cè)器相匹配常用的流淌相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等凝膠過濾色譜水溶液水溶性樣品凝膠滲透色譜有機(jī)溶劑非水溶性樣品流淌相樣品(3)流淌相依據(jù)性能和用途不同可分為三類：

(1)分析型(2)制備型(3)專用型主要由四部分組成：(1)高壓輸液系統(tǒng)(2)進(jìn)樣系統(tǒng)(3)分別系統(tǒng)(4)檢測(cè)系統(tǒng)(5)數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)其他幫助裝置：(1)梯度洗脫裝置(2)自動(dòng)進(jìn)樣(3)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第三節(jié)高效液相色譜儀高效液相色譜儀LC-10AvpPlus高效液相色譜儀LC-2010HTAgilent1100系列高效液相色譜系統(tǒng)

高效液相色譜儀的工作流程

高壓輸液系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)一般組成：(1)貯液器(2)高壓輸液泵(highpressurepump)——供應(yīng)動(dòng)力(3)過濾器(4)壓力脈動(dòng)阻尼器核心部件流淌相的作用：(1)攜帶樣品通過色譜柱(2)供應(yīng)支配相，調(diào)整選擇性，實(shí)現(xiàn)分別用作HPLC流淌相的溶劑：有機(jī)溶劑、水、無機(jī)鹽的水溶液等流淌相分為單一流淌相和混合流淌相對(duì)流淌相的基本要求：1.對(duì)被分別樣品有適宜的溶解度(K為1～10)2.與樣品及固定相不發(fā)生不行逆化學(xué)反應(yīng)3.粘度小，純度高4.與檢測(cè)器匹配流淌相的處理：1.

純化

2.脫氣水：高純水有機(jī)溶劑：色譜純脫氣方法：減壓脫氣(2)煮沸脫氣(3)超聲波震蕩脫氣（不會(huì)造成組成的變更）高壓輸液泵應(yīng)符合要求：

(1)密封性好，耐腐蝕

(2)有足夠的輸出壓力——30~50Mpa(3)輸出壓力平穩(wěn)，脈沖小

(4)輸出流量恒定，可調(diào)范圍寬，流量精度1%~2%(5)泵室體積小(＜0.5ml)常用的高壓輸液泵分為以下兩種：(1)恒流泵——輸出流量恒定

(2)恒壓泵——輸出壓力恒定缺點(diǎn)：保留時(shí)間重現(xiàn)性差，更換溶劑或清洗較麻煩柱塞往復(fù)泵恒流泵螺旋注射泵二、進(jìn)樣系統(tǒng)常用的進(jìn)樣方式有兩種：(1)注射器進(jìn)樣(2)六通閥進(jìn)樣——普遍接受六通閥進(jìn)樣優(yōu)點(diǎn)：(1)進(jìn)樣時(shí)可保持系統(tǒng)高壓(2)進(jìn)樣方式簡(jiǎn)便、易操作(3)進(jìn)樣精確、重現(xiàn)性好(4)自動(dòng)化程度高(5)適于作定量分析六通閥進(jìn)樣示意圖a.進(jìn)樣位置(樣品進(jìn)入定量管)b.進(jìn)柱位置(樣品導(dǎo)入色譜柱)1.定量管2.樣品進(jìn)入口3.流淌相進(jìn)口4.色譜柱三、分別系統(tǒng)分析柱前加一個(gè)短的疼惜柱——保持色譜柱的性能包括色譜柱、恒溫器及連接管等

色譜柱——HPLC心臟部件由色譜柱管和固定相組成

——柱溫顯著影響組分的保留值恒溫器分析型制備型柱長(zhǎng)10～30cm，內(nèi)徑2～6mm，直型柱長(zhǎng)25～50cm，內(nèi)徑40～120mm注：HPLC分析通常在室溫下進(jìn)行四、檢測(cè)系統(tǒng)按其應(yīng)用范圍分為通用型和專用型（選擇性）1.紫外檢測(cè)器（ultraviolet-visibledetector,UVD或UV）2.熒光檢測(cè)器（fluorescencedetector,FD）3.電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemicaldetector,ED）5.示差折光檢測(cè)器（differentialreflactiveindexdetector,DRID）4.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporativelight-scatterdetector，ELSD）1.紫外檢測(cè)器（ultraviolet-visibledetector,UVD或UV）——應(yīng)用最廣泛的通用型檢測(cè)器

工作原理和結(jié)構(gòu)與一般紫外分光光度計(jì)相同被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光或可見光有選擇性吸取，待測(cè)組分濃度與吸光度的關(guān)系聽從Lambert-Beer定律不同之處：將樣品池改為體積很?。?～12ml）的流通池流通池示意圖1.流淌相出口2.流淌相入口3.透鏡32211Z型H型光路紫外檢測(cè)器的特點(diǎn)：(1)靈敏度高，最小檢測(cè)濃度為10-10g/ml(2)線性范圍寬，對(duì)溫度和流淌相流速波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫(3)應(yīng)用范圍廣泛紫外檢測(cè)器的種類固定波長(zhǎng)型可調(diào)波長(zhǎng)型二極管陣列檢測(cè)器光源檢測(cè)波長(zhǎng)特點(diǎn)低壓汞燈氘燈固定254nm或280nm190～800nm連續(xù)可調(diào)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)潔，但靈敏度和應(yīng)用范圍受限應(yīng)用廣泛三維色譜-光譜圖，給出光譜定性信息190～700nm快速掃描氘燈與UVD的主要區(qū)分：進(jìn)入流通池的光是整個(gè)紫外-可見光譜區(qū)的復(fù)合光，當(dāng)復(fù)合光被組分選擇性吸取后，其透過光具有了組分的光譜特征，此透過光被光柵分光后，照射到光電二極管陣列上二極管陣列檢測(cè)器——以光電二極管陣列作為檢測(cè)元件優(yōu)點(diǎn)：(1)可同時(shí)采集不同波長(zhǎng)下的色譜圖，以計(jì)算不同波長(zhǎng)的相對(duì)吸取比(2)可供應(yīng)UV-Vis譜，選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)(3)檢查色譜峰各個(gè)位置的光譜，可以評(píng)價(jià)物質(zhì)的純度(4)可利用色譜保留值規(guī)律及吸取光譜綜合進(jìn)行定性分析二極管陣列檢測(cè)器光路圖三維色譜-光譜圖時(shí)間波長(zhǎng)吸光度2.熒光檢測(cè)器（fluorescencedetectorFD）

原理及儀器結(jié)構(gòu)與熒光分析法相同熒光檢測(cè)器的特點(diǎn)：(1)靈敏度更高，比紫外檢測(cè)器高3～4個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限可達(dá)10-12～10-14g/ml(2)對(duì)溫度和流淌相流速的變更不敏感(3)可進(jìn)行梯度洗脫具有熒光特性的樣品受紫外光激發(fā)后放射熒光，在確定條件下其熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系——選擇性檢測(cè)器3.電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemicaldetectorED）對(duì)流淌相的要求：必需含有電解質(zhì)（離解常數(shù)高，在電極表面呈現(xiàn)惰性）常用的是安培檢測(cè)器檢測(cè)原理：測(cè)量電流與氧化還原物質(zhì)的濃度成正比——選擇性檢測(cè)器

電化學(xué)檢測(cè)器種類較多，有電導(dǎo)、庫(kù)侖、極譜、安培、電位等檢測(cè)器

缺點(diǎn)：(1)需運(yùn)用緩沖液作流淌相(2)電極壽命較短(3)不宜運(yùn)用梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：(1)靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)10-12g/ml(2)選擇性好（具有氧化還原活性的物質(zhì)）(3)線性范圍寬(4)設(shè)備簡(jiǎn)潔、成本低、操作便利4.示差折光檢測(cè)器（differentialreflactiveindexdetector,DRID）優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：(1)靈敏度不高(2)對(duì)溫度變更敏感(3)不能用于梯度洗脫檢測(cè)原理：——通用型檢測(cè)器利用純流淌相和含有被測(cè)組分的流淌相之間折光率的差別進(jìn)行檢測(cè)HPLC常用檢測(cè)器主要性能五、幫助裝置其他幫助裝置：(1