細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)技術1

細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術。通過細胞培養(yǎng)得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細胞得來，所以細胞培養(yǎng)技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。什么是細胞培養(yǎng)？2細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術。什么是細胞培養(yǎng)？2細胞培養(yǎng)技術2主要內(nèi)容實驗設備試劑及耗材清洗及滅菌細胞培養(yǎng)（細胞生長過程，細胞來源，細胞復蘇、傳代及凍存，細胞計數(shù)，活力測定，細胞污染）3細胞培養(yǎng)技術主要內(nèi)容實驗設備3細胞培養(yǎng)技術3一實驗設備超凈工作臺，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機電熱恒溫水槽液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱4細胞培養(yǎng)技術一實驗設備4細胞培養(yǎng)技術4

超凈臺生物安全柜酒精燈（√），離開要熄滅！酒精燈（×）5細胞培養(yǎng)技術超凈臺5CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2

。倒置顯微鏡6細胞培養(yǎng)技術CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2。倒6離心機電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平7細胞培養(yǎng)技術離心機電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平7細胞培養(yǎng)技7純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工作人員操作，注意安全！8細胞培養(yǎng)技術純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工8小結一實驗設備及功能超凈工作臺，生物安全柜------操作平臺CO2培養(yǎng)箱-------------------------細胞生長的空間倒置顯微鏡-------------------------觀察細胞離心機-------------------------------離心收集細胞電熱恒溫水槽----------------------加熱

液氮罐-------------------------------凍存細胞純水儀-------------------------------制備一級水壓力蒸汽消毒器--------------------滅菌電熱干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精燈安全）9細胞培養(yǎng)技術小結一實驗設備及功能（酒精燈安全）9細胞培養(yǎng)技術9二試劑及耗材培養(yǎng)基緩沖液消化液血清其他耗材10細胞培養(yǎng)技術二試劑及耗材培養(yǎng)基耗材10細胞培養(yǎng)技術10培養(yǎng)基

供給細胞營養(yǎng)和促使細胞增殖的基礎物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位碳水化合物：能量來源無機鹽：幫助細胞維持滲透壓平衡維生素：維持細胞生長的生物活性物質(zhì)，在細胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用11細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)基供給細胞營養(yǎng)和促使細胞增殖的基礎物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生11培養(yǎng)基分類

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纖維、上皮細胞（293），一些實體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：間充質(zhì)干細胞，單抗細胞融合

RPMI1640：血液細胞（HL60）、一些實體瘤細胞（BT474）酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）；酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導的實驗，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。ATCC/美國模式培養(yǎng)物集存庫12細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)基分類DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：12緩沖液（洗滌細胞）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液（常規(guī)實驗皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學方面的研究。

Hanks：平衡鹽溶液——無機鹽和葡萄糖濃度接近大部分動植物細胞的水平，可作為動植物細胞短期培養(yǎng)(幾個小時)。

D-Hank’s：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時）。13細胞培養(yǎng)技術緩沖液（洗滌細胞）PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作13消化液胰蛋白酶溶液

使細胞間蛋白質(zhì)水解、細胞離散。使用濃度0.25%。配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對胰酶產(chǎn)生抑制作用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+

、Mg2+來保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子，可使細胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。膠原酶溶液主要水解結締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。14細胞培養(yǎng)技術消化液胰蛋白酶溶液14細胞培養(yǎng)技術14提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細胞的起到某些保護作用。保存血清最好的方法？建議血清保存在-20℃。解凍后存放于4℃時，請勿超過一個月。（分裝）如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時，必須將解凍的血清充分混勻，并且勿將血清置于37℃太久。

血清15細胞培養(yǎng)技術提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因15青霉素-鏈霉素溶液

青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。分別阻止細菌細胞壁合成及細菌蛋白質(zhì)的組成，達到抑制細菌生長的作用，防止污染，對真菌和支原體無效。其他實驗所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測試劑（如MTT）、細胞因子（如SCF）等16細胞培養(yǎng)技術青霉素-鏈霉素溶液青霉素的工作濃度為100U/16試劑標注規(guī)范試劑名稱NaCl配制濃度0.5mM配制人張三配制日期2016.10.2117細胞培養(yǎng)技術試劑標注規(guī)范試劑名稱NaCl17細胞17耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板離心管、移液管槍尖其他18細胞培養(yǎng)技術耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板18細胞培養(yǎng)技術18小結二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）緩沖液（PBS、Hanks等）消化液（分類及應用）血清（作用、存儲及解凍方法）試劑標簽要規(guī)范耗材（分類、用途）19細胞培養(yǎng)技術小結二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）耗材（19在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個步驟）三清洗及滅菌20細胞培養(yǎng)技術在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響20消毒滅菌方法物理消毒滅菌法Co60輻射（γ射線）：破壞生物大分子（塑料制品）紫外線（200-300nm）：30min，阻止細菌、病毒核酸合成。（細胞室：用于空氣，操作臺表面等）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術器械等，由工作人員操作）干熱：160℃,2小時，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品）過濾：0.22μm濾膜過濾除菌（少量試劑）21細胞培養(yǎng)技術消毒滅菌方法物理消毒滅菌法21細胞培養(yǎng)技術21消毒滅菌方法化學消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機玻璃）1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破壞細胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）22細胞培養(yǎng)技術消毒滅菌方法22細胞培養(yǎng)技術22需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法：

-紫外線（超凈臺、生物安全柜）

-高壓蒸汽滅菌（準備好放在準備室502）

-75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火）小結三清洗及滅菌23細胞培養(yǎng)技術小結三清洗及滅菌23細胞培養(yǎng)技術23四細胞培養(yǎng)生長類型細胞來源細胞復蘇細胞傳代細胞凍存細胞計數(shù)活力測定污染種類24細胞培養(yǎng)技術四細胞培養(yǎng)生長類型細胞凍存24細胞培養(yǎng)技術24細胞的生長類型

粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。（絕大多數(shù)正常細胞及實體瘤細胞）

懸浮型細胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。（主要是白血病細胞等）小鼠單核巨噬細胞白血病細胞25細胞培養(yǎng)技術細胞的生長類型粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生25細胞貼壁過程26細胞培養(yǎng)技術細胞貼壁過程26細胞培養(yǎng)技術26每代貼壁細胞的生長過程游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細胞質(zhì)回縮，細胞體圓球形）貼壁期（細胞平均在10分鐘－4小時貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等）潛伏期（有生長活動，而無細胞分裂，一般為6～24小時對數(shù)生長期（細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳。

最適合進行實驗研究）停止期（平臺期）（細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性）（懸浮細胞沒有貼壁過程）27細胞培養(yǎng)技術每代貼壁細胞的生長過程27細胞培養(yǎng)技術27國內(nèi)可以買到細胞株的地方有哪些？ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理ECACC（歐洲細胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigma中國科學院細胞研究所中國醫(yī)學科學院（協(xié)和醫(yī)科大學）基礎醫(yī)學部武漢大學冷藏中心等細胞來源28細胞培養(yǎng)技術國內(nèi)可以買到細胞株的地方有哪些？細胞來源28細胞培養(yǎng)技術28

確定細胞株的培養(yǎng)信息（ATCC）配制培養(yǎng)基（基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準備準備工作29細胞培養(yǎng)技術準備工作29細胞培養(yǎng)技術29細胞復蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。（4）隔天換液，但貼壁細胞若未貼壁則勿需處理。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細胞。30細胞培養(yǎng)技術細胞復蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴30細胞傳代

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。31細胞培養(yǎng)技術細胞傳代31細胞培養(yǎng)技術31細胞傳代1懸浮細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶底時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。

2半貼壁細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。離心新鮮培養(yǎng)基懸浮鋪板32細胞培養(yǎng)技術細胞傳代1懸浮細胞傳代離心新鮮培養(yǎng)基懸32細胞傳代3貼壁細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的0.25％的胰酶。

吸掉上清，加入PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37℃消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開放式操作，小心謹慎、謹防污染！33細胞培養(yǎng)技術細胞傳代33細胞培養(yǎng)技術33細胞凍存（慢凍）1細胞凍存液（1ml/管）基礎培養(yǎng)基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亞砜，一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對細胞的損傷。）2細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1-8x106cells/ml緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。34細胞培養(yǎng)技術細胞凍存（慢凍）1細胞凍存液（1ml/管）緩慢冷凍，可使細34細胞凍存3慢凍程序傳統(tǒng)方法：4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存。程序降溫盒：利用異丙醇實現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過程中可以輔助實現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。35細胞培養(yǎng)技術細胞凍存3慢凍程序35細胞培養(yǎng)技術35細胞凍存36細胞培養(yǎng)技術細胞凍存36細胞培養(yǎng)技術36小結四細胞培養(yǎng)過程細胞生長類型及傳代方法細胞培養(yǎng)過程注意無菌操作（全程）準備工作復蘇（快）傳代（無菌）凍存（慢）實驗

細胞信息、方法凍存液成分、培養(yǎng)基、耗材程序37細胞培養(yǎng)技術小結四細胞培養(yǎng)過程細胞生長類型及傳代方法準備工作復蘇37細胞計數(shù)血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞38細胞培養(yǎng)技術細胞計數(shù)血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞38細胞培養(yǎng)技術38細胞培養(yǎng)技術培訓課件39細胞計數(shù)注意事項記上不記下，記左不記右。吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。40細胞培養(yǎng)技術細胞計數(shù)注意事項40細胞培養(yǎng)技術40培養(yǎng)細胞活力測定

細胞活力測定是體外實驗研究中應用最廣的技術手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。41細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

細胞活力測定是體外實驗研究中應用最廣的技術41培養(yǎng)細胞活力測定

1細胞克隆形成率實驗

單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰??？寺⌒纬陕剩剑寺⌒纬蓴?shù)／接種細胞數(shù)）×100%優(yōu)點：精確、可靠，適于貼壁細胞42細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

1細胞克隆形成率實驗

單個細胞在體外增殖42培養(yǎng)細胞活力測定

2臺盼藍法（0.4%）細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內(nèi)。故活細胞不被染色，死細胞染成藍色。用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活性。43細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

43細胞培養(yǎng)技術43培養(yǎng)細胞活力測定

3四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍。原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。44細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

3四唑鹽（MTT）比色法44細胞培養(yǎng)技術44細胞培養(yǎng)的污染類型細菌污染真菌污染支原體污染病毒污染非同種細胞污染化學污染45細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)的污染類型細菌污染45細胞培養(yǎng)技術45細菌污染小鼠胃癌細胞的球菌感染46細胞培養(yǎng)技術細菌污染小鼠胃癌細胞的球菌感染46細胞培養(yǎng)技術46念珠菌污染真菌污染絲狀菌污染47細胞培養(yǎng)技術念珠菌污染真菌污染絲狀菌污染47細胞培養(yǎng)技術47真菌污染典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團塊或白點，鏡下呈絲狀。400倍圖片48細胞培養(yǎng)技術真菌污染典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團塊或白點，鏡下呈絲狀48支原體污染支原體污染電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀

49細胞培養(yǎng)技術支原體污染支原體污染電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀49

細菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開放性操作之后。原代操作尤其注意！因此，細胞培養(yǎng)切記：“無菌”理念貫穿始終，包括：器皿、器械、耗材、培養(yǎng)基、試劑、操作習慣。（一旦污染、立即棄用！）

如何避免污染？細節(jié)決定成敗！50細胞培養(yǎng)技術細菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開放性50小結五實驗方法細胞計數(shù)的方法細胞活力測定的方法分類、原理及應用注意防止細胞污染51細胞培養(yǎng)技術小結五實驗方法細胞計數(shù)的方法51細胞培養(yǎng)技術51總結細胞實驗所需設備的類型及功能試劑及耗材的分類及各自用途清洗物品的過程及滅菌的方法細胞培養(yǎng)細胞生長過程，細胞來源細胞培養(yǎng)過程（復蘇、傳代及凍存）細胞計數(shù)及活力測定方法注意無菌操作，防止細胞污染

52細胞培養(yǎng)技術總結細胞實驗所需設備的類型及功能52細胞培養(yǎng)技術52實驗中心細胞培養(yǎng)室規(guī)章制度細胞實驗室是進行各種細胞培養(yǎng)的凈化實驗室，研究人員經(jīng)申請準入、培訓合格后方可進入細胞室；所有人員必須遵守實驗室規(guī)章制度，接受工作人員的管理。進入細胞室前必須穿工作服、換鞋，非實驗物品不得帶入室內(nèi)。嚴禁帶入易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激氣味的物品。注意消防安全，杜絕一切可能導致火災的行為。不得在細胞室內(nèi)進行病原性微生物等易傳染物的操作；進行病毒感染細胞的操作須報管理人員備案，在指定的生物安全柜內(nèi)（8室）進行，使用一次性耗材，并遵守生物安全操作規(guī)范。實驗室公用物品在使用后必須放回原處，不得外借或帶到其它實驗室；不得擅自更改儀器程序；儀器發(fā)生異常時，應立即向管理人員報告。若因不按操作規(guī)程使用造成儀器損壞，使用者應酌情賠償。配制試劑應數(shù)量適當，標注規(guī)范，按規(guī)定妥善存放。無菌試劑專人專用，防止交叉污染。未經(jīng)允許，不得使用他人物品及翻看他人細胞。若發(fā)現(xiàn)細胞被污染，應立即棄用，禁止繼續(xù)培養(yǎng)和凍存。進入細胞實驗室的所有新細胞株，由管理人員建立細胞株庫。其他細胞的凍存，由實驗者標記明確后存入指定位置。實驗結束后，應及時清理桌面和地面，整理實驗器材。觀察培養(yǎng)箱，待溫度及CO2濃度正常后方可離開。廢棄物品應及時帶出操作間，進行相應處理。遵守生物垃圾、利器和生活垃圾分類存放規(guī)定，禁止向水槽內(nèi)倒入雜物、腐蝕性液體和有毒試劑等。53細胞培養(yǎng)技術實驗中心細胞培養(yǎng)室規(guī)章制度53細胞培養(yǎng)技術53THANKS!54細胞培養(yǎng)技術THANKS!54細胞培養(yǎng)技術54細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)技術55

細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術。通過細胞培養(yǎng)得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細胞得來，所以細胞培養(yǎng)技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。什么是細胞培養(yǎng)？56細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術。什么是細胞培養(yǎng)？2細胞培養(yǎng)技術56主要內(nèi)容實驗設備試劑及耗材清洗及滅菌細胞培養(yǎng)（細胞生長過程，細胞來源，細胞復蘇、傳代及凍存，細胞計數(shù)，活力測定，細胞污染）57細胞培養(yǎng)技術主要內(nèi)容實驗設備3細胞培養(yǎng)技術57一實驗設備超凈工作臺，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機電熱恒溫水槽液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱58細胞培養(yǎng)技術一實驗設備4細胞培養(yǎng)技術58

超凈臺生物安全柜酒精燈（√），離開要熄滅！酒精燈（×）59細胞培養(yǎng)技術超凈臺59CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2

。倒置顯微鏡60細胞培養(yǎng)技術CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2。倒60離心機電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平61細胞培養(yǎng)技術離心機電熱恒溫水槽液氮：-196℃液氮罐配平7細胞培養(yǎng)技61純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工作人員操作，注意安全！62細胞培養(yǎng)技術純水儀壓力蒸汽滅菌器電熱干燥箱由工62小結一實驗設備及功能超凈工作臺，生物安全柜------操作平臺CO2培養(yǎng)箱-------------------------細胞生長的空間倒置顯微鏡-------------------------觀察細胞離心機-------------------------------離心收集細胞電熱恒溫水槽----------------------加熱

液氮罐-------------------------------凍存細胞純水儀-------------------------------制備一級水壓力蒸汽消毒器--------------------滅菌電熱干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精燈安全）63細胞培養(yǎng)技術小結一實驗設備及功能（酒精燈安全）9細胞培養(yǎng)技術63二試劑及耗材培養(yǎng)基緩沖液消化液血清其他耗材64細胞培養(yǎng)技術二試劑及耗材培養(yǎng)基耗材10細胞培養(yǎng)技術64培養(yǎng)基

供給細胞營養(yǎng)和促使細胞增殖的基礎物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位碳水化合物：能量來源無機鹽：幫助細胞維持滲透壓平衡維生素：維持細胞生長的生物活性物質(zhì)，在細胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用65細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)基供給細胞營養(yǎng)和促使細胞增殖的基礎物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生65培養(yǎng)基分類

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纖維、上皮細胞（293），一些實體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：間充質(zhì)干細胞，單抗細胞融合

RPMI1640：血液細胞（HL60）、一些實體瘤細胞（BT474）酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）；酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導的實驗，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。ATCC/美國模式培養(yǎng)物集存庫66細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)基分類DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：66緩沖液（洗滌細胞）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液（常規(guī)實驗皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學方面的研究。

Hanks：平衡鹽溶液——無機鹽和葡萄糖濃度接近大部分動植物細胞的水平，可作為動植物細胞短期培養(yǎng)(幾個小時)。

D-Hank’s：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時）。67細胞培養(yǎng)技術緩沖液（洗滌細胞）PBS：磷酸緩沖鹽溶液——具有pH緩沖作67消化液胰蛋白酶溶液

使細胞間蛋白質(zhì)水解、細胞離散。使用濃度0.25%。配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對胰酶產(chǎn)生抑制作用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+

、Mg2+來保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子，可使細胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。膠原酶溶液主要水解結締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。68細胞培養(yǎng)技術消化液胰蛋白酶溶液14細胞培養(yǎng)技術68提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細胞的起到某些保護作用。保存血清最好的方法？建議血清保存在-20℃。解凍后存放于4℃時，請勿超過一個月。（分裝）如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議從冷凍箱取出后，置于2～8℃冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時，必須將解凍的血清充分混勻，并且勿將血清置于37℃太久。

血清69細胞培養(yǎng)技術提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因69青霉素-鏈霉素溶液

青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。分別阻止細菌細胞壁合成及細菌蛋白質(zhì)的組成，達到抑制細菌生長的作用，防止污染，對真菌和支原體無效。其他實驗所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測試劑（如MTT）、細胞因子（如SCF）等70細胞培養(yǎng)技術青霉素-鏈霉素溶液青霉素的工作濃度為100U/70試劑標注規(guī)范試劑名稱NaCl配制濃度0.5mM配制人張三配制日期2016.10.2171細胞培養(yǎng)技術試劑標注規(guī)范試劑名稱NaCl17細胞71耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板離心管、移液管槍尖其他72細胞培養(yǎng)技術耗材培養(yǎng)皿、瓶、孔板18細胞培養(yǎng)技術72小結二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）緩沖液（PBS、Hanks等）消化液（分類及應用）血清（作用、存儲及解凍方法）試劑標簽要規(guī)范耗材（分類、用途）73細胞培養(yǎng)技術小結二試劑及耗材的分類及用途培養(yǎng)基（成分、分類）耗材（73在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個步驟）三清洗及滅菌74細胞培養(yǎng)技術在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響74消毒滅菌方法物理消毒滅菌法Co60輻射（γ射線）：破壞生物大分子（塑料制品）紫外線（200-300nm）：30min，阻止細菌、病毒核酸合成。（細胞室：用于空氣，操作臺表面等）濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術器械等，由工作人員操作）干熱：160℃,2小時，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品）過濾：0.22μm濾膜過濾除菌（少量試劑）75細胞培養(yǎng)技術消毒滅菌方法物理消毒滅菌法21細胞培養(yǎng)技術75消毒滅菌方法化學消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機玻璃）1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破壞細胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）76細胞培養(yǎng)技術消毒滅菌方法22細胞培養(yǎng)技術76需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法：

-紫外線（超凈臺、生物安全柜）

-高壓蒸汽滅菌（準備好放在準備室502）

-75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火）小結三清洗及滅菌77細胞培養(yǎng)技術小結三清洗及滅菌23細胞培養(yǎng)技術77四細胞培養(yǎng)生長類型細胞來源細胞復蘇細胞傳代細胞凍存細胞計數(shù)活力測定污染種類78細胞培養(yǎng)技術四細胞培養(yǎng)生長類型細胞凍存24細胞培養(yǎng)技術78細胞的生長類型

粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。（絕大多數(shù)正常細胞及實體瘤細胞）

懸浮型細胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。（主要是白血病細胞等）小鼠單核巨噬細胞白血病細胞79細胞培養(yǎng)技術細胞的生長類型粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生79細胞貼壁過程80細胞培養(yǎng)技術細胞貼壁過程26細胞培養(yǎng)技術80每代貼壁細胞的生長過程游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細胞質(zhì)回縮，細胞體圓球形）貼壁期（細胞平均在10分鐘－4小時貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等）潛伏期（有生長活動，而無細胞分裂，一般為6～24小時對數(shù)生長期（細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳。

最適合進行實驗研究）停止期（平臺期）（細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性）（懸浮細胞沒有貼壁過程）81細胞培養(yǎng)技術每代貼壁細胞的生長過程27細胞培養(yǎng)技術81國內(nèi)可以買到細胞株的地方有哪些？ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理ECACC（歐洲細胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigma中國科學院細胞研究所中國醫(yī)學科學院（協(xié)和醫(yī)科大學）基礎醫(yī)學部武漢大學冷藏中心等細胞來源82細胞培養(yǎng)技術國內(nèi)可以買到細胞株的地方有哪些？細胞來源28細胞培養(yǎng)技術82

確定細胞株的培養(yǎng)信息（ATCC）配制培養(yǎng)基（基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準備準備工作83細胞培養(yǎng)技術準備工作29細胞培養(yǎng)技術83細胞復蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。（4）隔天換液，但貼壁細胞若未貼壁則勿需處理。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細胞。84細胞培養(yǎng)技術細胞復蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴84細胞傳代

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。85細胞培養(yǎng)技術細胞傳代31細胞培養(yǎng)技術85細胞傳代1懸浮細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶底時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。

2半貼壁細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。離心新鮮培養(yǎng)基懸浮鋪板86細胞培養(yǎng)技術細胞傳代1懸浮細胞傳代離心新鮮培養(yǎng)基懸86細胞傳代3貼壁細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的0.25％的胰酶。

吸掉上清，加入PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37℃消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開放式操作，小心謹慎、謹防污染！87細胞培養(yǎng)技術細胞傳代33細胞培養(yǎng)技術87細胞凍存（慢凍）1細胞凍存液（1ml/管）基礎培養(yǎng)基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亞砜，一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對細胞的損傷。）2細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1-8x106cells/ml緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。88細胞培養(yǎng)技術細胞凍存（慢凍）1細胞凍存液（1ml/管）緩慢冷凍，可使細88細胞凍存3慢凍程序傳統(tǒng)方法：4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存。程序降溫盒：利用異丙醇實現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過程中可以輔助實現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。89細胞培養(yǎng)技術細胞凍存3慢凍程序35細胞培養(yǎng)技術89細胞凍存90細胞培養(yǎng)技術細胞凍存36細胞培養(yǎng)技術90小結四細胞培養(yǎng)過程細胞生長類型及傳代方法細胞培養(yǎng)過程注意無菌操作（全程）準備工作復蘇（快）傳代（無菌）凍存（慢）實驗

細胞信息、方法凍存液成分、培養(yǎng)基、耗材程序91細胞培養(yǎng)技術小結四細胞培養(yǎng)過程細胞生長類型及傳代方法準備工作復蘇91細胞計數(shù)血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞92細胞培養(yǎng)技術細胞計數(shù)血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞38細胞培養(yǎng)技術92細胞培養(yǎng)技術培訓課件93細胞計數(shù)注意事項記上不記下，記左不記右。吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。94細胞培養(yǎng)技術細胞計數(shù)注意事項40細胞培養(yǎng)技術94培養(yǎng)細胞活力測定

細胞活力測定是體外實驗研究中應用最廣的技術手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。95細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

細胞活力測定是體外實驗研究中應用最廣的技術95培養(yǎng)細胞活力測定

1細胞克隆形成率實驗

單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰Α？寺⌒纬陕剩剑寺⌒纬蓴?shù)／接種細胞數(shù)）×100%優(yōu)點：精確、可靠，適于貼壁細胞96細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

1細胞克隆形成率實驗

單個細胞在體外增殖96培養(yǎng)細胞活力測定

2臺盼藍法（0.4%）細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內(nèi)。故活細胞不被染色，死細胞染成藍色。用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活性。97細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞活力測定

43細胞培養(yǎng)技術97培養(yǎng)細胞活力