病毒感染力的滴定第一頁，共25頁。半數(shù)致死量LD50（50%lethaldose）半數(shù)感染量ID50(50%infectivedose)半數(shù)雞胚致死量ELD50(egg50%lethaldose)半數(shù)雞胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID50（tissueculture50%infectivedose)蝕斑形成單位（plaqueformingunit，PFU）測定病毒感染力的方法:第二頁，共25頁。將病毒作一定梯度的連續(xù)稀釋后接種于實驗動物或雞胚或培養(yǎng)細胞，每一稀釋度作多個重復，在一定時間內，記錄動物（雞胚）發(fā)病或死亡的數(shù)量或細胞病變的情況，利用Reed-Muench法或Karber法計算病毒的感染力。測定病毒感染力的基本過程:第三頁，共25頁。一、病毒TCID50的測定操作步驟在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100μl。在每孔加入細胞懸液100μl，使細胞量達到3×105個/ml。第四頁，共25頁。設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5-7天。結果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法第五頁，共25頁。10-110-210-310-410-510-610-710-8TCID50的計算方法（CalculationofTCID50）第六頁，共25頁。病毒液出現(xiàn)無CPE累計出現(xiàn)CPE孔稀釋度CPE孔數(shù)孔數(shù)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)所占的%10-180510100（51/51）

10-280430100（43/43）

10-380350100（35/35）

10-480270100（27/27）

10-580190100（19/19）

10-67111191.7（11/12）

10-7354640（4/10）

10-8171137.1（1/14）

1、Reed-Muench法CPE：Cytopathiceffect第七頁，共25頁。距離比例＝（高于50%病變率的百分數(shù)-50%）/（高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù)）＝（91.7-50）/（91.7-40）＝0.8第八頁，共25頁。lgTCID50=距離此例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)

=0.8×(-1)+(-6)=-6.8TCID50=10-6.8／0.1ml含義：將該病毒稀釋106.8倍接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl，可使50%接種孔的細胞發(fā)生病變。第九頁，共25頁。

2、Karber法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率

10-188/8=110-288/8=110-38

8/8=110-488/8=110-58

8/8=110-67

7/8=0.87510-73

3/8=0.37510-811/8=0.125第十頁，共25頁。lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高濃度的稀釋度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(6.375-0.5)=-6.875TCID50=10-6.875/0.1ml第十一頁，共25頁。二、病毒蝕（噬）斑技術病毒蝕斑（plaque)

又稱空斑，指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。第十二頁，共25頁。原理：適當稀釋的病毒懸液接種已經長成單層的敏感細胞后，在覆蓋的固體或半固體介質（瓊脂糖、甲基纖維素）的作用下，病毒在最初感染的細胞內增殖后，只能進而感染并破壞臨近的細胞，經過幾個增殖周期后，形成一個局限性的肉眼可見的病變細胞區(qū)，即局限性的病灶。plaques第十三頁，共25頁。Procedures第十四頁，共25頁。操作步驟將敏感細胞在平皿或6孔板內培養(yǎng)成單層吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內的單層細胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。（一）用瓊脂糖覆蓋，中性紅染色第十五頁，共25頁。將培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔點瓊脂糖，融化后降溫至38-42℃，與等量預熱至38-42℃含6%-10%犢牛血清的無酚紅DMEM混合，注入細胞培養(yǎng)板中。第十六頁，共25頁。室溫放置直至瓊脂糖凝固，或于4℃冰箱放置幾分鐘至瓊脂糖凝固，然后于37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天于顯微鏡下觀察細胞病變情況。出現(xiàn)空斑后（2-3天），用含鈣、鎂的PBS將0.1%的中性紅貯存液10倍稀釋后滴加到細胞培養(yǎng)板上。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中作用1h，吸棄染液，繼續(xù)于溫箱中培養(yǎng)2-3h。第十七頁，共25頁。TK-突變株與野毒形成的空斑的比較第十八頁，共25頁。（二）用甲基纖維素覆蓋，結晶紫染色將敏感細胞在平皿或6孔板內培養(yǎng)成單層。吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內的單層細胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。將培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。第十九頁，共25頁。覆蓋配好的4%羧甲基纖維素鈉（含3%新生牛血清）。48-72h后，待細胞出現(xiàn)病變或蝕斑時，各孔補滿10%中性甲醛，固定4h以上。棄掉孔中液體，流水側板沖洗數(shù)次。各孔補加配好的結晶紫溶液（0.35%、w/v），作用15min。棄掉染液，繼續(xù)沖洗數(shù)次，在37℃溫箱中敞口烘干，顯微鏡下計空斑數(shù)。第二十頁，共25頁。第二十一頁，共25頁。蝕斑技術的應用：用于病毒純化：挑選病毒的克隆株測定病毒懸液中感染病毒的含量第二十二頁，共25頁。如果是作病毒純化

挑取空斑于200μL維持液中，反復凍融3次，接種于PK-15細胞已長成單層的24孔細胞培養(yǎng)板，再于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至完全發(fā)生病變。第二十三頁，共25頁。一般的毒種純化：收集病變的細胞懸液，通過PCR或其它方法進行鑒定，并測定TCID50，然后選TCID50較高者再作幾輪空斑