1、篩選多肽試劑及配制LB培養(yǎng)基： TOC o 1-5 h z 胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5g溶于去離子水，至1L，高壓滅菌，4c保存。IPTG/Xgal：稱取1.25g IPTG, 1.0g Xgal,溶于二甲基甲酰胺，至總體積25ml, -20避光保存。LB/IPTG/Xgal 平板：1L LB培養(yǎng)基+15g瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70以下，加入1ml IPTG/Xgal,立 即鋪板，4避光保存。頂層瓊脂糖凝膠： TOC o 1-5 h z 胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5g HYPERLINK l bookmark8 o Current Document MgCl2.6H2O

2、1g瓊脂糖7g溶于適量去離子水中，至總體積為1L。高壓滅菌，分裝為50ml/份，室溫保存，使 用時(shí)于微波爐內(nèi)融化。2XM9 鹽：Na2HpO412gKH2PO46gNaCl1gNH4Cl2g溶于適量去離子水中，至終體積為1L。小型平板：500ml2XM9 鹽500ml3%瓊脂粉20ml20%葡萄糖2ml 1M MgSO40.1ml 1M CaCl21ml 硫胺素(10mg/ml)在混合之前，將上述成分分別高壓滅菌并冷卻至70以下，葡萄糖和硫胺素采用過(guò) 濾除菌。平板儲(chǔ)存于4。封閉緩沖液：0.1M NaHCO3 (PH 8.6)5mg/ml BSA0.02% NaN3過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存于4。TBS：5

3、0mM Tris-HCl (PH 7.5)150mM NaCl高壓滅菌，室溫儲(chǔ)存。PEG/NaCl：20% (w/v)聚乙二醇-80002.5M NaCl高壓滅菌，室溫儲(chǔ)存。(10)碘化物緩沖液：10mM Tris-HCl (PH 8.0)1mM EDTA4M NaI室溫避光保存。操作步驟：.第一天以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制備100ug/ml的靶分子溶液。如果需要穩(wěn)定靶分子，可以用含有金屬離子的相似離子強(qiáng)度緩沖液。在每孔內(nèi)加入1.5ml靶分子溶液，重復(fù)渦旋直至表面完全濕潤(rùn)(這一步要多注 意，盡量避免溶液形成液珠)。在濕盒中，4c溫和振蕩孵育過(guò)夜。4c保存于濕盒中備用。.第二天(

4、4)將ER2537 (滴度測(cè)定時(shí)用來(lái)鋪板的細(xì)菌培養(yǎng)物)接種至10ml LB培養(yǎng)基中。如果 是在同一天擴(kuò)增洗脫的噬菌體，也可以將ER2537過(guò)夜培養(yǎng)物接種于含有20ml LB培養(yǎng)基的 250ml錐形瓶中(比例為1：100)。37劇烈振搖。(5)將平皿反扣在潔凈的紙巾上，去除包被液，加滿封閉液，4孵育至少1h。(6)去除包被液。用TBST (TBS+0.1%Tween-20)快速洗滌6次。反復(fù)旋轉(zhuǎn)確?？椎准?孔側(cè)面都被洗滌。按照步驟5的方法去除洗滌液(也可利用自動(dòng)洗板機(jī)洗滌)。洗滌要迅速， 避免平皿干燥。(注意每次更換紙巾，以避免交叉污染)。(7)用1ml TBST稀釋4X1010噬菌體(10ul

5、原庫(kù))，加至包被后的平皿內(nèi)，室溫下輕 緩搖動(dòng)10-60min。(8)以步驟5的方法去除未結(jié)合的噬菌體。(9)以步驟6的方法用TBST洗滌板子10次，每次換用潔凈的紙巾，避免交叉污染。(10)用1ml的洗脫緩沖液洗脫結(jié)合的噬菌體。洗脫液可以是含有配體(0.1-1mM)的 TBS,或是含有靶蛋白(100ug/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合噬菌體。室 溫下輕緩搖動(dòng)10-60min。將洗脫液轉(zhuǎn)入微量離心管中。(10a)或使用通用緩沖液，0.2M甘氨酸-鹽酸(PH2.2),1mg/ml BSA。輕緩搖動(dòng)不超 過(guò)10min,將洗脫液轉(zhuǎn)入微量離心管中，以150ul 1M Tris-HCl(P

6、H 9.1)中和。(11)取小量洗脫液(11)測(cè)定滴度，如果有必要，可將第一輪或第二輪測(cè)定滴度的 噬斑進(jìn)行測(cè)序(見(jiàn)后續(xù)操作)。(未用的洗脫物可4保存過(guò)夜，第二天進(jìn)行擴(kuò)增。在這種情 況下，用LB過(guò)夜培養(yǎng)ER2537,第二天，用LB培養(yǎng)基以1：100將該培養(yǎng)物稀釋至20ml,加 入未擴(kuò)增的洗脫液，在250ml的錐形瓶?jī)?nèi)，37劇烈振搖孵育4.5乩進(jìn)入步驟13)。(12)將剩余的洗脫物進(jìn)行擴(kuò)增：將洗脫物加入20ml ER2537培養(yǎng)物中(對(duì)數(shù)早期)， 37劇烈振搖孵育4.5h。(13)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，4,10000轉(zhuǎn)離4 10min,將上清轉(zhuǎn)入新的離心管 中，再次離心。(14)將80%的上清

7、轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1/6體積的PEG/ NaCl。4沉淀噬菌體至 少60min或過(guò)夜。.第三天4, 10000轉(zhuǎn)離4PEG的沉淀物15min,傾去上清，再次離心，吸去多余的上清。(16)用1ml TBS懸浮沉淀物并轉(zhuǎn)入微量離心管中，4離心519使殘留的細(xì)胞沉淀。(17)將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，用1/6體積的PEG/ NaCl再次進(jìn)行沉淀，冰上孵育 15-60min。4離心10min,棄上清，再次短暫離心，用微量槍頭吸去殘留的上清。(18)用200P1 TBS, 0.02% NaN3懸浮沉淀物，離4 1min,將上清轉(zhuǎn)入新管中，即為 擴(kuò)增的洗脫液。(19)測(cè)定洗脫物在擴(kuò)增后的濃度，貯存于4。

8、(20)包被平皿進(jìn)行第二輪篩選，同步驟1-3。.第四天和第五天(21)計(jì)數(shù)藍(lán)色噬斑，確定噬菌體的滴度，計(jì)算對(duì)應(yīng)于1X1011-2X1011 pfu的噬菌體體 積。如果滴度太低，在篩選時(shí)可采用對(duì)應(yīng)于109 pfu的噬菌體體積。(22)進(jìn)行第二輪篩選：重復(fù)步驟4-18,用含1X1011-2X1011 pfu噬菌體的第一輪擴(kuò) 增洗脫液進(jìn)行篩選，將洗滌液中的Tween 20濃度增至0.5%。(23)測(cè)定第二輪篩選擴(kuò)增洗脫液的滴度。(24)包被平皿進(jìn)行第三輪篩選，步驟1-3。.第六天(25)進(jìn)行第三輪篩選：用第二輪擴(kuò)增洗脫液中1X1011-2X1011 pfu噬菌體進(jìn)行篩選， 洗滌時(shí)，Tween 20的

9、濃度仍為0.5%。(26)測(cè)定未擴(kuò)增的第三輪洗脫液的滴度。如果不進(jìn)行第四輪篩選則不必?cái)U(kuò)增第三輪的 篩選洗脫物。滴度測(cè)定時(shí)的藍(lán)色噬斑可用于測(cè)序：平板的孵育時(shí)間不得長(zhǎng)于18h,因?yàn)闀r(shí)間 過(guò)長(zhǎng)可能造成噬菌體感染率下降。將剩余得洗脫物保存于4。(27)選取單克隆ER2537過(guò)夜培養(yǎng)。噬菌體滴度的測(cè)定材料和試劑微波爐。LB/IPTG/Xgal 培養(yǎng)板。LB培養(yǎng)基。頂層瓊脂糖凝膠。操作步驟在5-10m1 LB培養(yǎng)基中接種單個(gè)ER2537克隆，振搖孵育直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600=0.5)在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，微波融化頂層瓊脂糖凝膠，分裝至無(wú)菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管3ml。維持 在45備用。37預(yù)熱LB/IPTG/Xgal

10、培養(yǎng)板，備用。以LB培養(yǎng)基10倍比稀釋噬菌體。建議稀釋范圍：對(duì)擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)上清，108-1011；對(duì)未擴(kuò)增的篩選洗脫液，101-104。每 次稀釋都換用新的加樣槍頭，最好使用氣溶膠阻隔槍頭以避免交叉污染。一旦ER2537培養(yǎng)物長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，分裝至微量離心管中，每管200ul。將倍比稀釋的噬菌體上清加入含細(xì)菌培養(yǎng)物的微量離心管中，一支微量離心管中僅 加入一種稀釋液10Dl,快速渦旋，室溫孵育1-5min。轉(zhuǎn)移至含有45頂層瓊脂糖凝膠的管中，快速渦旋混勻，立即傾倒至預(yù)熱的LB/IPTG/Xgal平板上，輕緩搖動(dòng)平板使頂層膠均勻分布。冷卻平板5min，37倒置培養(yǎng)過(guò)夜。噬斑計(jì)數(shù)以噬斑數(shù)為10

11、0左右的平皿為準(zhǔn)，噬斑數(shù)乘以稀釋度即可獲得每101噬 菌體的滴度-噬斑形成單位(pfu)。噬斑的擴(kuò)增材料和試劑(1)恒溫?fù)u床(2)培養(yǎng)管(3) LB培養(yǎng)基(4)甘油操作步驟(1)以LB培養(yǎng)基稀釋ER2537過(guò)夜培養(yǎng)物。1ml分裝至培養(yǎng)管，每管中接種一個(gè)克隆。 第三輪篩選后，每10個(gè)克隆就可能獲得一個(gè)共同序列。使用消毒牙簽或槍頭，穿刺噬斑，接種至上述培養(yǎng)管中。注意：要挑選噬斑數(shù)不超 過(guò)100的平板上的噬斑，從而保證每一個(gè)噬斑僅包含單個(gè)DNA序列。37振搖孵育4.5-5h (不能過(guò)長(zhǎng))?？勺隹刹蛔觥３藴y(cè)定單個(gè)克隆的序列，也可將篩選到的全部噬菌體進(jìn)行測(cè)序，一 步就可能獲得12個(gè)殘基中的共有序列。取

12、10 ul未擴(kuò)增的洗脫物加至1ml宿主菌稀 釋液中37振搖孵育4.5-5h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至微量離心管，離心30s,取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中再次離心，取上部 約80%的上清轉(zhuǎn)至新的離心管。這是擴(kuò)增的噬菌體貯存液，能4保存數(shù)周，若需長(zhǎng) 期保存，以無(wú)菌甘油1：1稀釋后，-20保存。測(cè)序模板的快速純化材料和試劑真空泵PEG/ NaCl 溶液碘化物緩沖液70%乙醇TE 緩沖液：10mM Tris-HCl , PH 8.0mM EDTA操作步驟擴(kuò)增噬斑(見(jiàn)上述)，在第一次離心后，將500 ul含有噬菌體的上清轉(zhuǎn)入新的離心 管中。(2)力口入2001 PEG/ NaCl,顛倒混勻，室溫靜置10min。離心10m

13、in,傾去上清。再次短暫離心，仔細(xì)吸去殘留上清。用100ul碘化物緩沖液完全重懸沉淀物，加入250乙醇。室溫孵育10min,室 溫短暫孵育將選擇性沉淀單鏈?zhǔn)删wDNA,而大部分噬菌體蛋白保留在溶液中。離心101 傾去上清，用70%乙醇洗滌沉淀物，真空吸干。用30ul TE緩沖液重懸沉淀物。取5ul作為測(cè)序模板，或根據(jù)需要增減。ELISA檢測(cè)篩選到的靶分子結(jié)合肽材料和試劑酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀。濕盒。吸水紙。LB培養(yǎng)基。PEG/ NaCloTBSo0.1M NaHCO3 (PH 8.6)。HRP底物緩沖液。ABTS貯存液：在100ml 50mM的檸檬酸鈉溶液(PH 4.0)中溶解22mgABTS,過(guò)濾除

14、菌貯存在 4。操作步驟噬斑擴(kuò)增上清部分用于DNA序列測(cè)定，其余保存于4。將ER2537 接種至20mlLB培養(yǎng)基中，37孵育至輕微混濁，或?qū)⑦^(guò)夜培養(yǎng)的ER2537按1： 100稀釋至20ml。加入5噬菌體上清，37劇烈通氣培養(yǎng)4.5h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管，10000轉(zhuǎn)離心10min。取上清轉(zhuǎn)入新的離心管，再次離心。吸取上層80%的上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入1/6體積的PEG/ NaCl, 4沉淀1h或過(guò) 夜。4,10000轉(zhuǎn)離4PEG沉淀物15min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。用1ml TBS懸浮沉淀物，并轉(zhuǎn)至微量離心管中，4離心519以沉淀殘留細(xì)胞。將上清轉(zhuǎn)至新離心管中，再次用1/

15、6體積的PEG/ NaCl沉淀噬菌體。冰上孵育 15-60min, 4離心10min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。用50ul TBS懸浮沉淀物。測(cè)定滴度，貯存于4。(10)取100-200 u l溶于0.1M NaHCO3 (PH 8.6)的100ug/ml靶蛋白包被酶標(biāo)板的加樣孔， 在密封的濕盒內(nèi)4c孵育過(guò)夜。每一個(gè)克隆包被一列。(11)傾去靶溶液，并將板子反扣在吸水紙上盡量吸干。在每一個(gè)孔中加滿封閉緩沖液。 另外，每個(gè)克隆都需要封閉一列未包被的加樣孔，以檢測(cè)其與BSA包被板子的結(jié)合。 封閉另一個(gè)酶標(biāo)板用來(lái)稀釋噬菌體，這樣可以保證稀釋過(guò)程中噬菌體不被靶蛋白吸 收。4封閉1-2ho(12)傾去封閉液，用1 (TBS/Tween洗滌板子6次，每次都將酶標(biāo)板反扣在吸水紙上盡 量吸干。Tween的濃度應(yīng)該與篩選洗滌步驟的濃度相同。(13)用TBS/Tween 4倍比稀釋噬菌體，200ul/孔，第一孔為1012顆粒，第十二孔為2X 105顆粒。(14)用多道加樣槍?zhuān)瑢⒚恳涣斜侗认♂尩氖删w轉(zhuǎn)至靶蛋白包被的酶標(biāo)板內(nèi)。室溫振蕩 孵育1-2ho(15)用 1XTBS/Tween 洗板 6 次。(16)用封閉緩沖