1、核酸雜交醫(yī)學知識核酸雜交醫(yī)學知識 第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理 DNA和DNA鏈、RNA與DNA鏈或兩條RNA鏈之間，只要具有一定的互補序列均可在適當?shù)臈l件下發(fā)生雜交。常用已知的DNA或RNA的片段作為探針，包括特異的DNA序列，或轉錄的RNA序列或cDNA序列，或人工合成的寡核苷酸片段。 根據(jù)支持物的不同，分為固相雜交和液相雜交。固相雜交又包括膜上印跡雜交和細胞原位雜交兩種。膜上印跡雜交即將核酸從細胞中分離純化后，在體外與探針雜交，細胞原位雜交是在細胞內進行的雜交。 核酸雜交醫(yī)學知識2 第一節(jié) 核酸分子雜交的基第二節(jié) 核酸探針 核酸探針是指帶有放射性同位素、生物素或其他活性物質標記的某種特

2、定的DNA或RNA片段。一、核酸探針的類型 基因組DNA探針 用克隆化的基因片段作探針應盡可能選用基因的編碼序列(外顯子)。 cDNA探針 與mRNA互補的DNA鏈稱cDNA，特異性高，是一種較理想的核酸探針。 核酸雜交醫(yī)學知識3第二節(jié) 核酸探針核酸雜交醫(yī)學知識3 RNA探針RNA探針有下述優(yōu)點：雜交體的穩(wěn)定性高，雜交反應條件嚴格，特異性更高。RNA單鏈不存在雙鏈DNA探針的互補雙鏈的復性，雜交效率較高。RNA無高度重復序列，非特異雜交少。雜交后用RNase消化未雜交的RNA探針，可降低雜交本底。核酸雜交醫(yī)學知識4 RNA探針核酸雜交醫(yī)學知識4 寡核苷酸探針寡核苷酸探針是由實驗者設計、經(jīng)核苷酸

3、合成儀人工合成的。1.探針制備方便，可以根據(jù)需要設計合成各種寡核苷酸片段，從基因組DNA文庫或cDNA文庫中篩選特定的克隆。2.非常適用于檢測已知序列基因中的點突變或定點誘變技術產(chǎn)生的點突變。3.用新的酶促方法標記可以得到高比活度標記探針。核酸雜交醫(yī)學知識5 寡核苷酸探針核酸雜交醫(yī)學知識5二、標記物標記物與探針的結合不影響雜交的特異性和穩(wěn)定性。 放射性同位素放射性同位素探針標記物，有高度特異性，缺點是易造成放射性污染，半衰期較短，不能長期存放。常用的有32P、3H、35S，有時也用14C、125I或131I。 非放射性標記物(1) 半抗原: 如生物素, 地高辛等 (2) 配體 (3) 熒光素:

4、 羅丹明等 (4) 化學發(fā)光技術核酸雜交醫(yī)學知識6二、標記物核酸雜交醫(yī)學知識6三、探針放射性同位素標記法 放射性同位素的選擇 32P、35S或3H均可用于標記DNA或RNA。32P最常用于核酸的標記。35S適用于原位雜交和DNA序列測定。3H放射比活度低，故常用于原位雜交。核酸雜交醫(yī)學知識7三、探針放射性同位素標記法核酸雜交醫(yī)學知識7 核酸探針的標記方法缺口平移法(圖7-1) 大腸桿菌DNA聚合酶I具有53DNA聚合酶活性，以相對應的鏈為模板，從切口處3-OH端逐個加入新的核苷酸，此酶還具有53外切核酸酶活性，可從切口的5端逐個切去核苷酸，造成切口平移。若反應體系中存在一種或多種標記的核苷酸，

5、如-32P dNTP，則隨著反應的進行，這些標記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標記的DNA探針。缺口平移法適用于標記大于1 kb的雙鏈DNA。 核酸雜交醫(yī)學知識8 核酸探針的標記方法核酸雜交醫(yī)學知識8隨機引物法(圖7-2) 隨機引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用隨機引物，沿單鏈模板進行DNA的合成。核酸雜交醫(yī)學知識9隨機引物法(圖7-2)核酸雜交醫(yī)學知識9核酸雜交醫(yī)學知識培訓課件(2) T4DNA聚合酶標記法。加入dNTP后抑制外切活性可將標記的dNTP進行填充標記。(3) T4多核苷酸激酶標記法。用該酶可將-32P從-32P ATP轉移至核酸的5-OH端(4) 末端脫氧核苷酸轉移酶

6、標記法。將多種標記的dNTP逐個轉移到核酸缺口中的3-OH端，形成長尾標記。核酸雜交醫(yī)學知識11(2) T4DNA聚合酶標記法。加入dNTP后抑制 放射自顯影檢測雜交信號利用放射線在X線片的成影作用來檢測雜交信號，稱為放射自顯影。這種方法的操作步驟如下：(1)將濾膜用保鮮膜包好，置于暗盒中。(2)在暗室中，將磷鎢酸鈣增感屏前屏置濾膜上，光面向上，壓12張X線片，而后再壓上增感屏后屏，光面向X線片，蓋上暗盒，置于-70，曝光適當?shù)臅r間。(3)根據(jù)放射線的強度曝光一定的時間后，在暗室里取出X線片，顯影定影。如曝光不足，可再壓片重新曝光。核酸雜交醫(yī)學知識12 放射自顯影檢測雜交信號核酸雜交醫(yī)學知識1

7、2第三節(jié) 核酸分子雜交技術 在液體中進行雜交反應稱為液相雜交；在固相支持物上進行雜交則稱為固相雜交。 固相雜交包括膜上印跡雜交和細胞原位雜交兩類。固相雜交是印跡技術及雜交信號檢測技術等相結合，從而獲得清晰的雜交圖譜，有利于定性或定量分析待測核酸樣品中的特定片段(靶序列)，在核酸的結構和功能研究以及基因工程研究中，其應用比液相雜交更為廣泛，其技術發(fā)展也更為迅速。一、膜上印跡雜交 膜上印跡雜交是指將待測核酸序列結合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法。 核酸雜交醫(yī)學知識13第三節(jié) 核酸分子雜交技術核酸雜交醫(yī)學知識13 濾膜雜交的基本過程如

8、圖7-8所示。(1) 核酸的制備 (2) 電泳 (3) 印跡 (4) 預雜交(5) 雜交 (6) 洗膜 (7) 檢測 核酸雜交醫(yī)學知識14 濾膜雜交的基本過程如圖7-8所示。核酸雜交醫(yī)學知識14 固相支持物的選擇一種良好的固相支持物應具備以下幾個特點：(1) 具有較強的結合核酸分子的能力(2)與核酸分子結合后應不影響其與探針分子的雜交反應。(3) 與核酸分子的結合穩(wěn)定牢固，(4) 非特異性吸附少。(5) 具有良好的機械性能。核酸雜交醫(yī)學知識15 固相支持物的選擇核酸雜交醫(yī)學知識15下面介紹幾種常用的固相支持物：(1)硝酸纖維素膜：特別適用于蛋白質(如抗體和酶等)的非放射性標記探針的雜交體系。(

9、2)尼龍膜(nylon membrane)：尼龍膜結合單鏈及雙鏈DNA和RNA的能力較硝酸纖維素膜更強，耐堿處理適合于一步法的菌落原位印跡法。尼龍膜的缺點是不宜使用非同位素探針，即使用各種蛋白(如BSA、牛奶等)進行預雜交，產(chǎn)生的雜交信號本底較高，與非特異吸附有關。PVDF膜：比尼龍膜結合力更強，且在預雜交中很容易被封閉，使用同位素和非同位素探針都可產(chǎn)生較淺的本底，而且結實耐用，可以多次雜交。 核酸雜交醫(yī)學知識16下面介紹幾種常用的固相支持物：核酸雜交醫(yī)學知識16 印跡方法虹吸印跡法(圖7-9) 利用毛細管的虹吸作用由轉移緩沖液帶動核酸分子轉移至濾膜上。真空轉移法(圖7-10) 其原理是利用真

10、空泵將轉移緩沖液從上層容器中通過凝膠抽到下層真空室中，同時帶動核酸分子轉移到凝膠下面的濾膜上。該法的最大優(yōu)點是快速，轉膜的同時進行DNA的變性和中和，整個過程只需1h左右。 核酸雜交醫(yī)學知識17 印跡方法核酸雜交醫(yī)學知識17核酸雜交醫(yī)學知識18核酸雜交醫(yī)學知識18電轉法如圖7-11所示。 核酸雜交醫(yī)學知識19電轉法如圖7-11所示。 核酸雜交醫(yī)學知識19 印跡類型Southern印跡雜交法(Southern blot hybridization)(圖7-12)。 核酸雜交醫(yī)學知識20 印跡類型核酸雜交醫(yī)學知識202. Northern印跡雜交(Northern blot hybridizati

11、on)： Northern雜交是將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉移到硝酸纖維素膜等固相載體上，用標記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進行雜交。其基本原理與Southern雜交相同，只不過變性方法不能采用堿變性法，因為堿導致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等變性方法。 核酸雜交醫(yī)學知識212. Northern印跡雜交(Northern blot 3.斑點雜交(dot hybridization)：直接將變性DNA樣品點于硝酸纖維素膜上，固定好后先預雜交，再與標記探針雜交，然后通過高嚴謹性沖洗(低鹽高溫)，降低本底和提高特異性。預雜交和雜

12、交可在密封袋中進行，密封袋比較方便，反應體積小，可以使用高濃度探針，封口前去除氣泡，使雜交液與膜充分接觸，反應體積以膜不貼壁、能浮動為宜。探針與同源樣品雜交后，陽性結果產(chǎn)生斑點，故稱斑點雜交。 核酸雜交醫(yī)學知識223.斑點雜交(dot hybridization)：直接將變4.反向斑點雜交(reverse dot hybridization)：直接將不 同的探針點印并固定在膜上，再將待測的DNA樣品與之雜交，這樣一次雜交反應就可以判斷待測DNA是否含有這些探針的同源序列。5.菌落或噬菌斑雜交(圖7-13)。 核酸雜交醫(yī)學知識234.反向斑點雜交(reverse dot hybridiza 二、核酸原位雜交 用標記的已知核酸序列為探針，使