1、基于UPLC-ESI-TOF-MS技術(shù)的姬松茸和雙孢蘑菇酚化合物定性分析及體外抗氧化活性研究多酚廣泛存在于植物中，根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可以分為酚酸類、黃酮類、芪類和木酚素等1，對(duì)人體有抗氧化、抗炎癥、預(yù)防肥胖、糖尿病等功效2。食用菌中富含多酚，且多以酚酸化合物存在，包括苯甲酸類和黃烷-3-醇類等。姬松茸(Agaricusbrasiliensis)又名巴西蘑菇，是蘑菇屬的一種名貴食藥用真菌，其菌肉有杏仁味，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多糖、甾醇和維生素等營(yíng)養(yǎng)活性成分，具有較高的抗癌活性和增強(qiáng)免疫的功能3。雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)栽培范圍廣、產(chǎn)量大，肉質(zhì)肥美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含多酚、多糖、氨基酸、礦

2、物質(zhì)等成分，抗過(guò)敏、抗腫瘤和抗氧化等作用顯著4。姬松茸和雙孢蘑菇栽培方式相似，作為2種重要的食用菌，關(guān)于其多酚組成已有一些文獻(xiàn)報(bào)道。如CARVAJAL等5從姬松茸子實(shí)體和菌絲體中均分離出沒食子酸、丁香酸和焦性沒食子酸。但現(xiàn)有的文獻(xiàn)均是采用高效液相色譜法對(duì)其組成進(jìn)行鑒定，僅可測(cè)得所選的酚化合物標(biāo)準(zhǔn)品是否存在于待測(cè)樣品中，而無(wú)法全面測(cè)得樣品中的酚化合物組成。本文擬采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-electrospray time- of- flight- mass spectrometry，UPLC-ESI-T

3、OF-MS)對(duì)實(shí)驗(yàn)室栽培獲得的姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體中的酚化合物組成進(jìn)行初步分離鑒定，并對(duì)其多酚提取液的DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力和還原力進(jìn)行測(cè)定，綜合評(píng)價(jià)2種食用菌子實(shí)體多酚提取液的體外抗氧化活性。1 材料與方法1.1 材料與試劑姬松茸與雙孢蘑菇子實(shí)體由本實(shí)驗(yàn)室采用常規(guī)方法栽培獲得。采摘子實(shí)體后，除去菇腳的泥土等雜質(zhì)后冷凍干燥，粉碎過(guò)80目篩，密封置于冰箱中保存。沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；福林酚、DPPH、啡咯嗪，北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜純)，天津市康科德科技有限公司；Na2CO3、乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl2等均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 儀器與設(shè)備UV

4、752紫外可見分光光度計(jì)，上海赫爾普國(guó)際貿(mào)易有限公司；UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)、AcquityTMultra型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Triple TOF 5600+型飛行時(shí)間質(zhì)譜(配有電噴霧離子源)，美國(guó)AB SCIEX公司；ZORBAX-SB C18(100 mm4.6 mm i.d.，1.8 m)色譜柱,美國(guó)安捷倫公司。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 多酚的提取按照CHETHAN等6的方法略作改動(dòng)。分別準(zhǔn)確稱取2.00 g子實(shí)體粉末，用石油醚(3060 )脫脂，轉(zhuǎn)移至50 mL的錐形瓶中，分別加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，離心取上清液，將濾渣采用相同

5、方式進(jìn)行復(fù)提，合并2次上清液。將上清液冷凍干燥，用甲醇定容至一定體積，保存至冰箱中待測(cè)。1.3.2 多酚組成的鑒定液相條件：流動(dòng)相由0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈組成，流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量5 L；柱溫箱30 ；梯度洗脫程序?yàn)椋?2 min，5%B；225 min， 5%35% B；2535 min，35%95% B；3537 min，95% B；3740 min，95%5% B；柱溫30 ；進(jìn)樣量5 L；流速0.8 mL/min。質(zhì)譜條件：UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀，由于蘑菇中的酚化合物多為酚酸7，解離為陰離子，因此采用負(fù)

6、離子掃描模式；掃描范圍：1001 500m/z；霧化氣(GS1)：50 psi；霧化氣(GS2)：50 psi；氣簾氣(CUR)：35 psi；離子源溫度(TEM)：550 (負(fù))；離子源電壓(IS)：-4 500 V；一級(jí)掃描：去簇電壓(DP)：100 V，聚焦電壓(CE)：10 V；二級(jí)掃描：使用TOF MSProduct IonIDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為-20、-40、-60 V，進(jìn)樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差210-68-9。1.3.3 多酚提取液體外抗氧化活性的測(cè)定姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液中多酚含量的測(cè)定：采用福林酚比色法10。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線

7、的繪制：Y=7.167 1X-0.003 5(R2=0.999 8，X為沒食子酸的濃度，Y為對(duì)應(yīng)濃度下的OD值)。樣品中的多酚含量用每克樣品(干重)中的沒食子酸當(dāng)量來(lái)表示，單位為mg GAE/g DW。姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液DPPH自由基清除能力的測(cè)定11：在2 mL不同濃度的樣液中加入2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)，搖勻，靜置30 min，對(duì)照用甲醇代替樣品，空白管為樣品加70%的乙醇(即DPPH的溶劑)。517 nm處測(cè)OD值。按公式(1)計(jì)算DPPH自由基清除能力：DPPH自由基清除能力(1)式中：A0，對(duì)照吸光度值；A1，樣品吸光度值；A2，空白吸光度值。姬松茸和雙

8、孢蘑菇多酚提取液還原力的測(cè)定12：當(dāng)溶液中存在還原劑時(shí)，F(xiàn)e3+和鐵氰化物復(fù)合物會(huì)接受還原劑給出的電子轉(zhuǎn)化為Fe2+形式的化合物，進(jìn)而兩者反應(yīng)生成普魯士藍(lán)(Fe4Fe(CN)63)，其在700 nm處有最強(qiáng)吸收峰，溶液顏色由原來(lái)的黃色變成不同程度的綠色-藍(lán)色，故測(cè)定700 nm處的OD值即可測(cè)定Fe2+濃度。OD值越大，表示還原力越強(qiáng)。測(cè)定方法為：在1 mL不同濃度的樣液中分別依次加入2.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液，50 保溫20 min，然后迅速冷卻，加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液，離心，取上清液。1.25 m

9、L上清液中依次加入1.25 mL蒸餾水和0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min，700 nm處測(cè)OD值。姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液Fe2+螯合能力的測(cè)定13：在1.6 mL不同濃度的樣液中分別依次加入1.6 mL蒸餾水、0.4 mL 0.5 mmol/L FeCl2、0.4 mL 0.5 mmol/L Ferrozine，然后劇烈搖動(dòng)1 min，室溫放置20 min后，562 nm處測(cè)OD值?？瞻坠?A0)用蒸餾水代替樣液。按公式(2)計(jì)算Fe2+螯合能力：Fe2+螯合能力(2)式中：A1，樣品吸光度值，A0，空白吸光度值。1.4 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，數(shù)

10、據(jù)采用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)均數(shù)間的兩兩比較用Duncan多重比較法進(jìn)行。2 結(jié)果與分析2.1 姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體中多酚組成的鑒定姬松茸子實(shí)體甲醇提取液經(jīng)過(guò)UPLC-ESI-TOF-MS分析后，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步鑒定出以下10種酚類物質(zhì)，其一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)圖和相關(guān)信息如電子版本中的附圖1和表1所示?；衔顰：M-H-為237.089 0，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H14N2O4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z219M-18-H和m/z193M-44-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推

11、測(cè)該化合物為甘氨酰-L-酪氨酸。表1 姬松茸和雙孢蘑菇酚化合物的信息表Table 1 Information of phenolic compounds fromA.brasiliensisandA.bisporus化合物B：M-H-為264.099 8，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C12H15N3O4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z246M-18-H，m/z220M-44-H和m/z203M-44-17-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為-N-(-谷氨酰)-4-甲酰基苯肼。化合物C：M-H-為294.110 3，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬

12、合的分子式為C13H17N3O5，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z276M-18-H，m/z250M-44-H和m/z233M-44-17-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為甲基戊酸?；衔顳：M-H-為219.078 4，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H12N2O3，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z201M-18-H和m/z219M-28-H等碎片離子，結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為5-羥基色氨酸?；衔顴：M-H-為194.047 2，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C9H9NO4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m

13、/z152M-42-H和m/z108M-42-44-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和羰基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為2-乙酰氨基-3-羥基苯甲酸。化合物F：M-H-為121.031 8，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C7H6O2，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜M-29-H等碎片離子，以及Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為4-羥基苯甲醛?；衔颎：M-H-為293.079 0，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C13H14N2O6，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z249M-44-H和m/z204M-45-44-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder

14、和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為acromelic acid E?；衔颒：M-H-為241.120 5，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H18N2O4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z197M-44-H和m/z168M-44-29-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和羰基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及大量文獻(xiàn)，推測(cè)該化合物為L(zhǎng)-焦谷氨酰-L-亮氨酸?；衔颕：M-H-為249.089 1，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C12H14N2O4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z204M-45-H和m/z168M-58-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在酰胺，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)

15、檢索，推測(cè)該化合物為鄰-丁二酰胺基-苯甲酸甲酯?；衔颙：M-H-為275.104 7，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C14H16N2O4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z231M-44-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為L(zhǎng)-焦谷氨酰-L-苯丙氨酸。雙孢蘑菇子實(shí)體甲醇提取液經(jīng)過(guò)UPLC-ESI-TOF-MS分析后，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步鑒定出12種酚類物質(zhì)，其中有6種與從姬松茸中分離鑒定的酚化合物一樣，分別為：甘氨酰-L-酪氨酸、-N-(-谷氨酰)-4-甲酰基苯肼、甲基戊酸、4-羥基苯甲醛、L-焦谷氨

16、酰-L-亮氨酸和L-焦谷氨酰-L-苯丙氨酸。其余6種酚化合物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)圖和相關(guān)信息如附圖2和表1所示?；衔颽：M-H-為257.078 4，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C10H14N2O6，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z239M-18-H，m/z213M-44-H和m/z169M-44-17-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為5-羥脯氨酰-L-谷氨酸?；衔颾：M-H-為153.020 2，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C7H6O4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z109M-44-H和m/z91M-44-18-H等碎片離子，該化合物結(jié)構(gòu)

17、中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為3,4-二羥基苯甲酸?；衔颿：M-H-為291.099 1，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C14H16N2O5，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z247M-44-H和m/z230M-17-44-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為(2R,4R)-2-(1H-吲哚-3-基)甲基-4-氨基-2-羥基戊烷-1,5-二酸。化合物d：M-H-為222.077 9，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H13NO4，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜M-30-H和M-30-15-H等碎片離子，結(jié)合Sci

18、finder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為環(huán)磷酰胺?；衔飁：M-H-為249.099 5，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H14N4O3，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z205M-44-H和m/z163M-42-44-H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為阿樸鳥嘌呤A?；衔飂：M-H-為207.078 3，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C10H12N2O3，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜m/z163M-44-H，m/z121M-44-42-H和m/z121M-44-42-17H等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reax

19、y數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為犬尿氨酸。2.2 姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體多酚提取液的體外抗氧化活性首先測(cè)定了姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體中的多酚含量(圖1-a)，結(jié)果顯示姬松茸中的多酚含量顯著高于雙孢蘑菇(P0.05)，分別為22.21和19.58 mg GAE/g。之后對(duì)2種子實(shí)體多酚提取液的體外抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、還原力和Fe2+螯合能力)進(jìn)行了測(cè)定。a-多酚含量；b-DPPH自由基清除能力；c-還原力；d-Fe2+螯合能力圖1 姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液的多酚含量和體外抗氧化活性Fig.1 Polyphenols contents and antioxidant propertie

20、sinvitroof extracts fromA.brasiliensisandA.bisporus從圖1可知，姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液的DPPH自由基清除能力、還原力和Fe2+螯合能力均隨著提取液濃度的提高而逐漸提高。姬松茸和雙孢蘑菇在提取液質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除能力達(dá)到最強(qiáng)，分別為81.09%和72.98%。2種蘑菇子實(shí)體提取液質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時(shí)，其還原力最強(qiáng)，在此濃度下對(duì)Fe2+螯合能力也達(dá)到最強(qiáng)，分別為93.02%和88.99%。為了更好地反映2種子實(shí)體的體外抗氧化活性，對(duì)各抗氧化指標(biāo)的EC50值進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如表2所示。雙孢蘑菇提取液各

21、抗氧化指標(biāo)的EC50值均顯著高于姬松茸，這說(shuō)明姬松茸子實(shí)體提取液的體外抗氧化活性顯著強(qiáng)于雙孢蘑菇(P0.05)。表2 姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液抗氧化活性的EC50值Table 2 EC50values in antioxidant activities ofA.brasiliensisandA.bisporus3 結(jié)論與討論本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-ESI-TOF-MS對(duì)姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體中的酚化合物組成進(jìn)行了初步分離鑒定，分離到了16種酚化合物，分別為：甘氨酰-L-酪氨酸、-N-(-谷氨酰)-4-甲?；诫?、甲基戊酸、5-羥基色氨酸、2-乙酰氨基-3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲醛、acrome

22、lic acid E、L-焦谷氨酰-L-亮氨酸、鄰-丁二酰胺基-苯甲酸甲酯、L-焦谷氨酰-L-苯丙氨酸、5-羥脯氨酰-L-谷氨酸、3,4-二羥基苯甲酸、(2R,4R)-2-(1H-吲哚-3-基)甲基-4-氨基-2-羥基戊烷-1,5-二酸、環(huán)磷酰胺、阿樸鳥嘌呤A和犬尿氨酸。在這16種酚化合物中，有6種是同時(shí)存在于2種食用菌中的。2種蘑菇子實(shí)體的多酚含量分別為22.21和19.58 mg GAE/g。并對(duì)姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體多酚提取液體外抗氧化性進(jìn)行了測(cè)定，得出姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體提取液的DPPH自由基清除能力、還原力和Fe2+螯合能力均隨著提取液濃度的提高而逐漸提高。且在提取液質(zhì)量濃度為4.

23、0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除能力達(dá)到最強(qiáng)，分別為81.09%和72.98%；在提取液質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時(shí)，其還原力最強(qiáng)，在此濃度下對(duì)Fe2+螯合能力也達(dá)到最強(qiáng)，分別為93.02%和88.99%。且通過(guò)計(jì)算EC50值得出，姬松茸子實(shí)體提取液的體外抗氧化活性顯著強(qiáng)于雙孢蘑菇。以上結(jié)果說(shuō)明姬松茸和雙孢蘑菇具有被開發(fā)為功能食品或添加劑的潛力。傘菌氨酸(-N-(-谷氨酰)-4-羥甲基苯肼)具有明確的抗腫瘤、治療糖尿病、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡等活性作用14-16，近年來(lái)引起了普遍的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)從姬松茸和雙孢蘑菇子實(shí)體中分離到-N-(-谷氨酰)-4-甲?；诫率呛铣蓚憔彼岬闹虚g體17。CHULIA等18曾報(bào)道從四孢蘑菇(Agaricuscampestris)的子實(shí)體中分離到-N-(-谷氨酰)-4-甲?；诫?，還未發(fā)現(xiàn)從姬松茸和雙孢蘑菇中分離到-N-(-谷氨酰)-4-甲?；诫碌膱?bào)導(dǎo)。CARVAJAL等5報(bào)道在姬松茸子實(shí)體和菌絲體中均分離