1、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下:1漂洗血清蛋白2度4P小2寸2度甲醇固定20分鐘后自然、干燥10分鐘洗凈3mir31rir25mir酉3成50lrir5mlp洗凈汰5mir羊血清封閉：37度，20分鐘抗，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度12小時(shí)4度洗凈，3mir*5次9二抗37度小于一小時(shí)037度洗凈，3*5mir涼干封片（封閉液PH85）活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備（一）制備活性高的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法）!用10%調(diào)整細(xì)胞濃度為5X1061X107/ml!取40pl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性55pl的小

2、玻璃管或塑料離心管，再加50pl1:20（用稀釋?zhuān)缁钫Ｍ醚澹?C30mir用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpmX5mir!棄上清，加入50p工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標(biāo)記物，充分振搖4C30min用洗滌液洗滌次，每次加液m左右1000rpmX5min!加適量固定液（如為制備標(biāo)本，一般加入1m固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100500固定液!檢測(cè)或制片后熒光顯微鏡下觀察（標(biāo)本在試管中可保存5天（二）試劑和器材各種特異性單克隆抗體。熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。10%SP140,洗滌液、固定液（見(jiàn)附錄。玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒

3、光顯微鏡等。（三）注意事項(xiàng)整個(gè)操作在4C下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的3,上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白受體，降低和防止非特異性染色。細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:DPBS(X10,貯存液蒸餾水加至1000P411臨用時(shí)用蒸餾水1：10稀釋HP4洗滌液DPBS900mlS0終濃度4%30終濃度0%固定液DPBS1000ml葡萄糖20g終（濃度2%）甲醛10ml0終濃度00%4.玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。（三）注意事項(xiàng)1

4、整個(gè)操作在4T下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的3，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白受體，降低和防止非特異性染色。4.細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1PBS（X10,貯存液NaCl80g蒸餾水加至1000apo11臨用時(shí)用蒸餾水1：10稀釋KH2PO4洗滌液PBSS終濃度%4%Na3N終濃度%固定液DPBS1葡萄糖終濃度%甲醛1Na3N終濃度%嚴(yán)重同意樓上的講解。我是做流式細(xì)胞分析的間接熒光，圖簡(jiǎn)單加一抗后只洗滌一次，二抗后沒(méi)有洗滌，就

5、直接加另外一個(gè)抗體，結(jié)果做了好多次就是呈陰性反應(yīng)！排除了好久才多洗滌了兩次，結(jié)果很是令人滿(mǎn)意。我想請(qǐng)問(wèn)樓上：3哪里有賣(mài)？謝謝！我找過(guò)，發(fā)現(xiàn)它是一種化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品，成桶成桶的賣(mài)，而且有劇毒??！是不是不是同一種東東？我做的是的1免疫熒光，步驟如下：I、細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95100時(shí)，從孵箱中取出2用預(yù)溫的1XPBS洗次，每次1分鐘3、4的甲醛室溫固定2030分鐘1XPBS洗次，每次1分鐘%1透化一分鐘1XPBS洗次，每次1分鐘BS1A溫封閉分鐘8加一抗（用1%BS稀釋?zhuān)┓旁跐窈欣铮冗^(guò)夜1XPBS洗次，每次1分鐘1o加二抗（用1%BS稀釋?zhuān)┓昼姡]光！II、1XPBS洗次，每次1分鐘12、9%5

6、甘油封片注：甲醛，BS均用1XPBS稀釋從大鼠分離的細(xì)胞能否直接做細(xì)胞免疫熒光我做的大部分細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：取出細(xì)胞爬片放到或用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來(lái)回夾取，另外洗的時(shí)候加不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等分鐘或分鐘。%冷的多聚甲醛固定分鐘，洗三遍。0通透分鐘，洗三遍。與二抗相同宿主的血清封閉分鐘，洗三遍。一抗度濕盒內(nèi)過(guò)夜，也可度小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，洗三遍。二抗室溫小時(shí)（避光），或者度半小時(shí)，洗三遍。最好用染核，然后直接照熒光片。蒸餾水洗掉，

7、甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干，所以不用指甲油封的話(huà)會(huì)弄的一塌糊涂。建議：1二還是染完之后沒(méi)有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，再想照反而沒(méi)有了，另外不要拖太長(zhǎng)時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。2二熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話(huà)，過(guò)一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。3二二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。我要做的是，可是效果不是很好，可以用甲醇固定嗎，和甲醛比那個(gè)合適各位同仁:我現(xiàn)在急于做人乳腺癌細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，目的是測(cè)凋亡時(shí)，基因的-蛋2白表達(dá)變化。不知道怎么選一抗和二抗試劑盒。請(qǐng)高手指教。萬(wàn)分感謝！能發(fā)一個(gè)郵件更好，再一次感謝！我的：抗淬滅劑可拿來(lái)直接封片,2微0升即可.之后片子可保留更長(zhǎng)時(shí)間不是原創(chuàng)我是做懸浮細(xì)胞的，是人單核細(xì)胞系，主要問(wèn)題是懸浮細(xì)胞在洗滌以及孵育次數(shù)多了會(huì)越洗越少，請(qǐng)問(wèn)各位怎么洗法細(xì)胞不會(huì)變少。（離心轉(zhuǎn)速比較重要，還有有人說(shuō)離心后上清不用移液器吸，直接倒比較好，我也試過(guò)，可還是越來(lái)越少）頂一下我也遇到了同樣的問(wèn)題，不知