1、實驗二PCR檢測乙肝病毒&PCR-SSCP檢測人HLA-DRB基因多態(tài)性乙肝病毒PCR實驗操作HLA基因PCR實驗操作血清樣本處理（模板的制備）PCR檢測乙肝病毒實驗PCR反應上機口腔細胞DNA電泳（模板的檢測）HLA基因PCR實驗操作PCR反應上機 瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、凝固后拔梳） 倒緩沖液 （樣品中加入1/5體積的上樣buffer）加樣，電泳（方向、電壓、時間） 染色與檢測 （EB浸泡10 min，紫外下檢測）電泳實驗的步驟及注意事項電泳基本原理及相關知識 DNA瓊脂糖凝膠電泳 電泳的概念 帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電

2、極方向定向泳動的現(xiàn)象。 廣泛應用于生物大分子的分離和鑒定 實驗室中常用到的電泳方法 （以介質(zhì)分類） 紙電泳 醋酸纖維膜電泳 凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳的基本原理利用物質(zhì)的差異特性來分離物質(zhì)電荷差異 電荷性質(zhì) 電荷數(shù)量分子差異 分子大小 分子形狀 電泳的影響因素 帶電粒子的性質(zhì) 電場強度 溶液的pH 溶液的離子強度 電滲現(xiàn)象 環(huán)境因素 在pH8.0（堿性）的環(huán)境中DNA的磷酸基團解離，使DNA在該環(huán)境中帶上負電荷，在電場中向正極方向泳動因為各種DNA分子的電荷數(shù)、構(gòu)象、分子量不同，它們在通過凝膠立體網(wǎng)絡是所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，達到分離的目的DNA顯色

3、劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長為254nm365nm的紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光DNA瓊脂糖基本原理/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html實驗結(jié)果的分析PCR基本原理及相關知識 The Polymerase Chain Reaction Sometimes called molecular photocopying, the polymerase chain reaction (PCR) is a fast and inexpensive technique used to amplify, or make many co

4、pies of, small segments of DNA. the technology empowers scientists to undergo a number of processes, from DNA fingerprinting to mapping the human genome. In 1983, Kary Mullis invented the PCR. The process is an invaluable tool to todays molecular biologists and biotechnology corporations.Kary B. Mul

5、lis As he wrote later in Scientific American:Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents and a source of heat. (1944 - )T

6、he Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method（1/2 of the prize ）3 step and 30 cycles for PCRStep 1. DenaturationStep 2. AnnealStep 3. Extend30 cyclescreate over a billion copies of the sequenceStep 1. DenaturationThe reaction is first heated to dena

7、ture (separate) the sides of the double- stranded DNA Temperature: 95 degrees Celsius Step 2. Annealthen cooled to allow the primers to find and bind to their complementary sequences on the separated strands.Temperature: 55 degrees Celsius Step 3. Extendthe polymerase to extend the primers into new

8、complementary strands.Temperature: 75 degrees Celsius Repeat the CyclesRepeated heating and cooling cycles multiply the target DNA exponentially, since each new double strand separates to become two templates for further synthesis. This process can then be repeated up to 30 times to create over a bi

9、llion copies of the sequence. What is in the PCR Mix?Template (dsDNA)Primers (TWO short DNA: 15-30 nucleotides in length. Longer primers provide higher specificity ) P22Taq polymerase （ Thermus aquaticus ）dNTP Mix (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)Reaction Buffer (including Mg2+)10PCR反應buffer： 已作成商品化的產(chǎn)品，它包括：

10、250500mmol/L KCl； 100500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；1520mmol/L MgCl2（對Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.52.0mmol/L，實際應用時根據(jù)反應體系的情況進行調(diào)整）； 0.1%明膠或牛血清白蛋白 影響PCR的主要因素 PCR反應體系的各個組分 PCR循環(huán)的溫度（預變性、變性、退火、延伸） PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺效應 操作環(huán)境 一般PCR實驗設計：樣品反應不同的退火溫度梯度不同的Mg 2濃度不同的模板濃度陰性對照反應陽性對照反應 相對DNA克隆而言，這種方法的特點：操作簡便、時間短、特異性高、靈敏度高、實用性強； 廣泛的應用于醫(yī)學診斷

11、、分子生物學、分子克隆、基因診斷、法醫(yī)學、考古學等各個領域。二、 PCR試劑盒檢測HBV DNA 實驗操作及注意事項 HBV檢測試劑盒介紹構(gòu)成：DNA提取液檢測反應管（PCR反應體系，上樣buffer，石蠟油）陽性模板設計：反應管中有針對HBV的特異性引物，若出現(xiàn)與陽性對照相同的結(jié)果，則說明待測樣品中含有HBVPCR實驗具體操作 1、待測樣本的制備：提取血清中DNA待測血清40l + 40l DNA 提取液，混勻 沸水浴10min，10000rpm5min上清樣品模板TE 40l + 40l DNA 提取液，混勻沸水浴10min，10000rpm5min上清空白模板待測樣品的制備空白對照的制備實驗分組（每2人做一管PCR反應）分10個平行的實驗小組，每組包括：陽性反應1個空白對照1個樣品檢測反應n個陽性模板2l空白模板2l樣品模板2l混勻， 6000rpm5s，上PCR儀933min 預變性94，30s55，30s72，30s72保溫5min30個循環(huán)PCR反應程序：三、PCR-SSCP檢測人HLA-DRB 基因多態(tài)性PCR實驗操作及注意事項 實驗目的及預期結(jié)果目的：檢測來自不同樣本的基因多樣性檢測技術：HLA-DR基因的PCR-SSCP預期結(jié)果：PAGE電泳條帶的差異基本過程來源不同的待測樣本PCR擴增目的基因變性成單鏈PAGE電泳結(jié)果比較（銀染）實驗主要步驟HLA基