1、食用菌的基因工程優(yōu)選食用菌的基因工程2（1）目的基因；（2）表達元件及表達載體（即將目的基因與質(zhì)粒或病毒DNA連接成重組 DNA）；（3）轉化方法（把重組DNA引入某種細胞）；（4）重組體的篩選（把目的基因能表達的受體細胞挑選出來）。 基因工程的主要要素食用菌外源基因表達系統(tǒng)一、宿主的選擇現(xiàn)有外源基因表達系統(tǒng)的缺陷大腸桿菌表達系統(tǒng)蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工體系不完善，表達蛋白活性 低或沒有活性低；細胞產(chǎn)生內(nèi)毒素，影響表達蛋白的純化；細胞質(zhì)內(nèi)表達的目標蛋白形成包涵體顆粒，包涵體要用變性劑溶解，再通過復性才能得到在緩沖液中溶解的蛋白酵母表達系統(tǒng)表達產(chǎn)物過渡糖基化：酵母細胞合成糖鏈多為甘露糖殘基，常形成過

2、長的側鏈，如cel基因的表達；表達產(chǎn)物缺乏糖基化：如人尿激酶基因（uPA）有一O-糖基化位點，酵母缺乏在該位點的糖基化；表達真核生物基因的產(chǎn)物與天然產(chǎn)物在結構上有些 差異成本高、工藝復雜；我國20多產(chǎn)家還處于轉瓶生產(chǎn)（EPO和乙肝疫苗），年產(chǎn)量不足100g/year；細胞凋亡難以克服（CHO細胞）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)絲狀真菌表達系統(tǒng)食用菌作為外源基因表達系統(tǒng)的特點食用菌美味可食，營養(yǎng)豐富，是健康食品和保健食品；培養(yǎng)工藝簡單、培養(yǎng)基質(zhì)來源豐富。不僅可以利用發(fā)酵罐大規(guī)模深層發(fā)酵培養(yǎng)，還可以利用農(nóng)業(yè)下腳料進行工廠化種植；食用菌作為外源基因表達系統(tǒng)的特點食用菌是高等真核生物，表達真核生物的基 因活性高

3、；食用菌有良好的蛋白分泌能力，有利于目的 蛋白的分離和純化；遺傳轉化系統(tǒng)容易建立食用菌作為外源基因表達系統(tǒng)的特點銀耳是一食藥兼用菌有性繁殖無性繁殖銀耳芽孢作為生物反應器具備獨特優(yōu)點銀耳芽孢單核，具有獨特的繁殖特性出芽繁殖，和酵母一樣，生長速度快，容易培養(yǎng)銀耳芽孢作為生物反應器具備獨特優(yōu)點銀耳芽孢是高等真核生物，翻譯后的蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)完善，表達高價值的真核生物基因的活性高銀耳芽孢已有完善的高密度深層發(fā)酵培養(yǎng)體系銀耳芽孢營養(yǎng)豐富，可食安全二、載體構建(一）質(zhì)粒載體的組成 克隆載體：含抗性基因、自主復制序列（ori）常用克隆質(zhì)粒載體（1）pUC系列（含ampr、 lacZ、Mutiple cloni

4、ng site）（2）pBR322 (含ampr、tetr、 Mutiple cloning site)（3）Bluescript M13系列（含ampr、 lacZ、Mutiple cloning site）（4） 噬菌體載體gpd promotor表達載體:組成：啟動子，終止子，目的基因，抗性篩選標記基因。Eco RI 5 -G A A T T C- 3 3 -C T T A A G- 5Pst I5- C T G C A G -33- G A C G T C-5Hae III5-G G C C -33-C C G G -5食用菌常用啟動子：1）ras （Le.ras.gene）啟動子；2

5、）gpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)啟動子；3）spr1(serine proteinase gene )啟動子；4）trp1（tryptophan synthetase gene）啟動子；5）其他：cel1(cellulose-growth-specific gene )啟動子、cel3 啟動子、cel4啟動子、pri(primase gene )啟動子、gla1(glu-coamylase gene )啟動子等。篩選標記 （1）營養(yǎng)缺陷型標記 ：營養(yǎng)缺陷互補標記基因有:A) ural（二氫乳清酸）基因，楊樹菇轉化;B) pabl(p

6、-氨基苯甲酸)基因，鬼傘 、蘑菇遺傳轉化；C）trp2(色氨酸)基因，鬼傘 、蘑菇遺傳轉化;D）銀耳肌醇營養(yǎng)缺陷型菌株。（2）抗生素抗性篩選標記 ： 抗生素抗性篩選標記已在植物、真菌遺傳轉化子的篩選上廣泛使用。主要有：卡那霉素抗性基因（kan+）;氨芐青霉素抗性基因（Amp+)潮霉素抗性基因（Hyg+）;腐草霉素抗性基因（Phl+）;博來霉素抗性基因（Ble+）。 在培養(yǎng)基中添加抗生素進行篩選。（3）除草劑和殺菌劑抗性篩選標記 ： A) 如Bialaphos 抗性基因; B)殺菌劑Carboxin抗性基因（CbxR）;（4）代謝產(chǎn)物抗性篩選標記 如從鬼傘中分離得到的trp3iar基因。該基因是

7、抗氟基吲哚（5-fluoroindole,5-FL）代謝的，草菇和平菇對潮霉素不敏感，而對5-FL十分敏感，當把trp3iar 轉入草菇和平菇時，這兩種食用菌就能對5-FL產(chǎn)生抗性，達到篩選的目的 。載體構建策略（）選擇合適的表達載體:含啟動子、篩選標記、終 止子（）選擇合適的限制性內(nèi)切酶及其酶切位點舉例說明食用菌啟動子功能檢測載體構建過程 三、遺傳轉化方法PEG法；電擊法；基因槍法；限制酶介導法；農(nóng)桿菌介導法；PEG(polyethylene glycol )法最早是由Davey等以矮牽牛懸浮細胞的原生質(zhì)體為受體、Krens等以煙草無菌苗分離的原生質(zhì)體為受體，在PEG的協(xié)助下開創(chuàng)性地把裸露的

8、DNA直接轉化植物原生質(zhì)體而創(chuàng)立的，他們的研究結果為基因直接轉移到受體細胞奠定了基礎。主要原理：PEG能使細胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使細胞間的接觸和粘連，或是通過引起表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，而有利于細胞間的融合或外源DNA的進入。 主要應用：酵母、蘑菇、平菇、草菇 、鬼傘等（一）PEG法； 電激法是利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的攝取。該法自1979年Zimmerann發(fā)明以來，經(jīng)過多年的研究和改進，已廣泛應用于動物、植物的遺傳轉化研究上。1991年，Royer JC等首先采用電激法

9、把編碼二氫乳清酸脫氫酶基因URA1導入同源的楊樹菇營養(yǎng)缺陷型突變菌株中，獲得正常表達的楊樹菇 ，接著蘑菇、平菇、草菇等也用該法進行遺傳轉化，獲得轉化子。 （二）電激法基因槍法又稱微彈轟擊法（Microprojectile bombardment）,自Klein TM等1987年首次利用鎢粒對洋蔥的組織進行轟擊試驗以來，已被廣泛應用于植物的遺傳轉化。主要原理：將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高氣壓下微粒被高速射入受體細胞或組織。微粒上的外源DNA也隨之被帶入細胞并整合到植物染色體上，得到表達，從而實現(xiàn)了基因的轉化。應用：絲狀真菌、蘑菇、草菇。 （三）基因槍法 這是九十年代發(fā)展起來的

10、一種能較大幅度提高轉化率的方法，其英文為Restriction Enzyme-Mediated DNA Integration， 簡稱REMI 。它是由Schiestl RH 等于1991年第一次在釀酒酵母菌（S. cerevisiae ）上創(chuàng)立使用29 ，1992年Kuspa A等在網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum ）上發(fā)展了該法 。此法應用于旋孢菌（Cochliobolus heterosporus ） 、白色念球菌（Candida albicans ）和食用菌上的鬼傘（Coprinus cinereus ）、香菇（L.edodes）等的遺傳轉化均能有效地提高轉化率

11、。 （四）限制性酶介導的DNA整合法主要原理：限制酶穿透細胞膜和核膜，在特異的酶切位點活體切斷染色體DNA，產(chǎn)生的染色體DNA末端就會在宿主細胞酶系的作用下與限制酶切斷的線性化的質(zhì)粒DNA相連接。該法亦可作為REMI標簽對功能基因進行分離。 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens ）是一種革蘭氏陰性的土壤桿菌，它侵染雙子葉植物的受傷部位并形成冠癭瘤，在冠癭瘤的形成中，農(nóng)桿菌只留在植物細胞間隙中，其環(huán)狀質(zhì)粒Ti上的T-DNA在細菌內(nèi)被加工、剪切、復制后轉入植物細胞并隨機插入到植物的基因組中。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化系統(tǒng)是一種天然有效的遺傳工程系統(tǒng)，已廣泛應用于雙子葉植物和單子

12、葉植物的遺傳轉化研究上。（五）農(nóng)桿菌介導法 應用：1998年de Groot MJA等首先把農(nóng)桿菌介導法應用于真菌的遺傳轉化，他以真菌的分生孢子和菌絲為受體成功地把T-DNA轉入曲霉（A.awamori）、木霉（Trichoderma harzianum）、鏈孢霉（Neurospora crassa ）、雙孢蘑菇（A.bisporus ）、草菇中。 銀耳芽孢共轉化表達載體實例：銀耳芽孢表達系統(tǒng)銀耳芽孢完整細胞的轉化電擊轉化醋酸鋰介導的轉化PEG介導的轉化轉化子篩選銀耳芽孢Tr01對潮霉素的抗性試驗擬轉化子在含潮霉素的抗性平板上CK轉化子鑒定 潮霉素抗性基因PCR鑒定Southern雜交鑒定（gfp基因） 綠色熒光觀察（Leica SP-2） 黑色背景為蘭光下圖象,白色背景為白光下圖象野生型Tr01 gfp綠色熒光蛋白基因在銀耳芽孢中的高效表達發(fā)出綠色熒光的銀耳芽孢發(fā)出綠色熒光的銀耳芽孢 多功能纖維素酶基因（mfc）在銀耳芽孢中的表達濾紙酶活性24.61U/mL 多功能纖維素酶基因（mfc）在銀耳芽孢中的表達CMC酶活性27.32U/mL不要過分倉促地相信和欽佩德育教員：他們說話像天使，生活卻像凡人。約翰遜知者不惑，仁者不憂，勇者不懼。論語子罕愛生而敗仁者，其下愚之得歟？孤獨并不可怕，每個人都是孤獨的，可怕的是害怕孤獨。少而好學，如日出之陽；壯而好學，如日中之光；志而好學，