1、一、目的：高效液相色譜法檢驗(yàn)操作規(guī)程編寫/修訂人/日期年月曰部門/姓名審核人/日期年月曰部門/姓名批準(zhǔn)人/日期年月曰部門/姓名執(zhí)行日期2020年11月01日頒發(fā)部門品質(zhì)部分發(fā)部門品質(zhì)部制訂詳盡的工作程序，規(guī)范檢驗(yàn)操作，保證檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。二、范圍：本操作規(guī)程適用于高效液相色譜法的檢驗(yàn)操作。三、職責(zé)：1、檢驗(yàn)員：嚴(yán)格按操作規(guī)程操作，認(rèn)真、及時(shí)、準(zhǔn)確地填寫檢驗(yàn)記錄；2、化驗(yàn)室負(fù)責(zé)人：監(jiān)督檢查檢驗(yàn)員執(zhí)行本操作規(guī)程。四、內(nèi)容：簡述：高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進(jìn)入檢測器檢

2、測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。1、對(duì)儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內(nèi)徑一般為2.14.6mm，填充劑粒徑為210um。超高效液相色譜儀是耐超高壓、小進(jìn)樣量、低死體積、高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。色譜柱1.1.1色譜柱的類型1.1.1.1反相色譜柱：以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。1.1.1.2正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑

3、有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。1.1.1.3離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。1.1.1.4手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。1.1.2色譜柱的內(nèi)徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、載體表面基團(tuán)殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的色譜柱。1.1.3溫度會(huì)影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時(shí)系指室溫，應(yīng)注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的溫度。1.1.4殘余硅羥基未封閉的

4、硅膠色譜柱，流動(dòng)相pH值一般應(yīng)在28之間。烷基硅烷帶有立體側(cè)鏈保護(hù)、或殘余硅羥基巳封閉的硅膠、聚合物復(fù)合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛pH值的流動(dòng)相，可用于pH值小于2或大于8的流動(dòng)相。1.2檢測器1.2.1最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。1.2.2紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)，還與其結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器和示差折光檢測器為通用檢測器，對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng)，結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射

5、檢測器和電霧式檢測器的響應(yīng)值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)。1.2.3紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器和示差折光檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關(guān)系，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換；電霧式檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量通常也呈指數(shù)關(guān)系，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或用二次函數(shù)計(jì)算，但在小質(zhì)量范圍內(nèi)可基本呈線性。1.2.4不同的檢測器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外-可見分光光度法（見EKS0P-QC7037紫外分光光度檢驗(yàn)操作規(guī)程）項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長檢測時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)溶劑的截止使用波長。蒸發(fā)光散射檢測器、

6、電霧式檢測器和質(zhì)譜檢測器不得使用含不揮發(fā)性成分的流動(dòng)相。1.3流動(dòng)相1.3.1反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相常用甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長檢測時(shí)，宜選用乙腈-水系統(tǒng)。流動(dòng)相中如需使用緩沖溶液，應(yīng)盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時(shí)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑一般不低于5%，否則易導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。1.3.2正相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相常用兩種或兩種以上的有機(jī)溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。1.3.3流動(dòng)相注入液相色譜儀的方式（又稱洗脫方式）可分為兩種：一種是等度洗脫，另一種是梯度洗脫。用梯度洗脫分離時(shí)，梯度洗脫程序通常以表格的形式在品種項(xiàng)下規(guī)定，其中包括運(yùn)行時(shí)間和流動(dòng)相在不同時(shí)間

7、的成分比例。1.4色譜參數(shù)調(diào)整1.4.1調(diào)整品種正文項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件（參數(shù)），除填充劑種類、流動(dòng)相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器靈敏度等，均可適當(dāng)調(diào)整。1.4.2若需使用小粒徑（約2um）填充劑和小內(nèi)徑（約2.1mm）色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時(shí)間，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配，必要時(shí)，色譜條件（參數(shù)）可適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。色譜參數(shù)允許調(diào)整范圍見表。表色譜參數(shù)允許調(diào)整的范圍參數(shù)變量參數(shù)調(diào)整等度洗脫梯度洗脫固定相不得改變填充劑的理化性質(zhì)，如填充劑材質(zhì)、表面修飾及鍵合相均

8、需保持一致；從全多孔填料到表面多孔填料的改變，在滿足上述條件的前提下是被允許的填充劑粒徑（dp），柱長（L）改變色譜柱填充劑粒徑和柱長后，L/dp值（N值）應(yīng)在原有數(shù)值的-25%+50%范圍內(nèi)流速如果改變色譜柱內(nèi)徑及填充劑粒徑，可按下式計(jì)算流速,F=FX（de2Xdp）/（dc2Xdp）,212112在此基礎(chǔ)上根據(jù)實(shí)際使用時(shí)系統(tǒng)壓力和保留時(shí)間調(diào)整最大可在50%的范圍內(nèi)調(diào)整除按上述公式調(diào)整外，不得擴(kuò)大調(diào)整范圍進(jìn)樣體積調(diào)整以滿足系統(tǒng)適用性要求，如果色譜柱尺寸有改變，按下式計(jì)算進(jìn)樣體積：V=VX（LXdc2）/（LXdc2），并根據(jù)靈敏度的需求進(jìn)行調(diào)整梯度洗脫程序（等度洗脫不適用）inj2inj12

9、211t=tX（F/F）X（LXdc2）/（LXdc2），保持不同規(guī)格色譜柱的洗脫體積倍數(shù)相同，G2G1122211從而保證梯度變化相同，并需要考慮不同儀器系統(tǒng)體積的差異流動(dòng)相比例最小比例的流動(dòng)相組分可在相對(duì)值士30%可適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相組分比例，以保證系統(tǒng)適或者絕對(duì)值2%的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整（兩者之間選擇最大值）；最小比例流動(dòng)相組分的比例需小于（100/n）%,n為流動(dòng)相中組分的個(gè)數(shù)用性符合要求，并且最終流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度不得弱于原梯度的洗脫強(qiáng)度流動(dòng)相緩沖液鹽濃度可在10%范圍內(nèi)調(diào)整柱溫除另有規(guī)定外，可在10C范圍內(nèi)調(diào)整除另有規(guī)定外，可在5%范圍內(nèi)調(diào)整pH值除另有規(guī)定外，流動(dòng)相中水相pH值可在土0.2p

10、H范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整檢測波長不允許改變注：*為原方法中的流速；F2為調(diào)整后方法中的流速；dci為原方法中色譜柱的內(nèi)徑；J：為調(diào)整后方法中色譜柱的內(nèi)徑；dp為原方法中色譜柱的粒徑；dp為調(diào)整后方法中色譜柱的粒徑V為原方法中進(jìn)樣體12inj1積；V為調(diào)整后方法中進(jìn)樣體積；L為原方法中色譜柱柱長；L為調(diào)整后方法中色譜柱柱長；t為原方inj212G1法的梯度段洗脫時(shí)間；t為調(diào)整后的梯度段洗脫時(shí)間。G2可通過相關(guān)軟件計(jì)算表中流速、進(jìn)樣體積和梯度洗脫程序的調(diào)整范圍，并根據(jù)色譜峰分離情況進(jìn)行微調(diào)。調(diào)整后，系統(tǒng)適用性應(yīng)符合要求，且色譜峰出峰順序不變。若減小進(jìn)樣體積，應(yīng)保證檢測限和峰面積的重復(fù)性；若增加進(jìn)樣體積，應(yīng)

11、使分離度和線性關(guān)系仍滿足要求。應(yīng)評(píng)價(jià)色譜參數(shù)調(diào)整對(duì)分離和檢測的影響，必要時(shí)對(duì)調(diào)整色譜參數(shù)后的方法進(jìn)行確認(rèn)。若調(diào)整超出表中規(guī)定的范圍或品種項(xiàng)下規(guī)定的范圍，被認(rèn)為是對(duì)方法的修改，需要進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。調(diào)整梯度洗脫色譜參數(shù)時(shí)應(yīng)比調(diào)整等度洗脫色譜參數(shù)時(shí)更加謹(jǐn)慎，因?yàn)榇苏{(diào)整可能會(huì)使某些峰位置變化，造成峰識(shí)別錯(cuò)誤，或者與其他峰重疊。當(dāng)對(duì)調(diào)整色譜條件后的測定結(jié)果產(chǎn)生異議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。在品種項(xiàng)下一般不宜指定或推薦色譜柱的品牌，但可規(guī)定色譜柱的填充劑（固定相）種類（如鍵合相，是否改性、封端等）、粒徑、孔徑，色譜柱的柱長或柱內(nèi)徑當(dāng)耐用性試驗(yàn)證明必須使用特定品牌的色譜柱方能滿足分

12、離要求時(shí)，可在該品種正文項(xiàng)下注明。2、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個(gè)參數(shù)。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，必要時(shí)，可對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，以符合要求。2.1色譜柱的理論板數(shù)（n）用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t和峰寬（W

13、）半峰高寬（WJ，按nRh/2=16（t/W）2或n=5.54（t/W）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。t、W、W可用時(shí)間或長度計(jì)（下RRh/2Rh/2同），但應(yīng)取相同單位。2.2分離度（R）2.2.1用于評(píng)價(jià)待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)?？梢酝ㄟ^測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測物質(zhì)與某一指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到?，通過測定待測物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分離度，對(duì)色譜系統(tǒng)分離效能進(jìn)行評(píng)價(jià)與調(diào)整。2.2.2無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照色譜峰及其他

14、色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計(jì)算公式為：2x(tt)R二RR-W+W122x(tt)TOC o 1-5 h zRR HYPERLINK l bookmark18 1.70(W2+W1)1,h/22,h/2式中t為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；R2t為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；R1WW及W、w分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬（見下圖）。121,h/22,h/22.2.3當(dāng)對(duì)測定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。2.3靈敏度用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比（S/N）

15、來表示。建立方法時(shí)，可通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于10;定性測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度實(shí)驗(yàn)溶液來評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測能力。2.4拖尾因子（T）2.4.1用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。拖尾因子計(jì)算公式為：WT=005h2d1式中：W為5%峰高處的峰寬；d為峰頂在5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影點(diǎn)至峰0.05h1前沿與此平行線交點(diǎn)的距離，見下圖。2.4.2以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外，T值應(yīng)在0.951.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會(huì)影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會(huì)影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分

16、的準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)在品種正文項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作出規(guī)定。2.5重復(fù)性用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)值的重復(fù)性能。除另有規(guī)定外，通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積測量值（或內(nèi)標(biāo)比值或其校正因子）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。視進(jìn)樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應(yīng)和分析方法所能達(dá)到的精度水平等，對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求可適當(dāng)放寬或收緊，放寬或收緊的范圍以滿足品種項(xiàng)下檢測需要的精密度要求為準(zhǔn)。3、測定法3.1定性分析常用的定性方法主要有但不限于以下：3.1.1利用保留時(shí)間定性3.1.1.1保留時(shí)間（retentiontime,tR）定義為被分離組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)該組分最大響應(yīng)值時(shí)的時(shí)間，

17、也即從進(jìn)樣到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，常以分鐘（min）為時(shí)間單位，用于反映被分離的組分在性質(zhì)上的差異。通常以在相同的色譜條件下待測成分的保留時(shí)間與對(duì)照品的保留時(shí)間是否一致作為待測成分定性的依據(jù)。3.1.1.2在相同的色譜條件下，待測成分的保留時(shí)間與對(duì)照品的保留時(shí)間應(yīng)無顯著性差異；兩個(gè)保留時(shí)間不同的色譜峰歸屬于不同化合物，但兩個(gè)保留時(shí)間一致的色譜峰有時(shí)未必可歸屬為同一化合物，在作未知物鑒別時(shí)應(yīng)特別注意。3.1.1.3若改變流動(dòng)相組成或更換色譜柱的種類，待測成分的保留時(shí)間仍與對(duì)照品的保留時(shí)間一致，可進(jìn)一步證實(shí)待測成分與對(duì)照品為同一化合物。3.1.1.4當(dāng)待測成分（保留時(shí)間tR,1

18、）無對(duì)照品時(shí)，可以樣品中的另一成分或在樣品中加入另一已知成分作為參比物（保留時(shí)間tR,2）,采用相對(duì)保留時(shí)間（RRT）作為定性（或定位）的方法。在品種項(xiàng)下，除另有規(guī)定外，相對(duì)保留時(shí)間通常是指待測成分保留時(shí)間相對(duì)于主成分保留時(shí)間的比值，以未扣除死時(shí)間的非調(diào)整保留時(shí)間按下式計(jì)算：RRT=tR,1/tR,2若需以扣除死時(shí)間的調(diào)整保留時(shí)間計(jì)算，應(yīng)在相應(yīng)的品種項(xiàng)下予以注明。3.1.2利用光譜相似度定性3.1.2.1化合物的全波長掃描紫外-可見光區(qū)光譜圖提供一些有價(jià)值的定性信息。待測成分的光譜與對(duì)照品的光譜的相似度可用于輔助定性分析。二極管陣列檢測器開啟一定波長范圍的掃描功能時(shí)，可以獲得更多的信息，包括色

19、譜信息、時(shí)間、波長的三維色譜光譜圖，既可用于輔助定性分析，還可用于峰純度分析。3.1.2.2同樣應(yīng)注意，兩個(gè)光譜不同的色譜峰表征了不同化合物，但兩個(gè)光譜相似的色譜峰未必可歸屬為同一化合物。3.1.3利用質(zhì)譜檢測器提供的質(zhì)譜信息定性利用質(zhì)譜檢測器提供的色譜峰分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的信息進(jìn)行定性分析，可獲得比僅利用保留時(shí)間或增加光譜相似性進(jìn)行定性分析更多的、更可靠信息，不僅可用于已知物的定性分析，還可提供未知化合物的結(jié)構(gòu)信息。3.2定量分析3.2.1內(nèi)標(biāo)法3.2.1.1按品種正文項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，各精密量取適量，混合配成校正因子測定用的對(duì)照溶液。取一定量進(jìn)樣，記錄色

20、譜圖。測量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：A/c校正因子（f）=gsA/cRR式中：A為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；SA為對(duì)照品的峰面積或峰咼；Rc為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；SCr為對(duì)照品的濃度。3.2.1.2再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：A含量（c）=fxLXA/css式中：A為供試品峰面積或峰高；A內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；xsc為供試品的濃度；c內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為內(nèi)標(biāo)法較正因子。xs3.2.1.3采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對(duì)測定結(jié)果的影響。3.2.2外標(biāo)法按各品種

21、項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：A含量（Cx）=CRx才R式中各符號(hào)意義同上。當(dāng)采用外標(biāo)法測定時(shí)，以手動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。3.2.3加校正因子的主成分自身對(duì)照法3.2.3.1測定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取待測對(duì)照品和參比物質(zhì)對(duì)照品各適量，配制待測物校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按下式計(jì)算待測物的校正因子。亠cxA校正因子二TAcxABB式中：CA為待測物的濃度；AA為待測物的峰面

22、積或峰髙；AcB為參比物質(zhì)的濃度；A為參比物質(zhì)的峰面積或峰髙。B3.2.3.2也可精密稱(量)取主成分對(duì)照品和雜質(zhì)對(duì)照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對(duì)其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計(jì)算校正因子。3.2.3.3校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測峰面積，需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。3.2.3.4測定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤海鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，必要時(shí)，調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍(以噪聲水平可接

23、受為限)使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%25%。除另有規(guī)定外，通常含量低0.5%的雜質(zhì)，峰面積測量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積測量值的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積測量值的RSD應(yīng)小于2%。然后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時(shí)間，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算各雜質(zhì)含量。3.2.4不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測定雜質(zhì)含量時(shí)，若無法獲得待測雜質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不

24、加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述(3)法配制對(duì)照溶液、進(jìn)樣調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍和計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時(shí)間應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算雜質(zhì)含量。3.2.5面積歸一化法3.2.5.1按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量進(jìn)樣，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時(shí)，由于儀器響應(yīng)的線性限制，峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢査。3.2.5.2如適用，也可使用其他方法如標(biāo)準(zhǔn)曲線法等，并在品種正文項(xiàng)