1、第2章 微生物發(fā)酵制藥工藝本章內容2.1 微生物發(fā)酵與制藥2.2 制藥微生物生長特征2.3 制藥微生物菌種的建立2.4 培養(yǎng)基制備2.5 滅菌工藝2.6 微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術2.7 發(fā)酵工藝過程的控制2.8 抗生素生產(chǎn)工藝2.9 氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝2.10 維生素生產(chǎn)工藝2.1 微生物發(fā)酵與制藥發(fā)酵發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥的基本過程1 發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。 初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有

2、生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：比較復雜的化合物，不是細胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）?？股?，毒素，色素。2、發(fā)酵制藥概念利用制藥微生物的生長繁殖，通過發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程抗生素的發(fā)現(xiàn) 1928年，英國細菌學家Fleming B發(fā)現(xiàn)抗菌物質青霉素。在20世紀40年代，一共發(fā)現(xiàn)了14種抗生素，50年代發(fā)現(xiàn)了20余種，60年代開始了化學結構改造的合成和半合成抗生素階段。目前發(fā)現(xiàn)并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，共萬種以上。但實際生產(chǎn)和應用的只有100余種。發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵微生物菌體發(fā)

3、酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發(fā)酵、單細胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發(fā)酵微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青霉素?；?，用于半合成青霉素時，制備中間體6氨基青霉烷酸。微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。微生物轉化發(fā)酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉變?yōu)榻Y構相關的更有價值的產(chǎn)物的生化反應為轉化發(fā)酵。 制藥微生物的種類 生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢

4、桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacterium flarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環(huán)內酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為

5、多。真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。 3發(fā)酵制藥的基本過程 菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間2.2 微生物的生長特征微生物發(fā)酵基本過程特征（批式）菌體生長與產(chǎn)物生成的特征，三個階段發(fā)酵前期(fermentation prophase)菌體生長期（cell發(fā)酵中期(fermentation metaphase)產(chǎn)物合成（生產(chǎn)）期(product synthesis phase) growth phase

6、）發(fā)酵后期(fermentation anaphase)菌體自溶期(cell autolysis phase)發(fā)酵前期特征從接種至菌體達到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數(shù)生長期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質不斷消耗，減少生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。pH變化：先升后降先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機酸，后又被利用。幾個概念1 延遲期延滯期（lag phase）或適應期是指接種后，菌體的生物量沒有明顯增加的一段時間。延遲期是菌體適應環(huán)境的過程。延遲期時間長短不一，與遺傳和環(huán)境因

7、素有關，由菌體與環(huán)境相互作用的程度決定的。因不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現(xiàn)不同。工業(yè)上希望延遲期越短越好，常采用如種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基盡量接近，對數(shù)期的菌體作為種子、加大接種量等方法進行放大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)。2 對數(shù)生長期對數(shù)生長期（log phase）是菌體快速繁殖，生物量的增加呈現(xiàn)對數(shù)速度增長的過程。特點是生長速率達到最大值，并保持不變。細胞的化學組成與生理學性質穩(wěn)定。菌體生長不受限制，細胞分裂繁殖和代謝極其旺盛。可以認為細胞組分恒定，菌體細胞的生長速率與生物量是一級動力學關系3 減速期減速期(decline phase)是指菌體生長速率下降的一段時間。由培養(yǎng)基中基質濃度下降，有害物質積

8、累等不利因素引起。在減速期內，生長速率與菌體濃度仍符合一級動力學關系，但受基質濃度限制。一般生物的減速期較短。發(fā)酵中期特征以次級代謝產(chǎn)物或目標產(chǎn)物的生物合成為主的一段時間。菌體生長恒定就進入產(chǎn)物合成階段呼吸強度：無明顯變化，不增加菌體數(shù)目產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。對外界變化敏感：容易影響代謝過程，從而影響整個發(fā)酵進程。發(fā)酵后期特征菌體衰老，細胞開始自溶的一段時間合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢。氨基氮含有增加，pH上升發(fā)酵必須結束，否則產(chǎn)物被破壞菌體自溶給過濾和提取等帶來困難。自溶作用（autolysis） 自溶作用是細胞的自我毀滅（cellular sel

9、f-destruction），速溶酶體將酶釋放出來將自身細胞降解。在正常情況下，溶酶體的膜是十分穩(wěn)定的，不會對細胞自身造成傷害。 如果細胞受到嚴重損傷，造成溶酶體破裂，那么細胞就會在溶酶體酶的作用下被降解，如某些紅細胞常會有這種情況發(fā)生。 在多細胞生物的發(fā)育過程中，自溶對于形態(tài)建成具有重要作用。 生長與產(chǎn)物的關系模型從菌體生長、能源利用和產(chǎn)物生成速度的變化及其之間的動力學關系出發(fā)，Gaden把發(fā)酵過程分為三種模型。 I型：菌體生長與產(chǎn)物生成偶聯(lián)型(coupling model)。菌體的生長與產(chǎn)物生成直接關聯(lián)，生長期與生產(chǎn)期是一致的。產(chǎn)物往往是初級代謝的直接產(chǎn)物，菌體生長、糖的分解代謝、能源利用

10、和產(chǎn)物形成幾乎平行，生長期與生產(chǎn)期是一致的，菌體生長期和產(chǎn)物形成不是分開的。細胞生長、基質消耗、能源利用和產(chǎn)物生成動力學曲線幾乎平行，變化趨勢同步，都有最大值，出現(xiàn)的時間接近。組成型表達的基因工程菌的產(chǎn)物生成屬于此類型，蛋白質產(chǎn)物是細胞能量代謝的結果。乳酸、醋酸等初級分解代謝產(chǎn)物的生成也屬于此類型。所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為：II型：菌體生長與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)型（semi-coupling model）。該模型介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質消耗、能量利用之間存在間接關系。產(chǎn)物來自能量代謝所用的基質，但是在次級代謝與初級代謝分開的。在細胞生長期內，基本無產(chǎn)物生成，在生長的中后期生成大

11、量的產(chǎn)物而進入產(chǎn)物形成期。分批發(fā)酵出現(xiàn)兩個高峰，先是基質消耗和菌體生長的高峰，然后是產(chǎn)物形成的高峰。如檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達的蛋白質藥物也屬于此類型。產(chǎn)物生成速率和比速率分別為： ； III型：菌體生長與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型（non-coupling model）。菌體生長期與產(chǎn)物生成期為獨立的兩個階段，先形成物質消耗和菌體生長高峰，幾乎沒有或很少有產(chǎn)物生成，然后進入菌體生長靜止期，產(chǎn)物大量生成，并出現(xiàn)產(chǎn)物高峰。產(chǎn)物可能來自于中間代謝途徑，而不是分解代謝過程，物質消耗和菌體生長之后，菌體利用中間代謝途徑，初級代謝與產(chǎn)物形成是完全分開的，如抗生素、生物堿、微生物毒素的發(fā)酵。對于誘

12、導型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導物，基因轉錄和產(chǎn)物表達，所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為：代謝產(chǎn)物的生物合成 代謝（metabolism）是生物體內進行的生理生化反應的統(tǒng)稱。代謝分為分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)，前者是指把大分子降解為小分子的過程，為合成代謝提供能量和原料；而后者是指把小分子合成為復雜大分子的過程，滿足細胞生長和分化的需要。初級代謝是營養(yǎng)物質轉變?yōu)榧毎Y構物質和對細胞具有生理活性作用的物質，為細胞提供能量、合成中間體及其生物大分子的代謝網(wǎng)絡。在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物為初級代謝產(chǎn)物（primary metabolite），包括各種小分子前

13、體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。幾乎所有生物的初級代謝基本相同。次級代謝存在于某些生物中，并在一定時期表達。次級代謝對正常的生長可能不必要，但對抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意義。 次級代謝產(chǎn)物生物合成的基本特征 （1）次級代謝產(chǎn)物種類繁多，結構特殊，含有不常見的化合物和化學鍵。如氨基糖、苯醌、香豆素、環(huán)氧化合物、生物堿、內酯、核苷、雜環(huán)等基團，聚乙烯不飽和鍵、大環(huán)、環(huán)肽等鍵。 （2）具有種屬特異性，與種屬分類學無關。分類學上相同的菌種能產(chǎn)生不同結構的抗生素，如灰色鏈霉菌既可以產(chǎn)生氨基環(huán)醇類抗生素，又可以產(chǎn)生大環(huán)內酯類抗生素。分類學上不同的菌種能產(chǎn)生相同結構的抗生素，如霉菌和鏈霉菌均

14、可產(chǎn)生頭孢菌素C。一種微生物的不同菌株產(chǎn)生結構不同的多種次級代謝物，而同一菌株會產(chǎn)生一組結構類似的化合物。 （3）生長期轉向生產(chǎn)期，形態(tài)與生理發(fā)生變化。次級代謝產(chǎn)物是在細胞生長后期開始形成，當生長受限制時被啟動。完成菌體營養(yǎng)生長期（trophophase）之后，出現(xiàn)次級代謝物合成期（idiophase），其生物合成比生長對環(huán)境更敏感，要求更高。次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為前體，受到初級代謝的調節(jié)。可能是缺乏某種營養(yǎng)成分，菌體生長抑制，啟動了次級代謝物合成。菌體內中間代謝物積累，抑制了初級代謝酶，使之消失或活性下降，誘導了新酶的出現(xiàn)，轉入生產(chǎn)期。芽孢桿菌形成芽孢，放線菌和真菌形成孢子，抗生素合

15、成可能是細胞分化的伴隨現(xiàn)象。 （4）次級代謝產(chǎn)物是結構相似的一組混合物，但活性差異較大。參與反應的酶的底物特異性不強。產(chǎn)生菌利用一種或兩種以上的初級代謝產(chǎn)物合成一種主要的次級代謝產(chǎn)物，并繼續(xù)對該產(chǎn)物進行修飾生成多種衍生物。一種次級代謝產(chǎn)物可由兩種或兩種以上代謝途徑合成。 （5）次級代謝產(chǎn)物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色體外，還有細胞質遺傳物質，可能存在于質粒、線粒體基因。遺傳物質的變異和丟失是導致菌種退化和生產(chǎn)不穩(wěn)定的重要因素，所以具有代謝不穩(wěn)定性。次級代謝產(chǎn)物的構建單位 微生物合成的次級代謝產(chǎn)物是由微生物代謝產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C

16、4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初級代謝產(chǎn)物合成。把構成次級代謝產(chǎn)物的基本結構單位稱為生源（biogen）。生源直接或間接來源于次級代謝過程的中間產(chǎn)物或初級代謝產(chǎn)物。構建單位包括聚酮體、甲羥戊酸、糖類、不常見的氨基酸（如D氨基酸、氨基酸等）、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇等。次級代謝產(chǎn)物的生物合成的基本過程次級代謝產(chǎn)物的合成基本過程包括構建單位的聚合再修飾裝配。在此過程中，次級代謝產(chǎn)物的累積受合成途徑中某些酶活性的限制，這些關鍵酶活性大小與產(chǎn)量正相關。 （1）前體聚合微生物合成生源后，通過縮合反應形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。各種聚酮體的合成過程相似，只是起始單位和延長單位不同。聚酮體是26個二碳單

17、位的聚合反應的結果，酮基被保留，或只是還原為羥基。聚酮體可直接形成環(huán)，如四環(huán)素類和大環(huán)內酯類。進而被修飾，與相應基團如氨基糖、糖胺等結合，形成結構和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再與8個丙二酰單位縮合形成9酮化合物，再轉化為中間體三環(huán)化合物。甲基化、還原、脫水、加氫、氧化形成4氧脫水四環(huán)素，加氯形成4氧脫水氯四環(huán)素，轉氨形成4氨基脫水氯四環(huán)素，再甲基化形成脫水氯四環(huán)素，脫氫氯四環(huán)素，最后形成氯四環(huán)素。大環(huán)內酯是24碳單位縮合而成。氨基酸的聚合有三種形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化縮合，如谷胱甘肽；蛋白質的核糖體模板合成途徑；多酶復合物將氨基酸活化后，按硫模板或非核糖

18、體機理縮合，形成肽鏈。氨基酸與ATP反應，在羧基上形成腺苷單磷酸酯被激活。氨基酸被轉移到酶的巰基上，形成硫酯鍵。硫酯鍵斷裂，提高能量，使2個氨基酸之間形成肽鍵（羧基與氨基結合）。依次，形成多肽鏈。如短桿菌肽S是由2條5肽首尾連接而成。 （2）結構修飾 包括糖基化、?；?、甲基化、羥基化、氨基化、氧化還原等，使抗生素產(chǎn)生了共存的系列類似物。在聚酮體鏈延長的過程中，伴隨許多基團的化學修飾，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷鍵與糖類物質連接，酰胺鍵與氨基酸連接，形成各種抗生素。如四環(huán)素類，先形成聚酮體，在C7位發(fā)生氯化則是金霉素，在C5位上先氧化后還原則是土霉素。 （3）裝配 合成各個組分后，需要按

19、一定順序在特異酶作用下組裝，才能形成有活性的藥物。 2.3 制藥微生物菌種的建立發(fā)酵生產(chǎn)藥物，需產(chǎn)量高的菌種，自然界中的菌種趨向于快速生長和繁殖，而發(fā)酵工業(yè)需要大量積累產(chǎn)物，因此菌種選育很重要。常規(guī)方法是利用天然變異，從中選擇優(yōu)良株系。隨后物理因子（紫外線、X射線、中子、激光等）和化學因子（烷化劑、堿基類似物等）和生物因子（噬菌體、抗生素）誘變育種。20世紀80年代，以原生質體融合的雜交育種和基因工程育種，90年代以后，可以用基因組shuffling育種。新藥生產(chǎn)菌的選育 自然分離 自然選育 誘變育種 雜交育種 基因工程技術育種 微生物藥物與菌種的篩選流程樣品采集 微生物分離 培養(yǎng) 篩選方法學

20、建立 篩選鑒定前藥新化合物 化合物分離純化 陽性結果 生產(chǎn)出發(fā)菌 菌種鑒定與保藏 新化合物新藥研究與開發(fā)1、生產(chǎn)菌的自然分離(1)來源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：80%表層土壤（010cm），海洋（0100m）欲處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性，用物理和化學的方法處理。（1）溫度；高溫可得到放線菌。（2）SDS酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減少細菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。 （3）離心、膜過濾1、生產(chǎn)菌的自然分離(2)培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基，營養(yǎng)和pH；添加抑制劑。分離方法：（1）稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖液（2）濾膜法：0.22 0.45 m。細菌在

21、膜上，放線菌菌絲可穿透，進入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：溫度。放線菌：2530，3237，714天至1月；4550，12d 。藥物的篩選瓊脂擴散法活性測定：非致病菌為對象，耐藥細菌和厭氧菌的抗生素，篩選生物活性物質。HPLC、LCMS等，分析鑒定活性物質。靶向篩選高通量篩選高內涵篩選 從臨床有效的抗生素的作用機理和細菌的耐藥機理來設計篩選模型，有目的的篩選具有某種作用機理的抗生素。高通量篩選是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結果數(shù)據(jù)，以計算機對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，同一時間對數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應的數(shù)據(jù)庫支

22、持整體系運轉的技術體系。 所謂高內涵篩選是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環(huán)節(jié)的影響，在單一實驗中獲取大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性。從技術層面而言，高內涵篩選是一種應用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，在細胞水平上檢測多個指標的多元化、功能性篩選技術，旨在獲得被篩樣品對細胞產(chǎn)生的多維立體和實時快速的生物效應信息。高內涵篩選技術的檢測范圍包括：靶點激活、細胞凋亡、分裂指數(shù)、蛋白轉位、細胞活力、細胞遷移、受體內化、細胞毒性、細胞周期和信號轉導等。2、菌種選育自然選育（1）定義：不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變

23、而進行的菌種篩選過程。應用：（1）菌種的提純復壯。（2）防止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1年1次。過程菌種 單孢子 平板分離 單菌落測活 優(yōu)良菌株效率低, 增產(chǎn)幅度小2、菌種選育誘變育種（2）定義：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個體，淘汰劣質個體。物理類：紫外線，快中子，激光，太空射線。化學類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。生物類：噬菌體，轉座子。特點：快速，簡單，效益大。缺點：無定向性。誘變育種流程出發(fā)菌種 單孢子懸液 誘變處理 高產(chǎn)菌株 單菌落初篩 稀釋涂板復篩 穩(wěn)定性特性 中試放大 投入生產(chǎn)2、菌種選育雜交育種（3）概念：兩個不同基因型的菌株，通過結合或原生質體融合，使遺傳物

24、質發(fā)生重新組合，從中分離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。特點：有一定的定向性。種類：準性生殖接合原生質體融合（1）準性生殖育種概念：準性生殖范圍：放線菌，半知菌綱的真菌過程兩條菌絲 相互結合 異核體 二倍體 重組單倍體 產(chǎn)黃青霉：提高青霉素產(chǎn)量 對氟苯丙氨酸灰黃鏈霉菌：灰黃霉素產(chǎn)量 準性生殖是指異核體（單個生物個體中含有兩種或兩種以上基因型）細胞中兩個遺傳物質不同地細胞核可以結合成雜合二倍體地細胞核。這種雜合二倍體的細胞核在有絲分裂過程中可以發(fā)生染色體和單倍體化,最后形成遺傳物質重組的單倍體的過程。也就是不經(jīng)過減數(shù)分裂就能導致基因重組的生殖過程。 （2）接合育種范圍：細菌、放線菌過程：兩種細胞混合

25、培養(yǎng) 基因片段進入另一細胞 合子 重組單倍體雖然有成功報導，但多數(shù)效果不顯著（3）原生質體融合育種概念通過生物學、化學或物理學的方法，使兩個不同種類的體細胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個親本遺傳性狀的新細胞.用去壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生質體，在高滲條件下，用聚乙二醇（PEG）促進原生質體發(fā)生融合，再生細胞壁，從而獲得異核體或重組子，這一技術叫原生質體融合。 3、菌種保藏原因：菌種經(jīng)過多次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。措施：物理和化學方

26、法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧；營養(yǎng)；缺乏）保藏方法低溫斜面保藏：低溫降低新陳代謝。4，RH70以下。短期保藏，16個月；易變異石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發(fā)。4，約1年。砂土管保藏：干燥抑制生長。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數(shù)年。冷凍干燥保藏：保護劑降低菌體細胞冰點，減少冰晶對細胞傷害。低溫避光，中期保藏，510年。液氮保藏：培養(yǎng)物與冷凍保護劑混合，密封。液氮（196）罐或80冰箱。低溫、缺氧、避光和營養(yǎng)缺乏環(huán)境。長期保藏。保藏機構中國中國典型培養(yǎng)物保藏中心:China Center for Type Culture Collection (CCTCC)。中國科學院典

27、型培養(yǎng)物保藏委員會,下設9個庫中國普通微生物菌種保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和細菌）；武漢所（病毒）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國醫(yī)學科學院抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團抗生素所小結生產(chǎn)菌的分離：自然分離與篩選菌種選育：自然選育、雜交育種、誘變育種菌種保藏：低溫、干燥；機構2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基制備概念（medium） 供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工

28、藝選擇、產(chǎn)品質量和產(chǎn)量。2.4.1 培養(yǎng)基的成分碳源氮源無機鹽水生長因子前體與促進劑消泡劑1、碳源(carbon sources)概念：構成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質。作用：為正常生理活動和過程提供能量來源，為細胞物質和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。碳源種類糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機酸遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸2、氮源（nitrogen sources）概念：構成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質。作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。種類：無機氮源、有機氮源有機氮源幾乎所有

29、微生物都能利用有機氮源：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素。無機氮源氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。工業(yè)應用：主要氮源或輔助氮源；調節(jié)pH值生理酸性物質：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質。 （NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸生理堿性物質：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質。 硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。3、無機鹽和微量元素概念：組成生理活性物質或具有生理調節(jié)作用礦物質作用方式：低濃度起促進作用，高濃度起抑制作用。種類：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。4、水菌體細胞的主要成分。營養(yǎng)傳遞的介質。良好導體，調節(jié)細胞生長環(huán)境溫度。培養(yǎng)基的

30、主要成分之一。5、生長因子（growth factor）概念：維持微生物生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。6、前體(precursor)概念：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結合到目標產(chǎn)物分子中，而自身的結構無多大的變化。使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施。多次少量、連續(xù)流加的工藝。7、促進劑(accelerant)概念：促進產(chǎn)物生成的物質，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。種類：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，

31、起誘導作用。8、消沫劑（defoamingagent）概念：降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。種類：表面活性劑，低表面張力。天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。2.4.2 培養(yǎng)基種類及其質量控制技術培養(yǎng)基的種類按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質：固體，半固體、液體培養(yǎng)基按化學組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補料培養(yǎng)基。1、固體培養(yǎng)基概念：（solid medium）細菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。制備：液體培養(yǎng)基添

32、加1.0-2.0%瓊脂粉。作用：提供菌體的生長繁殖，形成孢子。1、固體培養(yǎng)基要求與質量控制單細胞培養(yǎng)基：營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。孢子培養(yǎng)基：基質濃度較低，無機鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。2、種子培養(yǎng)基概念：（seed medium）供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基,為液體。作用：使種子擴大培養(yǎng)，增加細胞數(shù)目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。2、種子培養(yǎng)基要求與質量控制培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。用速效性、容易被利用的碳、氮源和無機鹽等物質，但濃度不宜高。種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應，主要成分接近，不能差異太大?？s短發(fā)酵的延滯

33、期。3、發(fā)酵培養(yǎng)基概念：(fermentation medium)提供微生物生長、目標產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關鍵和最重要的培養(yǎng)基。3、發(fā)酵培養(yǎng)基要求營養(yǎng)物質濃度和粘度適中。組成上豐富完整。不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。4、補料培養(yǎng)基(fed medium）概念：發(fā)酵過程中添加補充的培養(yǎng)基。作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量組成：各種必要的營養(yǎng)物質，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨立控制，或按一定比例制成復合補料培養(yǎng)基。5、控制發(fā)酵培養(yǎng)基質量（1）控制水質：恒

34、定水源和恒定的水質。地下深層井水，對水質定期化驗檢查，使用符合要求的水質配制各種培養(yǎng)基措施：檢測與控制水質參數(shù)pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類和含量。（2）控制培養(yǎng)基原料的質量：來源與種類的選擇農(nóng)副產(chǎn)品：因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質量差異較大?；瘜W原料：雜質含量也不相同。措施：保持穩(wěn)定的原料來源。更換原料時，必需再進行一系列試驗，確保產(chǎn)量和質量的控制和穩(wěn)定性。原料的選擇試驗：不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。對原料進行試驗，選擇滿足發(fā)酵要求的來源。注意：碳氮濃度與配比：適宜速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢pH：配制時加入酸堿性物

35、質搭配，甚至使用緩沖劑。（3）控制培養(yǎng)基的黏度：對發(fā)酵的影響：高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過程直接影響菌體對營養(yǎng)的利用目標產(chǎn)物的分離提取造成困難措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質（4）控制滅菌操作： 高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長時間滅菌，營養(yǎng)成分會破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應，生成沉淀或絡合物，降低利用度。維生素等不耐高溫分解破壞、失活。2.4.3 制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制一般設計原則設計思路計算與定量配制優(yōu)化1、培養(yǎng)基設計一般原則生物學原則：根據(jù)不同微生物營養(yǎng)和反應需求設

36、計。營養(yǎng)物質組成：較豐富，濃度適當。成分之間比例：恰當，C/N比適宜。原料之間：不能產(chǎn)生化學反應。適宜的pH和滲透壓工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。低成本原則：原料來源方便，質量穩(wěn)定，質優(yōu)價廉。高效經(jīng)濟原則：滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。2、培養(yǎng)基設計基本思路 起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗和使用。單因素實驗：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。中試放大試驗：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。3、理論計算與定量配制微生物生長和生產(chǎn)可用下列表達式表

37、示：碳源和能源氮源其他營養(yǎng)物質細胞產(chǎn)物CO2H2O熱量單位細胞生物量所需最小的營養(yǎng)物質:單位產(chǎn)量的最小底物濃度:碳源和氮源進行轉化率計算和分析初步計算：參考微生物的化學和元素組成。轉化率：單位質量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細胞量。理論轉化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算實際轉化率：發(fā)酵過程中實際測量數(shù)值計算。目標：使實際轉化率靠近理論轉化率。2.5 滅菌工藝滅菌方法與原理培養(yǎng)基滅菌工藝空氣除菌工藝幾個概念雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。消毒：殺滅或清除病原微生物，達到無害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，達到無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%

38、以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。2.5.1 滅菌方法與原理1、化學滅菌2、物理滅菌1、化學滅菌用化學物質殺滅微生物的滅菌操作?；瘜W滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。機理：蛋白質變性，酶失活，破壞細胞膜透性，細胞死亡。應用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。2、物理滅菌各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌紫外線等射線：局部空間干熱滅菌：實驗室器皿蒸汽滅菌：培養(yǎng)基效果好，操作方便，廣泛使用。3 干熱滅菌 在高溫120以上，蛋白質、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細胞破裂，內容物釋放，生物體死亡。

39、對于干熱滅菌，足夠長的時間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干熱滅菌效果沒有濕熱滅菌好，是實驗室常用的器皿的方法。工業(yè)采用160、2h，或170、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時間相應縮短。4 蒸汽滅菌濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，原因在于濕熱狀態(tài)下，穿透力強，蒸汽冷凝時釋放出大量能量，使蛋白質、核酸等內部的化學鍵破壞、降解，導致生物體死亡。一般在115140，保持一段時間，可以殺死各種生物體。由于蒸汽價格低廉，來源方便，效果可靠，操作控制簡便，因此濕熱滅菌常用于培養(yǎng)基和設備容器的滅菌。常用條件為115121，壓力1105Pa，維持1530分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有

40、厚膜包裹，耐熱性很強，不易殺滅。因此在設計滅菌操作時，經(jīng)常以殺死芽孢的溫度和時間為指標。為了確保徹底滅菌，實際操作中往往增加50的保險系數(shù)。2.5.2 培養(yǎng)基滅菌1、微生物高溫死亡動力學與滅菌的關系微生物受熱死亡過程的一級動力學反應：dX/dt= kdX微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。以殺死芽孢的溫度和時間為指標。確保徹底滅菌，實際操作中增加50的保險系數(shù)。2、培養(yǎng)基滅菌的操作方式(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。特點：不需其他的附屬設備，操作簡便，手動。缺點：加熱

41、和冷卻時間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。分批操作的滅菌過程分批滅菌的操作過程通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。加熱升溫：70，取樣管、放料管通入蒸汽。維持保溫：120，罐壓0.1MPa，排氣。調節(jié)進汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關閉排氣、進汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。（2）連續(xù)滅菌操作高溫短時滅菌操作，連續(xù)：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內的工藝過程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設備執(zhí)行：加熱器，保溫設備，冷卻器。（2）連續(xù)滅菌操作流程圖培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達

42、到滅菌溫度（130140）（2）連續(xù)滅菌操作過程配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預熱罐：定容和預加熱。7090。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130140。維持罐：維持滅菌時間,57分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。4050。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。連續(xù)滅菌的特點1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少2）熱能利用合理，易于自動化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8 MPa。2.5.3 空氣除菌操作工藝1、發(fā)酵對空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣。壓強：0.2-

43、0.4 MPa?？諝赓|量：相對濕度小于70；比培養(yǎng)溫度高1030；潔凈度100級。2、工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：空氣在進入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需用空壓機以提高壓力，所以空氣熱滅菌時所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時的溫度升高來實現(xiàn) .靜電除菌：靜電除塵是利用靜電引力來吸附帶電離子而達到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數(shù)帶有不同的電荷，沒有電荷的微粒進入高壓靜電場時則會被電離成帶電微粒，但對于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對微粒的拖帶力或微粒布朗運動的動量時，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對很小的微粒效率較低。介質過濾：是使空氣通

44、過經(jīng)高溫滅菌的介質過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質層中，而達到除菌的目的。3、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。 是依靠氣流通過濾層時，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動過程中出現(xiàn)無數(shù)次改變氣速大小和方向的繞流運動，從而導致微生物微粒與濾層纖維間產(chǎn)生撞擊、攔截、布朗擴散、重力及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實現(xiàn)了過濾。 （1）.慣性沖擊滯留作用機理當微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運動時，空氣受阻即改變運動方向，繞過纖維前進，而微粒由于它的運動慣性較大，未能及時改變運動方向隨主導氣流前進，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附

45、，微粒就滯留在纖維表面上。（）、攔截滯留作用機理 當氣流速度下降到一定值時，若微粒 隨氣流慢慢靠近纖維時，受纖維所阻改變 方向，繞過纖維前進，并在纖維的周邊形 成一層邊界滯留區(qū)，滯留區(qū)的氣流流速更 慢，當與纖維表面接觸時就被捕集。 （）、布朗擴散作用機理 直徑很小的微粒在很慢的氣流中能產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線運動，稱為布朗擴散。（）、重力沉降作用機理 重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。（）、靜電吸附作用機理 懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電荷，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。 當空氣流過介質時，上述五種除菌機理同時起作用，不過氣流

46、速度不同，起主要作用的機理也就不同。當氣流速度較大時，除菌效率隨空氣流速的增加而增加，此時慣性沖擊起主要作用；當氣流速度較小時，除菌效率隨氣流速度的增加而降低，此時擴散起主要作用；當氣流速度中等時，可能是截留起主要作用。如果空氣流速過大，除菌效率又下降，則是由于已被捕集的微粒又被湍動的氣流夾帶返回到空氣中。 除菌效率影響深層過濾效率的因素 微粒大小、過濾介質的種類、規(guī)格、介質的填充密度、過濾介質層厚度以及所通過的空氣氣流速度等。4、空氣過濾介質膜過濾介質：孔徑小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹脂微孔濾膜。0.1-0.5um深層過濾介質：空隙大于被截留微

47、生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭過濾紙：超細玻璃纖維紙(1-1.5um)金屬燒結管：單根或幾十根甚至上百根金屬微孔濾管安裝在過濾器內。5、空氣滅菌工藝過程6 過濾除菌設備結構一.概述： 提高壓縮前空氣的潔凈度的主要措施： 提高空氣吸氣口的位置和加強吸入空氣的前過濾。 一、空氣預處理設備 1粗過濾器 安裝在空氣壓縮機前的粗過濾器，其主要作用：捕集較大的灰塵顆粒，防止壓縮機受損，同時也可減輕總過濾器負荷。 粗過濾器一般要求過濾效率高，阻力小，否則會增加空氣壓縮機的吸入負荷和降低空氣壓縮機的排氣量。 常用的粗過濾器有：布袋過濾、填料式過濾、油浴洗滌和水霧除塵等。2.設備結

48、構除塵器 空氣壓縮機 分為離心式空氣壓縮機和往復式空氣壓縮機兩種。 空氣除菌中除去水霧油霧的原因： 否則：（1）導致傳熱系數(shù)降低，給空氣冷卻帶來困難。 （2）如果油霧的冷卻分離不干凈，帶入過濾器會堵塞過濾 介質的纖維空隙，增大空氣壓力損失。 （3）黏附在纖維表面，可能成為微生物微粒穿透濾層的途徑，降低過濾效率，嚴重時還會浸潤介質而破壞過濾效果。貯氣罐 貯氣罐的作用：（1）消除脈動維持罐壓的穩(wěn)定。（2）使部分液滴在罐內沉降。（3）保溫滅菌。 冷卻器 油水分離器 加熱器 二級冷卻器 其結構同一級冷卻器相同，由于季節(jié)關系或其它原因對壓縮空氣的冷卻效果達不到工藝要求的情況下，可增設二級冷卻器，再次冷卻

49、。 通過油水分離器凈化過的空氣，仍含有粒度較小的雜質及油水霧滴，需在除霧器中進一步除去。除霧器結構較簡單，為一個中間夾有填料瓷環(huán)的容器，油水霧滴遇到填料瓷環(huán)便凝聚下來，最后，可通過油水排出口排出。除霧器2.6發(fā)酵培養(yǎng)技術 選擇合適的培養(yǎng)基；提供適宜的環(huán)境條件微生物發(fā)酵工藝過程的三個工段：種子制備接種發(fā)酵培養(yǎng)2.6.1 種子制備種子的制備：種子的逐級擴大培養(yǎng)過程。獲得一定數(shù)量和質量的純種過程。1孢子制備種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)，恢復其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。細菌：采用碳源有限而氮源豐

50、富的配方。2生產(chǎn)種子制備 搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)確定種子級數(shù)的因素:菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少發(fā)酵罐的容積：越大，多產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少發(fā)酵類型的定義一級發(fā)酵：將孢子或菌絲接入直接發(fā)酵罐二級發(fā)酵：經(jīng)過一級種子罐，再到發(fā)酵罐；谷氨酸生產(chǎn)三級發(fā)酵：二級種子擴大培養(yǎng)，經(jīng)過二次種子罐，再接入發(fā)酵罐。青霉素生產(chǎn)四級發(fā)酵：三級種子擴大培養(yǎng)，經(jīng)過三級種子罐，再到發(fā)酵罐。鏈霉素生產(chǎn)菌接種方式單種法：一個種子罐的種子接種一只發(fā)酵罐。雙種法：兩個種子罐的種子接種一只發(fā)酵罐。倒

51、種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個發(fā)酵罐。2.6.2 培養(yǎng)技術1、固體表面培養(yǎng)技術：Solid surface culture原始，最早采用。2、液體深層培養(yǎng)：Liquid submerged culture主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術3、高密度培養(yǎng)（high cell density culture）概念：菌體濃度（干重）至少達到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標和方向。優(yōu)點: 縮小發(fā)酵體積增加表達量成本低，生產(chǎn)率高。2.6.3 發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式 1、分批式操作；間歇式操作；不連續(xù)操作2、流加式操作，補料分批式操作3、半連續(xù)式操作，反復分批式或換液培養(yǎng)4、連續(xù)式操作，衡態(tài)操作5、

52、灌流式操作1、分批式操作概念：培養(yǎng)液一次性裝入發(fā)酵罐，一次性接種，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，一次性卸出全部培養(yǎng)物。特點：非衡態(tài)過程發(fā)酵體系的組成（基質、產(chǎn)物及細胞濃度）都隨發(fā)酵時間而變化。缺點：開始時基質濃度很高，到中后期，營養(yǎng)物濃度很低，產(chǎn)物濃度很高，對發(fā)酵不利。輔助時間：清洗罐，裝料、滅菌，時間長。2、流加式操作概念：裝入大部分培養(yǎng)液，一次性接種，在培養(yǎng)過程中連續(xù)不斷補充新培養(yǎng)基，但不取出培養(yǎng)液。特點：流加能源和碳源物質及氨水等?？朔伺降娜秉c，使生長和生產(chǎn)保持適宜水平。缺點：整個發(fā)酵體積不斷增加。3、半連續(xù)式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，一次性接種。間歇取出部分發(fā)酵培養(yǎng)物（帶放），同時補充同

53、等數(shù)量的新培養(yǎng)基；然后繼續(xù)培養(yǎng)，直至發(fā)酵結束。特點：發(fā)酵罐內的培養(yǎng)液總體積保持不變使生長和生產(chǎn)保持適宜水平。缺點：喪失部分前體，喪失部分菌體，利于非生產(chǎn)菌突變株的生長4連續(xù)式操作概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過程中，不斷補充新培養(yǎng)基,同時取出包括培養(yǎng)液和菌體在內的發(fā)酵液，直至發(fā)酵結束。特點：恒定狀態(tài)的發(fā)酵，發(fā)酵罐內體積及其物系的組成將不隨時間而變。培養(yǎng)基連續(xù)穩(wěn)定流加；產(chǎn)物連續(xù)穩(wěn)定收獲；提高菌體密度；自動化。缺點：時間長，雜菌污染、突變機會增多。5、灌流（注）式操作概念：培養(yǎng)液與菌體一起裝入發(fā)酵罐，菌體培養(yǎng)過程中，不斷補充新培養(yǎng)基，取出部分條件培養(yǎng)基，菌體仍然滯留罐內。特點：除去有毒害的

54、代謝物補充營養(yǎng)物質2.7 發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平取決于:生產(chǎn)菌種性能與合適的環(huán)境條件發(fā)酵過程各種參數(shù)處于不斷變化狀態(tài)關鍵在于過程檢測與控制檢測儀器與主要參數(shù)原位傳感器：pH，溶氧，溫度，壓力在線儀器：尾氣分析儀離線儀器：基質、產(chǎn)物濃度生物學參數(shù)：菌體濃度，形態(tài)，雜菌物理參數(shù)：溫度，壓力，攪拌，粘度化學參數(shù)：基質濃度，pH，溶解氧，尾氣，補料，消泡2.7.1 生物學檢測主要的參數(shù)與控制1.細胞形態(tài)鏡檢：顯微鏡檢測，染色，光學、熒光，電鏡應用：是否污染，發(fā)酵過程狀態(tài)，菌種的真實性。2. 菌體濃度概念：菌濃：單位體積發(fā)酵培養(yǎng)液內菌體細胞的含量。應用：決定適宜補料量、供氧量等，以得到最佳生

55、產(chǎn)水平。臨界菌體濃度控制概念：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時的菌體濃度 菌體濃度超過此濃度，抗生素的生產(chǎn)速率會迅速下降。菌體遺傳特性與發(fā)酵罐氧傳質特性的綜合反映。3.發(fā)酵污染雜菌的檢測與控制種子污染培養(yǎng)基滅菌不徹底空氣帶菌設備及其附件滲漏2.7.2 物理參數(shù)的檢測與控制1.溫度的檢測與控制發(fā)酵溫度概念:發(fā)酵中的所維持溫度在生長和生產(chǎn)的最適溫度范圍內測定：熱電阻等熱敏原件測定，溫度計上讀出。（1）發(fā)酵熱的構成與計算發(fā)酵熱（fermentation heat）產(chǎn)生熱與散失熱之差產(chǎn)生熱：生物熱和攪拌熱散失熱：蒸發(fā)熱、顯熱和輻射熱。Q發(fā)酵Q生物Q攪伴Q蒸發(fā)Q顯Q輻射生物熱(biological heat)

56、概念：菌體生長過程中直接釋放到體外的熱能。影響因素：培養(yǎng)基成分：越豐富，生物熱越多。菌體濃度、呼吸強度：越大，生物熱越多。不同生長階段：生物熱也不同。發(fā)酵熱平衡的主要依據(jù)：對數(shù)期的生物熱攪拌熱(agitation heat)概念：攪拌器引起的液體做機械運動時因為摩擦所產(chǎn)生的熱量。影響因素：發(fā)酵罐：攪拌設備、攪拌方式培養(yǎng)基：發(fā)酵液黏度。計算：單位體積發(fā)酵液的消耗功率與熱功量（3600kJ/kWh）的乘積。散失熱蒸發(fā)熱：空氣進入發(fā)酵罐后，引起水分蒸所需的熱能。顯熱：廢氣排出時帶走的熱能。輻射熱：發(fā)酵液中部分熱能以輻射熱的形通過罐體輻射到大氣中。影響因素：溫度差異而造成的熱能損失。發(fā)酵溫度、通氣溫度

57、和流量等發(fā)酵熱計算發(fā)酵熱攪拌熱生物熱-冷卻熱（1）根據(jù)冷卻水流量、溫度變化。（2）根據(jù)罐溫與時間的變化（3）根據(jù)化合物的燃燒熱1 M葡萄糖產(chǎn)生281 J （2）溫度的選擇原則選擇最適溫度并嚴格控制。不同菌種：不同溫度。兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：生長階段，選擇適宜的菌體生長溫度，生產(chǎn)階段選擇最適宜的產(chǎn)物生產(chǎn)溫度。后期降溫控制：避免產(chǎn)物降解。（3）溫度的控制方式一般不需要加熱，往往經(jīng)常需要降溫冷卻夾套層、蛇形管，熱交換；冷卻水降溫：滯后，需要一定的經(jīng)驗和技巧冷凍鹽水循環(huán)式降溫：迅速建立冷凍站：提高冷卻能力發(fā)酵溫度與冷卻偶聯(lián)2.壓力的檢測與控制概念：罐體內的壓力，由壓力表讀出。罐壓的影響：維持正壓，防止污染

58、;CO2和O2的溶解度不同生物對壓力耐受不同控制：進或出口閥門，進入或排出氣體或空氣流量維持工藝所需壓力：0.020.05 MPa3.攪拌的檢測與控制攪拌的影響：氣體的傳遞速度和發(fā)酵液的混合均勻程度攪拌指標：攪拌轉速和攪拌功率。攪拌控制策略：發(fā)酵中不同階段對氧需求進行調節(jié)。2.7.3 化學參數(shù)的檢測與控制基質濃度pH溶解氧尾氣1.基質濃度的檢測與控制基質濃度：發(fā)酵液中糖、氮、磷等發(fā)酵液中營養(yǎng)物質的濃度檢測：在線或離線。2. pH檢測與控制發(fā)酵中pH的變化是酸和堿綜合表現(xiàn)。酸的來源：糖類原料中的酸性雜質；糖在高溫滅菌中氧化或反應生成酸；糖被代謝生成有機酸，分泌到培養(yǎng)液。堿的來源：水解酪蛋白和酵母

59、粉等作為碳源利用。控制pH策略分階段控制：生長最適pH和產(chǎn)物最適pH。緩沖液控制：碳酸鈣和磷酸鹽緩沖液。補加酸或堿進行控制：補料方式控制：流加糖率來控制pH。3.溶解氧的檢測與控制概念：溶于培養(yǎng)液中的氧含量表示：絕對含量，飽和氧濃度的百分數(shù)。檢測：在線溶氧電極?？刂撇呗裕汗亢托枰慷€方面考慮使之需氧不超過設備的供氧能力。供氧oxygen supply原理氧溶解過程：氧從空氣氣泡擴散到培養(yǎng)液氧溶解速率：dissolved oxygen rate氧傳遞速率：oxygen transfer rate, OTR 耗氧oxygen consumption菌體吸收溶解氧的過程攝氧速率(Oxygen

60、uptake rate，OUR) 耗氧速率臨界氧濃度不影響呼吸或產(chǎn)物合成的最低溶解氧濃度。供氧必需大于或等于耗氧溶解氧速率大于或等于菌體攝氧速率，才能使發(fā)酵正常進行。臨界溶氧測定測定：尾氣O2變化和通氣量；溶氧電極細菌和酵母：310放線菌：530霉菌：1015。呼吸臨界氧濃度和合成臨界氧濃度可能不一致。影響供氧因素氧推動力增加氧分壓：通入純富氧空氣，增加溶氧濃度，不經(jīng)濟。提高罐壓：增加CO2濃度，對設備要求高改變通氣速率：兩倍，有時達510倍。降低發(fā)酵溫度影響供氧因素體積傳遞系數(shù)KLa攪拌器設計，類型、葉片、直徑、擋板、位置空氣分布器的類型與位置增加攪拌強度增加擋板其他工藝條件改變培養(yǎng)基粘度液