1、 周周 建建 林林一、真核生物基因表達調(diào)控的特點一、真核生物基因表達調(diào)控的特點(略略)二、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控二、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控三、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究方法三、真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究方法轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控n順式作用元件順式作用元件(cis-acting element)n反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor)順式作用元件順式作用元件n是指對基因表達有調(diào)控活性的是指對基因表達有調(diào)控活性的DNA序列，其序列，其活性只影響與其自身同處于一個活性只影響與其自身同處于一個DNA分子上分子上的基因的基因n非編碼序列非編碼序列n分為：啟動子、增強子、沉默

2、子、絕緣分為：啟動子、增強子、沉默子、絕緣子子反式作用因子反式作用因子trans-acting factor概念：通過識別和結(jié)合順式作用元件的核心序列概念：通過識別和結(jié)合順式作用元件的核心序列,而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄效率的一類蛋白因子（轉(zhuǎn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄效率的一類蛋白因子（轉(zhuǎn)錄因子），對基因表達調(diào)控可正錄因子），對基因表達調(diào)控可正(激活激活)可負可負(阻阻遏遏) 。 n類別：基本轉(zhuǎn)錄因子、上游轉(zhuǎn)錄因子和可誘導類別：基本轉(zhuǎn)錄因子、上游轉(zhuǎn)錄因子和可誘導轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 啟動子啟動子(Promoter) 概念：啟動子是基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。概念：啟動子是基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。包括核心啟

3、動子和上游啟動子元件包括核心啟動子和上游啟動子元件 。 一個基因可同時擁有一個及以上啟動子；一個基因可同時擁有一個及以上啟動子； 一般在轉(zhuǎn)錄起始點上游一般在轉(zhuǎn)錄起始點上游, 位于位于(+1)及及5端上游端上游100200b左右，是決定轉(zhuǎn)錄起始點及轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵左右，是決定轉(zhuǎn)錄起始點及轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元素。元素。 ； 可與增強子共同控制轉(zhuǎn)錄起始和強度；可與增強子共同控制轉(zhuǎn)錄起始和強度； 發(fā)揮功能時除需發(fā)揮功能時除需RNA聚合酶外，還需轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子聚合酶外，還需轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用。與啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用。 1.核心啟動子：RNA pol轉(zhuǎn)錄起始所必須的最少的DNA序列

4、，作用是確定轉(zhuǎn)錄起始點并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄。 2.上游啟動子元件 包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始轉(zhuǎn)錄點更遠的上游元件。 與TFD結(jié)合成復合物后提高轉(zhuǎn)錄頻率。啟動子的研究方法啟動子的研究方法研究內(nèi)容研究內(nèi)容：1、 轉(zhuǎn)錄起始位點的確定轉(zhuǎn)錄起始位點的確定2 2、啟動子區(qū)域（、啟動子區(qū)域（順式作用元件順式作用元件）的確定）的確定3 3、轉(zhuǎn)錄因子（、轉(zhuǎn)錄因子（反式作用元件反式作用元件）結(jié)合位點的確定）結(jié)合位點的確定4 4、反式作用元件和順式作用元件相互作用、反式作用元件和順式作用元件相互作用對基因轉(zhuǎn)錄的影響對基因轉(zhuǎn)錄的影響1、轉(zhuǎn)錄起始位點（轉(zhuǎn)錄起始位點（TSSTSS）的確定）的確定生物信息

5、學預(yù)測生物信息學預(yù)測TSS5 -RACE初步確定初步確定TSS的大概位置的大概位置引物延伸、核酸酶保護或引物延伸、核酸酶保護或S1作圖精確定位作圖精確定位TSS推薦使用推薦使用Gene2Promoter 軟件（軟件（ http:/www.genomatix.de） 和和TSSW、TSSG（http:/ （ http:/www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot ）/FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion)GeneRacer RLM-RACE Kit (Invitrogen )SMART RACE cDNA Amplification (Clontech)

6、 Primer extension(引物延伸)S1 nuclease mappingRNA 5DNA 3*53RNA 5DNA 353PAGE AnalysisAdd S1 nucleasePrimer extension and S1 nuclease digestion2 2、啟動子區(qū)域的確定、啟動子區(qū)域的確定生物信息學預(yù)測啟動子區(qū)域生物信息學預(yù)測啟動子區(qū)域缺失突變?nèi)笔蛔?熒光素酶活性分析熒光素酶活性分析克隆克隆5 -flanking sequence并連接到報告基因載體上并連接到報告基因載體上確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（啟動子區(qū)域）確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（啟動子區(qū)域）3 3、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的確定、轉(zhuǎn)

7、錄因子結(jié)合位點的確定(1)生物信息學預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點生物信息學預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(2)實驗證實轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點：實驗證實轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點：EMSA/gel-shift, super shiftChIPDNase I footprinting 推薦使用推薦使用MatInspector 軟件軟件（ http:/www.genomatix.de）Mapper /mapper/mapper-topJaspar http:/ for evolutionary conserved transcription factor binding sites. nrVist

8、a 2.0 (/)nConSite (http:/ )Gel retardation(凝膠阻滯凝膠阻滯)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 電泳遷移率變動分析電泳遷移率變動分析) ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀（染色質(zhì)免疫共沉淀）4 4、反式元件與順式元件的相互作用對轉(zhuǎn)錄、反式元件與順式元件的相互作用對轉(zhuǎn)錄的影響的影響（1）定點突變）定點突變熒光素酶活性分析熒光素酶活性分析（2）過表達轉(zhuǎn)錄因子）過表達轉(zhuǎn)錄因子測定目的基因的表達測定目的基因的表達（3）干擾轉(zhuǎn)錄因子的表達）干擾轉(zhuǎn)錄因子的表達測定目的基因的

9、表達測定目的基因的表達（4）轉(zhuǎn)基因動物）轉(zhuǎn)基因動物定點突變定點突變增強子（增強子（enhancer） r基因組中能增強鄰近基因啟動轉(zhuǎn)錄的序列。最早基因組中能增強鄰近基因啟動轉(zhuǎn)錄的序列。最早發(fā)現(xiàn)于發(fā)現(xiàn)于SV40的基因上游，含的基因上游，含2個個72bp的正向重復的正向重復序列。序列。r增強子特性增強子特性 1.增強效應(yīng)非常明顯增強效應(yīng)非常明顯 10200倍倍 。 2.與其位置、取向無關(guān)（上下游、距離）與其位置、取向無關(guān)（上下游、距離） 3.核心序列是重復序列核心序列是重復序列,是增強效應(yīng)所必須是增強效應(yīng)所必須 4.有細胞組織特異性，有細胞組織特異性， 需與特異蛋白因子作用需與特異蛋白因子作用 5

10、.無基因特異性無基因特異性 6. 要有啟動子才能發(fā)揮作用要有啟動子才能發(fā)揮作用Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557Models for Enhancer Action consists of several good binding sites of TFs the sites are spatially clustered together the pattern of sites is conservedCharacterization of an enhancer?Enhancer Element Locator http:/

11、www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/ Assays for EnhancersTransient transfectionDNAase I hypersensitivityDNAase I footprinting/mutation analysisTransgenic miceTransient Transfection:PLuciferaseEPLuciferaseEPLuciferase Insulator (絕緣子) 一種負調(diào)控元件，參與基因表達的負調(diào)控。一種負調(diào)控元件，參與基因表達的負調(diào)控。干擾增強子與啟動子的相互作用，并抑干擾增強子與啟動子的相互作用，并抑

12、制啟動子的激活活性。制啟動子的激活活性。3.7Insulator function in ImprintingTwo linked Imprinted Genes:Maternal H19 (on), Igf2 (off) Paternal H19 (off), Igf2 (on)H19Igf2Effects of insulators on enhancerpromoter interactionsnCTCFBSDB: a CTCF binding site database for characterization of vertebrate genomic insulators : /CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows enhancer-blocking activity CTCF vs. BORISnCTCFn11個與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域 n與絕大多數(shù)的ICRs以及CpG島結(jié)合 n結(jié)合是甲基化敏感的n具有絕