1、南京曉莊學(xué)院食堂菜品及檢測方案 張紅琳 王蓉蓉 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院一、 檢測目的 食堂菜品及餐具檢測的目的是保證是其安全，并確保全校師生吃上安全可口的飯菜，預(yù)防食品中毒事件發(fā)生！二、 檢測對象 南京曉莊學(xué)院南、北兩個食堂的菜品及餐具 。三、 檢測團(tuán)隊 南京曉莊學(xué)院食堂安全檢測小團(tuán)隊 （由食品科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)專業(yè)的大四、三、二、一年級的學(xué)生組成，指導(dǎo)教師 張紅琳 王蓉蓉 ）定期對食堂菜品及餐具進(jìn)行檢測。 為保證檢測工作下去 ，每年招新，從我院學(xué)生中選拔優(yōu)秀的學(xué)生進(jìn)入團(tuán)隊 。 目前團(tuán)隊分工如下：人員安排：鮑春根負(fù)責(zé)微生物方面實驗，小組成員黃俊楠、劉甜甜、徐福飛覃潔琪負(fù)責(zé)食品農(nóng)藥殘留，小組成員

2、馮翔宇、鄭穎、甘可凡吳穎鋒負(fù)責(zé)重金屬檢測，小組成員吳子凡、莊寧、付雨雨四、 檢測內(nèi)容 1、微生物的檢測 食品微生物污染是食品腐敗變質(zhì)，引起食物中毒的主要原因，因此是我們檢測工作的重點 。我們主要對餐具與菜品（熟食）進(jìn)行檢測。1.1 餐具檢測 餐具清潔與否，影響者食品安全。為了檢測餐具是否消毒徹底，我們選用大腸桿菌檢測試紙片來檢驗其是否超標(biāo)，如超標(biāo)說明消毒不徹底 。 1.2菜品微生物檢驗 我國衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù)，大腸菌群和致病菌三項。1.2.1菌落總數(shù)的測定我們采用國家標(biāo)準(zhǔn)介紹的方法檢驗菜品中的大腸桿菌 ，所得結(jié)果參照國家標(biāo)準(zhǔn)判定是否超標(biāo)。采用平板菌落計數(shù)法：以無菌操作將檢樣2

3、5g剪碎，放于含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶中，經(jīng)充分震蕩制成1:10的均勻稀釋液。用1mL滅菌吸管取1:10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的滅菌試管中，震蕩搖勻制成1:100的稀釋液。依次類推，做出一個梯度的稀釋液。選擇23個適宜稀釋度，移取1mL稀釋于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。移入平皿后及時將涼至46的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入滅菌平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入空白滅菌平皿中做空白對照。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板置于36恒溫箱中培養(yǎng)48h，取出計算平板內(nèi)菌落總數(shù)數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升樣品中菌落總數(shù)。根據(jù)GB 4789-2010普

4、通食品中菌落含量不能超過3000cfu/g(ml)。實驗材料：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱取2.5g瓊脂粉，9g蛋白胨粉，一起放在燒杯中溶解，移至容量瓶定容至250ml。搖勻后，移至250ml錐形瓶中，用報紙封好。無菌生理鹽水的制備：稱取2.25g氯化鈉固體，溶解定容至250ml容量瓶中。搖勻后，移取9ml至25ml錐形瓶中，報紙封好。另取225ml至250ml錐形瓶中，用報紙封好。實驗儀器：無菌操凈臺和恒溫培養(yǎng)箱1.2.2、大腸菌落的檢測采用快速試紙片法樣品制備：以無菌操作將檢樣25g剪碎，放于含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶中，經(jīng)充分震蕩制成1:10的均勻稀釋液。再制作一個1:100的均

5、勻稀釋液。通常飲料和飲用水采用原液和1:10兩個稀釋度，其他食品采用1:10和1:100兩個稀釋度。檢測：快速檢驗紙片每份由3片大紙片和6片小紙片組成，用10mL滅菌吸管吸取10ML原液或者第一稀釋度的稀釋液加入含有大紙片的塑料帶中，吸透后平放做三個重復(fù)；然后再用1ml滅菌吸管吸取1ml同一稀釋度的稀釋液涂布到含有小紙片的塑料袋中，做3個重復(fù)；然后再取一支1ml滅菌吸管吸取1ml第二個稀釋度的稀釋液涂布到含有小紙片的塑料袋中，做三個重復(fù)。結(jié)果判定：將接種好的紙片放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)1524h，若紙片變黃或者在黃色背景上呈現(xiàn)紅色斑點為大腸桿菌陽性紙片，紙片保持紫藍(lán)色不變或在紫藍(lán)色背景上呈現(xiàn)紅色斑點

6、，但周圍沒有黃色則均為大腸菌落陰性紙片，記錄每個稀釋度大腸菌落陽性紙片數(shù)，根據(jù)大腸桿菌MPN表查出相應(yīng)的大腸菌落數(shù)。（原液的菌落數(shù)在查出的結(jié)果數(shù)除以10）實驗材料：試管，采樣瓶，試紙片實驗儀器：無菌操凈臺，恒溫培養(yǎng)箱。1.2.3、常見致病菌的檢驗（以沙門氏菌為例） 采用快速試紙片法：沙門氏菌的檢驗（沙門氏菌測試紙片法）：以無菌操作將檢樣25g剪碎，放于含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶中，經(jīng)充分震蕩制成1:10的均勻稀釋液。將測試片水平放在臺面上，揭開上蓋膜，用滅菌吸管吸取稀釋液0.5ml，均勻加到吸水濾紙上，然后輕輕將蓋膜放下。將加了樣的測試片平放在37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1524h。對測試紙進(jìn)

7、行觀察，呈紫紅色的菌落為沙門氏菌。1.2.4 季節(jié)性致病菌檢測 食源性疾病多發(fā)生在夏秋季節(jié)，在這兩個季節(jié)增加菌痢、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的檢測。1.3 菜品中農(nóng)藥的檢測主要檢測食堂里的原材料如大米、蔬菜等的檢測。采用快速試劑盒檢測：1.3.1 準(zhǔn)備工作.農(nóng)殘緩沖試劑+500ML試劑瓶（一袋）+少量蒸餾水，搖勻 +蒸餾水至500ML刻度線，搖勻備用（可在室溫中存放）顯色劑滴瓶中+5ML農(nóng)殘緩沖液 + 搖勻備用底物滴瓶中+5ML蒸餾水/純凈水（搖勻） 0-4攝氏度冷藏備用酶試劑瓶中的酶轉(zhuǎn)移酶試劑專用瓶中1.3.2 取樣工作A 、稱取2g菜樣：墊紙剪取將樣品剪為長寬約1CM小塊B、放入樣品提取瓶中

8、C、加入8ML農(nóng)殘緩沖液震蕩提取，靜置兩分鐘 1.3.3樣品檢測 根據(jù)試劑盒操作說明認(rèn)真操作，進(jìn)行檢測工作抑制率(%)= ( A0 - At ) / A0 × 100式中： A0 對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值； At 樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值。1.3.4 結(jié)果判定結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率50%時，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。 酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限農(nóng)藥名稱檢出限/（mg/kg）農(nóng)藥名稱檢出限/（mg/kg）敵敵畏0.1氧化樂果0.8對硫辛1.0甲基異柳

9、磷5.0硫磷磷0.3滅多威0.1甲胺磷2.0丁硫克百威0.05馬拉硫磷4.0敵百蟲0.2樂果3.0呋喃丹0.05符合率：在檢出的抑制率50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。1.4 大米中重金屬Cu、Pb、Cd含量的快速檢測 傳統(tǒng)的檢測技術(shù)在應(yīng)對頻發(fā)的食品安全問題時愈發(fā)凸顯其繁瑣、耗時、不易現(xiàn)場操作的一些缺陷。而ELISA試劑盒作為一種快速、可靠的檢測方法，其應(yīng)用解決了傳統(tǒng)檢測的一些缺陷。 因此，在檢測我校食堂大米中的重金屬含量時，采用ELISA試劑盒來檢測。實驗內(nèi)容：1.4.1 樣品及其制備 將從食堂采集的大米樣品直接干磨至粉末狀，儲存于密封盒內(nèi)常溫下保存

10、備用。 1.4.2 樣品的前處理用電子天平稱取大米樣品1份，2.000左右，至于10ml離心管中，加入4.0mL的2M的稀HCl，置漩渦混合器上振蕩30s于25下反應(yīng)20min，4000rpm下離心15min，取上清液于2ml離心管中，13000rpm下離心10min，取上清液2ml。1.4.3 ELISA測定樣品的方法 用少量4.0 M Na OH溶液調(diào)整樣品的p H值，加入螯合劑后，進(jìn)行如下操作：1) 將將系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)處理樣品分別加入到已經(jīng)包被有檢測抗原的板孔中（50 L/孔），并標(biāo)記。每標(biāo)準(zhǔn)品濃度設(shè)三孔平行，樣品設(shè)四孔平行。2) 加入抗體工作液50 L/孔，輕輕振蕩混勻，加蓋

11、板膜后置于37避光環(huán)境中，反應(yīng)30 min。3) 洗板，小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300 L /孔充分洗滌45次，每次間隔3 min，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。4) 加酶標(biāo)二抗100 L/孔，輕輕振蕩混勻，加蓋板膜后置37避光環(huán)境中反應(yīng)30 min后，洗板。5) 顯色，依次加入TMB底物A液與底物B液各50 L于微孔中，振蕩混勻。室溫避光環(huán)境中反應(yīng)10 min。6) 測定，每孔中加入50 L終止液（2.0 M 硫酸溶液），輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀于450 nm 處測定每孔OD 值。7) 按公式（1）計算重金屬離子對抗體的抑制率I以重金屬濃度對數(shù)為橫軸，抑制率為縱軸，繪制重金屬濃度抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線，依此曲線計算樣品中重金屬的濃度。 根據(jù)GB 2715-2005 糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定鉛不超過0.2mg/kg、鎘不超過0.2mg/kg、汞不超過0.02mg/kg、砷不超過0.15mg/kg實驗儀器與設(shè)備電子天平、高速離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、漩渦混合器、酶標(biāo)儀、超純水、5ml、1001000l移液槍 實驗試劑銅標(biāo)準(zhǔn)溶液、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃鹽酸、磷酸二氫銨、氫氧化鈉、四甲基聯(lián)苯胺TMB、羊抗鼠IgG-HRP、磷酸緩沖液（PBS）五、 檢測頻率 對于微生物檢測