質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化Word版_第1頁
質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化Word版_第2頁
質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化Word版_第3頁
質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化Word版_第4頁
質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化Word版_第5頁
已閱讀5頁,還剩3頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、一實驗名稱:質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化二實驗?zāi)康模簩⒕幋a目的蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi),從而大量擴增并表達目的蛋白三實驗原理:轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)化所用的受體細(xì)胞一般是限制 - 修飾系統(tǒng)缺陷變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶( R- , M- )。將對數(shù)生長期的細(xì)菌(受體細(xì)胞)經(jīng)理化方法處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變,成為能允許外源 DNA 分子進入的感受態(tài)細(xì)胞。進入受體細(xì)胞的 DNA 分子通過復(fù)制和表達實現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化子(帶有異源 DNA 分子的細(xì)胞)四實驗步

2、驟;1.把固態(tài)培養(yǎng)基加熱融化,由于溫度較熱用自來水沖洗瓶身降溫(十度左右會再凝固,所以不能沖洗太久),在超凈臺中加入千分子一的AP(本質(zhì)粒具有抗AP性,故AP能抑制別的細(xì)菌生長),然后向平皿中倒入少許(大約5毫升)培養(yǎng)基,表明自己名字2.到-80冰箱取出質(zhì)粒(每瓶100微升,可制作兩板)迅速放入冰盤保存,放入4保存30min3.將上述混合物放在42水浴鍋中融化90s(據(jù)經(jīng)驗42度90s最適合),在超凈臺中用針尖沾取少許質(zhì)粒放入大腸桿菌EP管內(nèi)(質(zhì)粒為提純多的所以加很少,一般未提純的加1微升),再加200微升無抗培養(yǎng)基,加完后放回冰盤(熱:壁通透性大,冷:通透性小,起封閉作用)放入搖床15min

3、。4. 搖完后用微量加樣槍析出滴到制作好的培養(yǎng)皿的中央,然后慢慢鋪滿平皿底部(千萬不能滑到邊緣,由于量比較少,滑到邊緣就不容易再鋪),表明細(xì)菌名稱,實驗時間,放入4溫箱隔夜保存5.觀察有稀疏斑點狀菌落,從4度冰箱取出培養(yǎng)基,在超凈臺中,取四支帶帽試管(表有黃線者為抗AP)分別倒入培養(yǎng)基至黃線處;用過火的鑷子夾取黃槍尖(槍尖過火要快以防燒焦)按象限沾取菌落一枚,放入試管中,注意整個過程要過火。6.將試管放入搖床中,未完待續(xù)五實驗結(jié)果:六注意事項:1.培養(yǎng)基溶解后沖洗降溫不要太久以免再凝固2.取質(zhì)粒盡可能的一直放入冰盒3.42度90s 4.鋪板要勻!【原理】轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞

4、,使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)化所用的受體細(xì)胞一般是限制 - 修飾系統(tǒng)缺陷變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶( R- , M- )。將對數(shù)生長期的細(xì)菌(受體細(xì)胞)經(jīng)理化方法處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變,成為能允許外源 DNA 分子進入的感受態(tài)細(xì)胞。進入受體細(xì)胞的 DNA 分子通過復(fù)制和表達實現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化子(帶有異源 DNA 分子的細(xì)胞)。本實驗采用 CaCl2 法制備感受態(tài)細(xì)胞。其原理是細(xì)胞處于 0 4 , CaCl2 低滲溶液中,大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶

5、的羥基 - 鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng) 42 90 秒熱激處理,促進細(xì)胞吸收 DNA 得合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間,促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型,如氨芐青霉素耐藥( Amp r )得到表達,然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含 Amp 的選擇性培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)過夜,即可獲得細(xì)菌菌落。本實驗是將人 Bcl-2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5 擴增菌,轉(zhuǎn)化后在含 Amp 的培養(yǎng)基上進行篩選,生長的菌落即為含重組質(zhì)粒的工程菌。含人 Bcl-2 重組質(zhì)粒的 DH5 菌用于質(zhì)粒 DNA 的擴增,獲得的質(zhì)粒將作為限制性內(nèi)切酶的酶切底物 DNA ?!驹噭┡c器材】1 LB 液體培養(yǎng)基 10g 胰蛋白胨、

6、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ,高壓滅菌消毒。2 LB 固體培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基中加 1.5% 瓊脂粉,高壓滅菌消毒,待泠卻至不燙手背時鋪培養(yǎng)皿。3 0.1mol/L CaCl2 高壓滅菌消毒或過濾除菌。4 氨芐青霉素 用無菌水或生理鹽水配制成 100mg/ml 溶液,置 -20 保存。5 人 Bcl-2 重組質(zhì)粒 它是 Eco R 單酶切的 pBluescript KS(-) 載體與 EcoR 單酶切的人 Bcl-2 cDNA 重組而成的,大小為 4 861bp ,前者是一種由 pUC19 質(zhì)粒衍生而來的具有 2 961bp 的質(zhì)粒載體。因此用 Eco R 酶切則應(yīng)

7、到空載 pBluescript KS(-) 載體 (2.96kb) 和人 Bcl-2 cDNA 片段 (1.9kb) 。配制成 2g/1 l 。6 大腸桿菌 DH5 此為 DNA 擴增菌7 恒溫水浴箱8 超凈工作臺9 高速冷凍離心機10 恒溫?fù)u床11 恒溫箱12 消毒離心管13 消毒 tips14 玻璃培養(yǎng)皿 直徑 90mm15 玻璃涂布器16 95% 乙醇17 標(biāo)記筆【操作步驟】1 細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備將 DH5 菌種劃線于 LB 瓊脂板上, 37 培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于 5ml LB 培養(yǎng)基中, 37 振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。次日取菌液 1ml 接種至含有 100ml LB 培養(yǎng)基的燒瓶中,

8、 37 劇烈振蕩培養(yǎng)至約 2 3h ,待 A 600 值達到 0.3 0.4 時將燒瓶置于冰浴 10 15min 。將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個滅菌處理過的冰預(yù)冷的 50ml 離心管中。 4 000 × g , 4 離心 10min ,棄培養(yǎng)基,將管倒置于濾紙使最后的殘留液體流盡。加預(yù)冷的已過濾除菌的 0.1mol/L CaCl2 重懸菌體,置冰浴 30min 。 4 000 × g , 4 離心 10min ,棄培養(yǎng)基。再加 4ml 預(yù)冷的 0.1mol/L CaCl2 ,輕輕重懸菌體,置 4 冰箱 12 16h 。2 DNA 重組子的轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 本實驗中的 DNA 重組子為人 Bcl-2 重組質(zhì)粒。在無菌條件下按每管取 200 l 新鮮感受態(tài) DH5 細(xì)菌置于無菌的 5ml 塑料離心管中,共 2 管,分別加入人 Bcl-2 重組質(zhì)粒 (10ng) 和消毒水 ( 作陰性對照 ) 各 5 l ,輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物,在冰上放置 30min 。 42 ,熱休克 90s ,中途不要搖動離心管,每管加 800 l 無抗生素的 LB 培養(yǎng)基,于 37 空氣搖床中以 150 r/min 速度振搖 45min ,使細(xì)菌復(fù)蘇。每管取 200 l 加至含氨芐青霉素( Amp )的 LB 瓊脂平板

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論