1、    成骨細(xì)胞在金黃色葡萄球菌感染后的細(xì)胞因子表達(dá)        【摘要】目的探討成骨細(xì)胞在金黃色葡萄球菌感 染后細(xì)胞因子的產(chǎn)生情況。方法半對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金葡菌6571為實(shí)驗(yàn)用 菌株。成骨細(xì)胞培養(yǎng)自健康成人下頜第三磨牙拔除術(shù)中新鮮去骨塊。實(shí)驗(yàn)組以MOI為30的比 例感染成骨細(xì)胞2小時(shí)；對(duì)照組未加細(xì)菌。在0，2，4，8，12，24，48，72小時(shí)收集培養(yǎng)液 ，用ELISA方法測(cè)定樣本中TNF-、IL-1、IL-6、IL-8濃度。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未見TNF-、IL-1表達(dá)。實(shí)驗(yàn)

2、組各時(shí)間點(diǎn)IL-6、IL-8濃度明顯高于對(duì) 照組。結(jié)論成骨細(xì)胞在受金葡菌感染后TNF-、IL-1、IL-6、IL -8表達(dá)上的變化可能有利于機(jī)體對(duì)骨組織金葡菌感染的清除。成骨細(xì)胞可能是減輕金葡菌骨 髓炎的重要細(xì)胞成份?！娟P(guān)鍵詞】成骨細(xì)胞金黃色葡萄球菌細(xì)胞因子 Cytokine expression in Staphylococcus aureus-infected human osteoblas tsGUO Chuanbin（School of Stomatology,Beijing Medical University,B eijing 100081）【Abstract】ObjectiveC

3、ytokine expressions in Staph ylococcus aureus-infected human osteoblasts were studied.MethodsMid-logarithmic growing Staphylococcus aureus 6571 was prepared.Human os toblasts were cultured from bone explants.Osteoblasts of experimental group were infected by Staphylococcus aureus at MOI 30 for 2 hou

4、rs.Control group received the same treatment as the experimental group except adding of Staphylococcus aur eus.Supernatants were collected at different time points.TNF-、IL-1、IL-6 an d IL-8 proteins were assayed by ELISA.ResultsNeither of the two groups had TNF- and IL-1 detected.Osteoblasts of the e

5、xperimental gr oup produced much more IL-6 and IL-8 than those of the control group. ConclusionChanges of TNF-、IL-1、IL-6 and IL-8 production in os teoblasts after being infected by Staphylococcus aureus may benefit the removal of Staphylococcus aureus from bone tissue,and osteoblasts are important c

6、ells to fight against osteomyelitis caused by Staphylococcus aureus.【Key words】OsteoblastsStaphylococcus aureus Cytokine金黃色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要來源，約 有65%70%的骨髓炎由金黃色葡萄球菌引起1，2。在骨組織中成骨細(xì)胞是最重要 的功能細(xì)胞，它不但負(fù)責(zé)骨的形成同時(shí)還接受處理骨吸收信號(hào)，對(duì)破骨細(xì)胞的活動(dòng)有直接作 用3。我們?cè)x擇成骨細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，探討它與金葡菌的相互作用。通過研 究證實(shí)，成骨細(xì)胞在體外能攝入金葡菌，或/和為金葡菌所侵入4。這個(gè)發(fā)現(xiàn)

7、無疑 為金葡菌感染骨組織提供了細(xì)胞水平證據(jù)，同時(shí)也為今后的進(jìn)一步研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基 礎(chǔ)。本文將對(duì)成骨細(xì)胞在金葡菌感染后細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化作一初步探討。材料和方法細(xì)菌培養(yǎng)：選擇本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株6571用于實(shí)驗(yàn)。該菌株保存 在Wilkins-Chalgren瓊脂上，于實(shí)驗(yàn)開始前2.5小時(shí)在Wilkins-Chalgren液體培養(yǎng)基內(nèi) 培養(yǎng)，并讓其生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取半對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌用于實(shí)驗(yàn)，并用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì) 菌濃度。細(xì)胞經(jīng)200×g離心10分鐘，去上清液，用培養(yǎng)液DMEM(GIBCOL公司)混勻。成骨細(xì)胞培養(yǎng)：人成骨細(xì)胞培養(yǎng)自健康成人阻生齒拔除手術(shù)中的去骨塊。成骨

8、細(xì)胞培養(yǎng)方法 同Beresford等所采用的方法5。將骨塊上骨膜及纖維性組織完全剔除，剪成直徑 3mm5mm的細(xì)塊，用PBS洗去骨髓組織及積血，然后置入75cm3培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入DMEM培養(yǎng)液 (GIBCOL公司)。培養(yǎng)液含25mM Hepes,100單位/ml-100微克/ml的青-鏈霉素，10%胎牛血清和 2mM L-谷氨酰胺。細(xì)胞在37、95%空氣-5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。一旦細(xì)胞匯合，即取樣用白 細(xì)胞堿性磷酸酶試劑盒(Sigma)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色。隨機(jī)觀察100個(gè)細(xì)胞，堿性磷酸 酶染色陽性率大于80%的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)，取原代成骨細(xì)胞用于侵入實(shí)驗(yàn)。成骨細(xì)胞感染：將成骨細(xì)胞用0

9、.05%胰蛋白酶(GIBCOL公司)處理后，計(jì)數(shù)，按每孔2×10 5個(gè)細(xì)胞密度加入6孔培養(yǎng)板中過夜。次日晨于實(shí)驗(yàn)開始前更換新DMEM(含0.5%胎牛血 清，余同上述DMEM)。用上述準(zhǔn)備好的細(xì)菌以MOI為30的比例加入(1個(gè)細(xì)胞比30個(gè)細(xì)菌)后置 于搖擺器上，在37環(huán)境中孵育2小時(shí)。2小時(shí)后用PBS洗滌成骨細(xì)胞2次，然后實(shí)驗(yàn)組每孔加 入每毫升含100微克慶大霉素(Sigma)的DMEM(含0.5%胎牛血清)2毫升，以殺滅細(xì)胞外殘 余細(xì)菌，繼續(xù)在37環(huán)境中培養(yǎng)。分別在0、2、4、8、12、24、48、72小時(shí)收集培養(yǎng)液。樣 本保存在-20冰箱中備用。對(duì)照組不加入金葡菌，陽性對(duì)照用10g

10、/ml脂多糖(Sigma)刺激 成骨細(xì)胞，余同實(shí)驗(yàn)組。以上實(shí)驗(yàn)分三份進(jìn)行，并重復(fù)三次。細(xì)胞因子測(cè)定：用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測(cè)定樣本的TNF-、IL-1、IL-6、IL-8濃度 。ELISA試劑由倫敦大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提供。操作按說明進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：t檢驗(yàn)。結(jié)果在三次實(shí)驗(yàn)中所有的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本均未見TNF-和IL-1表達(dá)。陽性對(duì)照 組均可見TNF-、IL-1、IL-6、IL-8表達(dá)(1)。兩組成骨細(xì)胞IL-6和IL-8各時(shí)間點(diǎn)濃度 詳見表1、表2。1脂多糖陽性對(duì)照組細(xì)胞因子表達(dá)情況表1兩組IL-6分泌比較時(shí)間(h)IL-6(pg/ml)tP實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組000226.3±8.

11、705.240.01446.9±11.307.190.01848.0±14.518.6±51260.9±18.233.7±524125.6±46.740.7±15.32.990.0548420.4±60.478.0±14.49.550.00172434.6±66.181.5±20.38.840.05表2兩組IL-8分泌比較時(shí)間(h)IL-6(pg/ml)tP實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組000249.4±10.721.8±7.73.590.0

12、54114.7±20.630.5±18161.9±21.441.3±12.68.410.0112185.8±45.057.5±15.14.680.0124583.5±93.489.8±25.78.820.01481211.3±136.3123.9±28.913.520.001721249.6±151.8166.7±37.312.000.01從表1和表2的數(shù)據(jù)可見，實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)IL-6和IL-8的濃度明顯高 于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞在加入金葡菌后

13、2小時(shí)即有IL-6和IL-8分泌，此后逐步上升，于1 2小時(shí)后明顯升高，至48小時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)至72小時(shí)。對(duì)照組成骨細(xì)胞IL-6和IL-8分泌很少 ，隨時(shí)間推移略有增高。這種升高系成骨細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8累積的結(jié)果，并不表示有刺 激性增高。 討論細(xì)胞因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8是常見的炎癥介質(zhì)，在細(xì)菌性感染時(shí)可由 機(jī)體的許多細(xì)胞釋放。用金葡菌在體外感染內(nèi)皮細(xì)胞半小時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的TNF-、IL-1 、IL-8明顯升高6，7；在體內(nèi)感染動(dòng)物，血循環(huán)中TNF-、IL-1、IL-2、IL -6濃度上升8。Littlewood-Evans等1用金葡菌建立骨髓炎動(dòng)物模型， 在炎癥

14、新骨增生區(qū)TNF表達(dá)增加，且與炎癥程度成正比。本文根據(jù)成骨細(xì)胞能為金葡菌侵入 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果4，9，探討了成骨細(xì)胞在體外被金葡菌侵入后細(xì)胞因子產(chǎn)生的情況 ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞的IL-6和IL-8產(chǎn)生明顯增多；而IL-1和TNF無論是在實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照 組均無表達(dá)。因目前尚無對(duì)等研究可資對(duì)照(Medline文獻(xiàn)檢索至1998年8月)，我們僅對(duì)這一 初步研究發(fā)現(xiàn)作一力所能及的分析。Nair等10曾將金葡菌表面相關(guān)物質(zhì)和成骨細(xì) 胞系培養(yǎng)，結(jié)果沒有細(xì)胞因子產(chǎn)生。本文是將活金葡菌感染成骨細(xì)胞2小時(shí)后，慶大霉素殺 滅細(xì)胞外細(xì)菌，使培養(yǎng)液內(nèi)無金葡菌存在。慶大霉素因不能透過真核細(xì)胞膜11， 故能保證成骨細(xì)胞內(nèi)的金

15、葡菌不遭慶大霉素干擾。比較這兩個(gè)研究，作者推測(cè)，成骨細(xì)胞在 金葡菌感染后需有細(xì)菌的侵入才會(huì)增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Yao等7研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞在 與金葡菌作用后細(xì)胞因子表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌僅附著于內(nèi)皮細(xì)胞表面，內(nèi)皮細(xì)胞沒有明顯的細(xì) 胞因子產(chǎn)生；用細(xì)胞松弛素D抑制內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)金葡菌的攝入，則完全無細(xì)胞因子的mRNA表達(dá) 。這說明有些宿主細(xì)胞在遭到細(xì)菌感染時(shí)，需細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子。IL-1主要由激活的單核細(xì)胞釋放：TNF則主要由激活的巨噬細(xì)胞分泌。成骨細(xì)胞也能產(chǎn)生IL- 1和TNF1，3。這兩個(gè)細(xì)胞因子均能明顯抑制骨鈣素和膠原的合成，降低堿性磷酸 酶(ALP)活性，促使破骨細(xì)胞的骨吸收活性12。金

16、葡菌感染成骨細(xì)胞后，成骨細(xì) 胞不釋放IL-1和TNF對(duì)減少骨髓炎時(shí)骨吸收可能有益處，很可能是成骨細(xì)胞對(duì)金葡菌感染的 一種主動(dòng)抵抗，說明成骨細(xì)胞在骨髓炎中可能積極地參與機(jī)體對(duì)金葡菌的防御作用。實(shí)驗(yàn)組在IL-6和IL-8的產(chǎn)生上明顯高于對(duì)照組。IL-6是多能細(xì)胞因子，對(duì)骨組織有多重作用 。正常骨組織細(xì)胞在1，25Vit D、甲狀旁腺素、IL-1作用下可表達(dá)分泌IL-6。IL-6對(duì)破骨細(xì) 胞只起一定刺激作用，程度輕于IL-1和TNF3。IL-8又稱中性粒細(xì)胞激活蛋白，能 強(qiáng)力促進(jìn)中性粒細(xì)胞的更新，并促使其透過血管內(nèi)皮細(xì)胞層移至炎癥區(qū)。成骨細(xì)胞受金葡菌 感染IL-8產(chǎn)量明顯增高對(duì)誘使中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至骨

17、感染區(qū)可能有重要作用。這也說明了成骨 細(xì)胞在金葡菌感染骨組織時(shí)所起的積極作用。由于細(xì)胞因子的功能多樣性，各種細(xì)胞因子之間可相互刺激，作用交叉，要明確其在某一條 件下的真實(shí)作用需要做深入的研究。筆者認(rèn)為成骨細(xì)胞在體外受金葡菌感染后在細(xì)胞因子產(chǎn) 生上的變化，在總體上有利于機(jī)體對(duì)骨組織金葡菌感染的清除，成骨細(xì)胞可能是減輕金葡菌 骨髓炎的重要細(xì)胞成份。(致謝：本實(shí)驗(yàn)在英國(guó)倫敦Eastman口腔醫(yī)學(xué)研究所完成。感謝Sajeda、Nair講 師和Harris教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)的熱忱指導(dǎo)與幫助。)作者單位：郭傳?（北京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科100081）參考文獻(xiàn)1，Littlewood-Evans AJ,Ha

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