1、刺激試驗刺激試驗 刺激是不涉及免疫學機制的一次、多次或持續(xù)與試驗材料接觸所引起的局部炎癥反應。皮膚刺激試驗皮膚刺激試驗 評價材料在試驗條件下產(chǎn)生皮膚刺激反應的潛在性。 家兔為首選，預期無反應，可直接使用3家兔。試驗材料與儀器試驗材料與儀器 天平精度 0.01或0.1g 供試品稱量用精度 0.1或1mg 試劑稱量用精度 50g 試驗用兔稱量用兔固定裝置、手術剪刀、推子、游標卡尺、稱量瓶、吸管、移液管、包扎帶、醫(yī)用紗布、燒杯、壓力蒸汽滅菌器。試劑與器具滅菌試劑試劑 75%(V/V)乙醇、0.9氯化鈉注射液或其它規(guī)定的浸提介質。器具滅菌器具滅菌與供試品接觸的所有器具應采用可靠的方法滅菌，置壓力蒸汽滅

2、菌器內121恒溫20分鐘，或置電熱干燥箱內160干烤2h。試驗動物試驗動物 應使用清潔級健康、初成年的、未使用過的試驗用（新西蘭）兔，雌雄兼用, 同一品系,同一飼養(yǎng)條件，體重應不低于2kg。試驗用兔的抓取固定方法試驗用兔的抓取固定方法試驗用兔比較馴服不會咬人，但腳爪較尖應避免兔抓傷。進行刺激試驗時，只需將兔抓牢或按住即可，抓兔的方法是用右手把兩耳輕輕地拿在手心，抓住頸后部的皮厚處，提取兔，然后用左手托住臀部，使兔的體重大部分落在左手上，不能單提兩耳、捉拿四肢、提抓腰部和背部。預試驗預試驗試驗材料應使用1只動物進行初試。 如動物出現(xiàn)清晰紅斑或水腫時，不必再進行其他試驗。如試驗動物沒有出現(xiàn)清晰的紅

3、斑或水腫反應時,應至少再選用2只動物進行試驗。 試試 驗驗 步步 驟驟動物準備 試驗前一天, 將試驗用兔人工固定或固定到固定裝置上，然后把背部脊柱兩側的被毛用手術剪粗剪后再用推子小心的把被毛去除干凈(約10cm15cm區(qū)域),作為試驗和觀察部位。去毛過程應確保動物皮膚健康無損傷。試驗方法試驗前用75的(V/V)乙醇擦拭背部去毛區(qū)域，等變干后根據(jù)供試品的不同性狀選用不同的方法進行操作。粉劑或液體樣品 取0.5g或0.5mL的試驗材料，直接涂抹到剃毛皮膚部位。 粉劑使用前用少量的水制成糊狀，有利于涂抹。 用25mm25mm透氣性好的敷料敷貼涂抹樣品的皮膚部位, 然后敷料外層用紗布包裹，再用半封閉性

4、包扎帶固定敷料和紗布4h以上。接觸期結束后依次取下包扎帶、紗布及敷料, 對接觸部位進行標記,用溫水清洗并擦干。固體樣品研成粉末，試驗材料可用水充分濕化以保證與皮膚良好的接觸性。用25mm25mm的透氣性好的敷料塊覆蓋材料接觸部位, 然后敷料外層用紗布包裹，再用半封閉性包扎帶固定敷料和紗布4h以上，依次取下包扎帶、紗布及敷料, 對接觸部位進行標記,用溫水清洗并擦干。藥包材：鋁質軟膠管：取試樣5 支，向每支加入標示容量的0.9氯化鈉注射液，振蕩5分鐘后，合并提取液備用。一般材料：取平整部位表面積600cm2剪碎，加入氯化鈉注射液100mL，70放置24小時后取出冷卻備用。 0.9氯化鈉注射液及其浸

5、提液 將浸提液滴到25mm25mm的4層紗布塊上(每塊約0.5mL), 按下圖所示部位敷貼于動物背部兩側。將滴有0.9氯化鈉注射液的紗布塊敷貼在對照接觸部位。 然后敷料外層用紗布包裹，再用半封閉性包扎帶固定敷料和紗布4h以上，依次取下包扎帶、紗布及敷料, 對接觸部位進行標記,用溫水清洗并擦干。去毛的背部區(qū)域對照部位供試品部位供試品部位對照部位頭部尾部結果觀察 在除去敷貼物后1h、24h、48h和72h記錄各接觸部位情況。如存在持久性損傷有必要延長觀察時間, 以評價這種損傷的可逆性或不可逆性,但延長期不必超過14d。 按下表規(guī)定的分類系統(tǒng), 描述每一接觸部位在每一規(guī)定時間內皮膚紅斑和水腫反應情況

6、并評分, 記錄結果以出具試驗報告。反應 記 分 紅斑和焦痂形成 無紅斑 極輕微紅斑(勉強可見) 紅斑清晰 中度紅斑 重度紅斑(紫紅色) 至焦痂形成水腫形成 無水腫 極輕微水腫(勉強可見) 水腫清晰(腫起, 不超出區(qū)域邊緣) 中度水腫 (腫起約1mm)重度水腫(腫起超過1mm, 并超出接觸區(qū)) 0123401234 刺激最高記分 8 注: 記錄并報告皮膚部位的其他異常情況。 表14 觀察損傷情況及評分標準反應類型 平 均 記 分 極輕微輕度中度重度 0.0 0.4 0.5 1.92.0 4.95.0 8.0 表15皮膚刺激試驗結果評價結果評價按下列規(guī)定確定原發(fā)性刺激指數(shù)(PII)。 將每只動物在

7、每一規(guī)定時間試驗材料引起的紅斑與水腫的原發(fā)性刺激記分相加后再除以觀察總數(shù)(總數(shù)為6:2個計分類型和3個觀察期)。當用0.9氯化鈉注射液對照時，計算出對照原發(fā)性刺激記分，將試驗材料原發(fā)性刺激記分減去該記分，即得出每只動物原發(fā)性刺激記分。 使用24h、48h和72h的觀察數(shù)據(jù)進行計算。試驗之前或72h后的恢復觀察數(shù)據(jù)不用于計算。 每只動物的記分相加后除以動物總數(shù)即為原發(fā)性刺激指數(shù)。皮內刺激試驗皮內刺激試驗 簡述簡述評價材料通過皮內注射浸提液產(chǎn)生刺激反應的潛在性。 應排除的試驗材料應排除的試驗材料任何對皮膚、眼、粘膜組織有刺激的材料或產(chǎn)品, 如具有腐蝕性的強酸或強堿材料(pH2或11.5)不應再進行

8、本試驗。試驗材料與儀器試驗材料與儀器天平 精度 0.01或0.1g 供試品稱量用精度 0.1或1mg 試劑稱量用精度 50g 試驗用兔稱量用兔固定裝置、手術剪刀、推子、稱量瓶、吸管、移液管、注射器（2mL）、注射針（5、8）、燒杯、壓力蒸汽滅菌器。試劑試劑75%(V/V)乙醇、0.9氯化鈉注射液、植物油或其它規(guī)定的溶劑。器具滅菌器具滅菌與供試品接觸的所有器具應采用可靠的方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內121恒溫20分鐘，或置電熱干燥箱內160干烤2h。供試品制備供試品制備根據(jù)產(chǎn)品標準的規(guī)定制備供試品。試驗動物試驗動物應使用清潔級健康、初成年的、未使用過的試驗用（新西蘭）兔，雌雄兼用, 同一品系,同

9、一飼養(yǎng)條件 體重不低于2kg。預試驗預試驗試驗材料初試至少采用2只動物。初試反應如可疑或不明確, 應考慮進行復試。試驗步驟試驗步驟試驗前一天，將試驗用兔人工固定或固定到固定裝置上，然后把背部脊柱兩側的被毛用手術剪粗剪后再用推子小心的把被毛去除干凈(約10cm20cm區(qū)域),作為試驗和觀察部位。去毛過程應確保動物皮膚健康無損傷。試驗前用75的(V/V)乙醇擦拭背部去毛區(qū)域，等變干后再進行注射。在每只兔脊柱左側上面5個點(見下圖)用注射器皮內注射0.2mL0.9氯化鈉注射液制備的浸提供試液。在每只兔脊柱左側的下面五個點(見下圖) 用注射器皮內注射0.2mL 0.9氯化鈉注射液對照液。在每只兔的脊柱

10、右側上面五個點(見下圖2)用注射器注射0.2mL植物油制備的浸提供試液，右側下面五個點用注射器注射0.2mL植物油對照液。1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10101 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010注射0.2mL 0.9氯化鈉 注 射 液制 備 的 浸提供試液注射0.2mL 0.9氯化鈉 注 射 液對照液注射0.2mL植 物 油 制備 的 浸 提供試液注射0.2mL注 射 植 物油對照液頭尾注：有時我們應根據(jù)試驗材料的粘性選用不同規(guī)格的注射針頭做皮內注射。在不妨礙注射的前提下，應盡量選用小號針頭。 24小時觀察

11、結果觀察結果觀察 注射后即刻和24h、48h和72h后觀察記錄各注射部位狀況。 按下表給出的分類系統(tǒng)對每一觀察期各注射部位的紅斑（ER）和水腫(ED)的組織反應評分, 并記錄試驗結果。油類液體皮內注射常會引起炎癥反應。在72h觀察時, 可靜脈注射適宜的活體染料, 如臺盼藍或伊文思藍, 以顯示出刺激區(qū)域有助于反應評價。結果評價結果評價 按下列方法確定刺激指數(shù)。將每只動物在每一規(guī)定時間內每種浸提液出現(xiàn)的紅斑與水腫的刺激記分相加,再除以觀察總數(shù)為試驗材料刺激記分。對試劑對照注射部位也同樣評價。將試驗材料刺激記分減去試劑對照的記分得出每只動物刺激記分, 用于計算刺激指數(shù)。注: 記錄并報告注射部位的其他異常情況反 應記 分 紅斑和焦痂形成 無紅斑 極輕微紅斑(勉強可見) 清晰紅斑 中度紅斑 重度紅斑(紫紅色) 至焦痂形成水腫形成 無水腫 極輕微水腫(勉強可見) 清晰水腫 (腫起, 不超出區(qū)域邊緣) 中度水腫(腫起約1mm) 重度水腫(腫起超過1mm, 并超出接觸區(qū)) 0123401234刺激最高記分 8注: 記錄并報告注射部位的其他異常情況。 表1