1、重組人leptin的表達(dá).純化及免疫學(xué)與生物學(xué)活性鑒定張玨，王曉輝，馮澤國(guó)(解放軍總醫(yī)院麻醉手術(shù)中心 北京100853)【摘耍】目的：為了獲得重組人leptin (rh-leptin)蛋白高表達(dá)的菌株及大量具有生物活 性的rh-leptin蛋白,構(gòu)建leptin重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行表達(dá),對(duì)rh-leptin 蛋白進(jìn)行復(fù)性及純化，并鑒定其免疫學(xué)及生物學(xué)活性。方法：提取脂肪組織rna,rt-pcr方法獲得用pcr方法擴(kuò)增人leptin的編碼區(qū)，使產(chǎn)物與pgem-t easy載體相連，轉(zhuǎn)染dh5 « o測(cè)序后，選出陽(yáng)性克隆質(zhì)粒擴(kuò)增。將酶切后的leptin片段與pet-28a(+

2、)載體連接，獲 得leptin的表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入bl21 (de3)，測(cè)序結(jié)果顯示leptin編碼區(qū)沒(méi)有 突變產(chǎn)生，用tptg誘導(dǎo)leptin重組蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行sds-page電泳& western印 跡雜交進(jìn)行免疫學(xué)分析。并通過(guò)km小鼠減肥實(shí)驗(yàn)及胃腸推進(jìn)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其生物學(xué)活性。 結(jié)果：在包涵體蛋白22 kda處有明顯的新增蛋白帶，其含量超過(guò)總蛋白的50%；經(jīng) western-blot證實(shí)為重組的人leptin蛋口。大量表達(dá)后，經(jīng)蛋口復(fù)性和純化，通過(guò)km小 鼠減肥實(shí)驗(yàn)及胃腸推進(jìn)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組表達(dá)的人leptin蛋白具有生物學(xué)活性。結(jié)論： 成功構(gòu)建了 rh l

3、eptin的高表達(dá)菌株，建立了 rh leptin的純化與復(fù)性方法，經(jīng)驗(yàn)證表達(dá) 產(chǎn)物具有免疫學(xué)及生物學(xué)活性，可供進(jìn)一步基礎(chǔ)及臨床研究應(yīng)用?！娟P(guān)鍵詞】rh leptin；克隆；表達(dá)；融合蛋白；大腸桿菌；復(fù)性；蛋白純化；生物活性expression, purification and identification for immunological andbiological activity of recombined human leptinabstractobjective: to obtain effective method of high recombined human leptin

4、 (rh-leptin) expression in e. coli and the method of purifying and renaturing the rh-leption protein, then to obtain a large amount of rh-leptin protein with immunological and biological activity for further research. methods: the adipose leptin cds was obtained by reverse transcription-polymerase c

5、hain reaction (rt-pcr) and cloned by pcr, and the product was connected with pgem-t easy and transformed into dh5 a after dna sequencing, the positive colonies were picked out and amplified. the cleaved leptin fragment was cloned into pet-28a(+).then, the recombined plasmid of leptin was transformed

6、 into bl21(de3). dna sequencing result showed that no mutation was found in rh-leptin' s cds. after iptg induction, the cell lysate was directly used for sds-page. after purification and renaturation, the immunological activity of rh-leptin was checked by western-blot. its biological activity wa

7、s checked by reducing the weight and food intake and inhibiting the gastrointestinal motility of km mice results: there was a new band of protein (> 50 % total protein) around 22 kda on sds-page. the band was proved by western-blot to be rh-leptin, which was highly expressed in the bl21(de3)/ pet

8、-28a(+) system , and the rh-leptin has immunological activity. its biological activity was confirmed by reducing the weight and food intake and inhibiting the gastrointestinal motility of km mice. conclusion: highly expressed rh-lcptin can be obtained in our lab. purified rh-lcptin with immunologica

9、l and biological activity may be used in further research.key words: cloning; expression; fusion protein; e. coli rh-leptin; renaturation; protein purification; biological activityleptin (瘦素或消脂素)是ob基因編碼的活性蛋白分子，主要由脂肪細(xì)胞產(chǎn) 生，在調(diào)節(jié)機(jī)體攝食和能量代謝中發(fā)揮著主要作用。近年來(lái)，臨床實(shí)驗(yàn)表明，血 清leptin水平異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探討leptin的生 物學(xué)作

10、用，大量獲得leptin蛋口以便進(jìn)一步研究其功能及調(diào)節(jié)機(jī)制，探討 rh-1 epti n (重組人lepti n)用于臨床治療的可行性和生理作用，我們對(duì)人leptin 進(jìn)行了克隆重組及表達(dá)，對(duì)rh-leptin進(jìn)行復(fù)性和純化后，鑒定其免疫學(xué)和生物 學(xué)活性。材料與方法1材料1.1質(zhì)粒和菌株pgem-t easy克隆載體為pro mega公司產(chǎn)品；pet-28a表達(dá) 載體為novagen公司產(chǎn)品；dh5a和bl21 (de3)宿主菌株為tiangen公司 產(chǎn)品o1.2組織來(lái)源 取自手術(shù)患者腹部皮下脂肪。1.3酶和試劑 各種酶類，如amv逆轉(zhuǎn)錄酶、taq酶、限制性內(nèi)切酶ecori、xhol i和t4

11、連接酶，以及質(zhì)粒提取試劑盒、dna凝膠回收試劑盒、異丙基 硫代卩d半乳糖昔(iptg)等為promega公司產(chǎn)品；trizol為invitorgen公司產(chǎn) 甜；兔抗人leptin多克隆抗體(pcab)為木室免疫獲得，抗his.tag單克隆抗體(mcab)及羊抗兔igg(二抗)為普利萊公司產(chǎn)品。1.4引物合成 根據(jù)genbank數(shù)據(jù)，針對(duì)leptin的編碼區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在 上、下游引物的亍端分別加入酶切位點(diǎn)ecorl和xhol o上游引物(u)序列: 5, cg ga a ttc atg cat tgg gga acc ctg tg 31；下游引物(d)序列：5, ccg ctcgag tca

12、 gca ccc agg gct gag gt 3,(北京奧科公司合成)。1.5 緩沖液配置 緩沖液 a 為 tris-hcl 50mmol/l, ph7.9,含 edta ().5mmol/l, nacl 50mmol/l, dtt 0.25mmol/l,甘油 5%；緩沖液 b 為 tris-hcl 50mmol/l, ph7.9,含 edta 0.5mmol/l, nacl 50mmol/l, dtt 0.25mmol/l, 甘油15%o1.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20g左右的雄性km小鼠32只，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供。2方法2rt-pcr擴(kuò)增 將脂肪組織(350 mg)置于冰浴后的trizo

13、l(1.2ml)屮勻漿，提 取總rna,測(cè)量處吸光度值(a260),定量后立即逆轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)條 件為：94°c, 30s； 66°c, 50s； 70°c, 60s。共 32 個(gè)循環(huán)。2.2 leptin克隆載體的構(gòu)建將上述帶有酶切位點(diǎn)的leptin pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 dna凝膠純化回收后，在t4連接酶作用下，pgem-t easy載體相連，構(gòu)建 leptin的克隆載體，轉(zhuǎn)染dh5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定(北京華大 公司)。2.3 leptin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化利用ecor i和xho i分別酶切構(gòu)建 好的leptin克隆載體以及p

14、et28a(+)表達(dá)載體，將獲得的二者產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化回 收后，進(jìn)行連接，構(gòu)建leptin表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染dh5a ,提取質(zhì)粒進(jìn)行 測(cè)序鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.coli bl21(de3)菌株。2.4誘導(dǎo)his.tag-leptin融合蛋白表達(dá)挑轉(zhuǎn)化后單菌落，在lb培養(yǎng)液屮37 °c 振蕩過(guò)夜。培養(yǎng)物1： 100稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(a55o=o8)，丿瓜iptg (1 mmol/l)于22 °c誘導(dǎo)4 h。超聲破碎細(xì)菌后，分別取上清及包涵體進(jìn)行表達(dá) 分析。2.5表達(dá)蛋白的分析鑒定將上清及包涵體樣品分別于12 %聚丙烯酰胺凝膠 上進(jìn)行垂直電泳(sds-page)

15、,鑒定leptin融合蛋白表達(dá)的位置。2.6包涵體的制備 取200ml含有rh-lcptin表達(dá)質(zhì)粒的e. coli菌液,經(jīng)組 織破碎器短暫勻漿后重懸于20ml緩沖液a中，在冰浴中超聲裂菌，4°c、 13000r/min離心lomin,收集沉淀的包涵體，用0. l%triton-100洗滌2次。以 19. 6ml緩沖液a和0. 4 ml 20%skl懸浮包涵體，室溫靜置30min, 4°c、13000r/min 離心lomin,收集上清。2.7 rh-leptin復(fù)性與濃縮 對(duì)溶解物進(jìn)行蛋白定量。用緩沖液b稀釋溶解蛋 白至0. lmg/ml, skl終濃度為0. 04%。4

16、°c溶解蛋白，以loooml緩沖液a攪拌透 析24h,間隔換液3次。取出后濃縮至20-30mlo2.8 rh-leptin的免疫活性鑒定將蛋白樣品于12 %sds-page電泳，電轉(zhuǎn)移 至硝酸纖維素膜。封閉后，與leptin pcab結(jié)合，進(jìn)行western卬跡朵交檢測(cè)， 利用ecl系統(tǒng)進(jìn)行顯色。2. 9 rh-leptin的生物活性鑒定km小鼠正常飼養(yǎng)3天，去除體重v17g和 >21g的小鼠，隨機(jī)分為兩組(n=10)o禁食48h,降低內(nèi)源性leptin水平后， 按rh-leptin 2. 5mg/kg或緩沖液7. 75ml/kg,腹腔注射2/h ,每日定時(shí)稱重并 觀察食物攝入

17、量。12只km小鼠隨機(jī)分為rh-lcptin組(n=6)和對(duì)照組(n=6)o 禁食12h,腹腔注射rh-leptin 2. 5mg/kg或生理鹽水12. 5ml/kg, 3h后每只小 鼠均給予5%炭末阿拉們膠混懸液0. 2ml/10go灌胃后15min,小鼠頸椎脫臼法處 死，剖開(kāi)小鼠腹腔，取出胃腸道(去除腸系膜)，將腸管下端墜以5g袪碼。以幽 門(mén)為起點(diǎn)，測(cè)量炭末在腸管內(nèi)的移動(dòng)距離和小腸(自幽門(mén)至回盲部)的全長(zhǎng)，計(jì) 算每只小鼠炭末移動(dòng)距離占小腸全長(zhǎng)的百分率，比較兩組小鼠結(jié)果的差異。2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±5表示，采用spss 11.0軟件進(jìn)行成組t 檢驗(yàn)，人0.05為差異冇統(tǒng)

18、計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、pcr擴(kuò)增人leptin編碼區(qū)序列：pcr擴(kuò)增人leptin編碼區(qū)序列產(chǎn)物如圖1所 示，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，丁 520 bp處岀現(xiàn)清晰的條帶，與預(yù) 計(jì)的leptin大小(521 bp)相符。1 2圖1 leptin編碼區(qū)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳注：1.為dl2000 dna分子量標(biāo)準(zhǔn)(dna marker);2.為帶酶切位點(diǎn)的leptin編碼區(qū)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物2、pet-28a(+)-leptin重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定：將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 結(jié)果與genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中人leptin的cds序列完全一致，表明目的基因完全符 合設(shè)計(jì)要求。3、pet-28a

19、(+)-lepin重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的分析：如圖2所示，經(jīng)sds-page電泳 分析，重組表達(dá)產(chǎn)物在22 kda處有一明顯的條帶(與leptin相符)，且主要存在 于包涵體中(占總蛋口的50%以上)，而對(duì)照組則無(wú)相應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)。123456圖2 pet-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物sds-page分析注:1-4為對(duì)照組，分別為：pet28a(+)空質(zhì)粒iptg誘導(dǎo)4 h后:1.包涵體；2.上清;pet-28a(+)空質(zhì)粒無(wú)誘導(dǎo)4 h后：3.包涵體；4.上清。5 6為重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物：pet-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒iptg誘導(dǎo)4 h后:5包涵體；6上清。4、rh-leptin的

20、免疫學(xué)活性鑒定：分別利用leptin pcab及his.tag mcab的抗體 進(jìn)行western卬跡雜交，證實(shí)了此條帶的特異性(圖3a、圖3b)。且融合蛋口his.tag-leptin在菌體上清及包涵體屮均冇表達(dá)，但主要在包涵體屮存在。123一 22 kda22 kda圖3 western印跡雜交分析重組表達(dá)蛋白的特異性注：圖3 a為用leptin pcab進(jìn)行western blot分析的結(jié)果；圖3 b為用his.tag mcab進(jìn) 行western blot分析結(jié)果。圖屮i 一4均為對(duì)照組，即pet-28a(+)空質(zhì)粒iptg誘導(dǎo)4 h后：i .包涵體；2.上清；pet-28a(+)空質(zhì)

21、粒無(wú)誘導(dǎo)4 h后:3.包涵體；4.上清。5、6為重組質(zhì)粒表 達(dá)產(chǎn)物：pet-28a(+)-lepin重組質(zhì)粒iptg誘導(dǎo)4 h后:5.包涵體；6.上清。5、rh-leptin的生物活性鑒定:由圖4 口j見(jiàn),小鼠腹腔注射rh-leptin 2天后 體重增長(zhǎng)即明顯低于緩沖液組，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)rh-leptin組小鼠的體重改變比 (體重改變量/原始體重x100%)均小于緩沖液組。圖4 rh-leptin對(duì)小鼠體重改變比(%)的影響(n=10)腹腔注射rh-leptin對(duì)進(jìn)食的抑制情況見(jiàn)圖5,整個(gè)頭驗(yàn)期內(nèi)rh-leptin組 小鼠的進(jìn)食量改變比明顯低于緩沖液組，顯著抑制小鼠進(jìn)食。由此可見(jiàn)重組表達(dá) 的l

22、eptin具冇良好的生物學(xué)活性。圖5 rh-leptin對(duì)小鼠進(jìn)食量改變比(%)的影響(n=10)注：與緩沖液組相比，*/，0.05 rh-leptin組；緩沖液組土相皿血fem挨理rh-leptin組小鼠胃腸推進(jìn)率明顯低于生理鹽水組(p0. 05)，說(shuō)明腹腔注 射rh-leptin在一定吋間范圍內(nèi)可以抑制小鼠胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)。同樣證明了 rh-leptin具有生物學(xué)活性。表rh-leptin組與生理鹽水組胃腸炭末推進(jìn)率比較組別動(dòng)物數(shù)(只)胃腸推進(jìn)率(%)rh-eptin 紐641.98±5. 81 *生理鹽水組654. 53±11.08注：與生理鹽水組相比,*戶0.05?？趶?/p>

23、1994年zhang等首次從脂肪細(xì)胞里克隆出ob基因以來(lái)，leptin迅速成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究表明:leptin作為一種脂肪組織與卜丘腦z間的信號(hào) 傳導(dǎo)蛋片對(duì)維持體內(nèi)正常的脂肪水平起著重要的作用。因此，最初的針對(duì)leptin 的研究主要局限在減肥領(lǐng)域。但是，在進(jìn)行ii期臨床研究吋發(fā)現(xiàn)，leptin在人體 中減肥效果非常微弱，遠(yuǎn)低于在動(dòng)物試驗(yàn)中取得的效果。越來(lái)越多的研究證實(shí)，作為一種脂肪細(xì)胞因子，leptin參與了糖尿病、神經(jīng) 內(nèi)分泌性高血壓、肝炎和肝纖維化、創(chuàng)傷感染等引起的膿毒血癥、部分重耍臟器 的缺血再灌注損傷過(guò)程等病理生理的調(diào)節(jié)機(jī)制鐵具冇廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。0 前已觀察到多種藥物(格列酮

24、類、他汀類、貝特類、血清轉(zhuǎn)胺猶抑制劑、大麻素 -i受休拮抗劑)可以影響血清中l(wèi)eptin水平。表明leptin在病理狀態(tài)時(shí)具有潛 在的作用。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)：肝臟i/r損傷、嚴(yán)重肺感染致多器官衰竭綜合 征患者及急性心梗患者的血清leptin水平與止常人相比顯著升高，提示它可能是 急性炎癥發(fā)生后的重要應(yīng)答因子血刀。研究者們認(rèn)為leptin是一個(gè)頗具前景的具 有多元化作用的治療靶點(diǎn)。因此，重組表達(dá)和純化有生物活性的rh-leptin對(duì)于 繼續(xù)研究leptin在創(chuàng)傷修復(fù)及應(yīng)激反應(yīng)中的保護(hù)作用具有重要意義。novagen公司的pet表達(dá)體系是目前在原核細(xì)胞屮克隆和表達(dá)融合蛋白的 最佳體系z(mì)-o本實(shí)驗(yàn)

25、選用bl21(de3)/pet28a(+)作為表達(dá)體系有下述優(yōu)點(diǎn)： pet28a( + )使用t7s啟動(dòng)子，其上游的laci編碼足夠的lac抑制子，阻斷 t7rna聚合酶的產(chǎn)生和其對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)錄，使基礎(chǔ)表達(dá)水平降到最低，可提 高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。pet-28a( + )的多克隆位點(diǎn)區(qū)域(bamh i -xho i )下游 含冇多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，可以冇效地阻止通讀；轉(zhuǎn)錄的mrna3-尾形成二級(jí)環(huán) 狀結(jié)構(gòu)，可阻止降解，延長(zhǎng)壽命罔。bl21 (de3)菌株缺乏ompt外膜蛋白 酶，冇利于防止表達(dá)產(chǎn)物在提純時(shí)降解;攜帶t7 rna聚合酶基因的噬菌體de3 已整合于細(xì)菌基因組，可通過(guò)iptg誘導(dǎo)使之表

26、達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)t7 lac 動(dòng)子， 開(kāi)始目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，pet-28a( + )在n端含有his.tag寡聚組氨酸 鏈的同時(shí),c端也具冇可選的his.tag,因此,表達(dá)出的融合蛋白在多種情況下都 可以便利地和經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行純化。我們?cè)谶\(yùn)用bl21(de3)/pet-28a( + )體系高效地表達(dá)了 rh-leptin的基礎(chǔ)上, 獲得了主要以包涵體形式存在(>50%)的rh-leptin融合蛋白。將包涵體以 0. l%triton-100洗滌后用skl溶解，進(jìn)一步濃縮后，得到了高純度有免疫學(xué)活 性的目的蛋白。在對(duì)rh-leptin生物學(xué)活性鑒定時(shí)，選用了兩種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?經(jīng)典的小鼠減

27、肥及進(jìn)食量抑制實(shí)驗(yàn)i9), leptin作為一種脂肪組織與下丘腦之間 的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白對(duì)維持體內(nèi)正常的脂肪水平及調(diào)節(jié)進(jìn)食起著重要的作用給 予外源性rh-leptin后顯著抑制了小鼠的體重及進(jìn)食量增長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選用20g 的km小鼠，正處于生長(zhǎng)發(fā)育期。但通過(guò)與對(duì)照組比較，rh-leptin對(duì)小鼠進(jìn) 食和體重增長(zhǎng)的抑制作用仍清晰可見(jiàn)；小鼠胃腸推進(jìn)率測(cè)定模型實(shí)驗(yàn)， leptin可通過(guò)迷走一膽堿能神經(jīng)和膽囊收縮索a (cck-a)介導(dǎo)的作用持續(xù)性抑 制胃運(yùn)動(dòng),影響食物排空，導(dǎo)致胃腸推進(jìn)率降低em。木文觀察到給予rh-leptin 組小鼠的胃腸推進(jìn)速率降低，與對(duì)照組相比有顯著性差杲。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)重組表達(dá)

28、了 rh-leptin,建立了其分離純化技術(shù)，獲得 了高純度的具有免疫學(xué)和生物學(xué)活性的rh-lcptin蛋白，為進(jìn)一步開(kāi)展leptin 的臨床和基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：fl kelesidis t, mantzoros c s. the emerging role of leptin in humansfj. pediatr endocrinol rev, 2006, 3(3):239-248.2 zhang y, proenca r, maffei m, et al. positional cloning of the mouse obese gene and its human homologuej. nature, 1994,372 (6505):425-432.3 石燕，顏光濤，林季.探討急性應(yīng)激因子誘導(dǎo)leptin水平降低j.標(biāo)記免疫分析與臨 床，2004,11(4):215-219.4 李宏睿，孫文夏.瘦素功能研究進(jìn)展j中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2004,12:108-112.5 paraskevas k i , liapis c d, mikhailidis d p. leptin: a promising therapeutic target with ple