食品衛(wèi)生微生物檢驗實驗室操作要求食品微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多試驗要求在無菌條件下進行，主要原因：一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。 一、無菌操作要求 1. 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。 2. 進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。 3. 接種食品樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?4. 進行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。 5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。 6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。 7. 接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min，再經(jīng)火焰燒灼。 8. 吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。 二、無菌間使用要求 1. 無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門，另設(shè)有0.5-0.7m2的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。 2. 無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品。 3. 無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。 4. 處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。 5. 在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置 三、消毒滅菌要求 微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。 （一）干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法 1滅菌前準備 （1）所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。 （2）裝培養(yǎng)基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。 2裝放 （1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。 （2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。 3設(shè)備檢查 （1）檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。 （2）檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。 （3）對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。 4滅菌處理 (1) 干熱滅菌法：此法適應(yīng)于在干熱情況下，不損壞、不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。 器械器皿應(yīng)清洗后再干烤，以防附著在表面的污物炭化。 滅菌時安放物品不能過擠，不要直接接觸底和箱壁，物品之間留有空隙。 菌時將箱門關(guān)緊，接上電源，先將排氣孔打開約30min，排除滅菌器中的冷空氣，溫度升至160調(diào)節(jié)指示燈，維持1.5 2h。 滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60以下才能打開箱門。 (2) 手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進行： 手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)使用時應(yīng)將水量補足，水變混濁需更換）. 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10-15min）。 關(guān)閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定）。 達到規(guī)定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復(fù)到零時，自然冷卻至60后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60以下 再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。 (3) 臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行： 關(guān)緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預(yù)熱，夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出。 夾層達到預(yù)定溫度后，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出。 待鍋室達到規(guī)定的壓力與溫度時，調(diào)節(jié)進氣閥，使保持恒定至 自然或人工降溫至60再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體劇烈沸騰或容器爆破。 使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關(guān)緊門后，應(yīng)根據(jù)物品類別按動相應(yīng)開關(guān)，以便按要求程序自動進行滅菌，滅菌時必須利用附設(shè)儀表記錄溫度與時間以備查，操作要求應(yīng)嚴格按照廠家說明書進行。 5滅菌溫度與時間(1) 干熱滅菌器滅菌溫度160，1.5-2h。(2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間 （二）間歇滅菌方法 1.滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。 （1）將欲滅菌物品置于鍋內(nèi)，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內(nèi)余水排盡。 （2）關(guān)閉排水口，打開進氣門，根據(jù)需要消毒1020min。 （3）滅菌完畢關(guān)閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。 2血清凝固器使用方法，培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養(yǎng)成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。 (1) 在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用。 (2)將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75901h滅菌，放37溫箱過夜，再如此滅菌三次。 3煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮515 min，也可在水中加入2石炭酸煮沸5 min，加入0.02甲醛, 80煮60 min均可達到滅菌目的, 但選用煮沸消毒的增消劑時, 應(yīng)注意對物品的腐蝕性. 4滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應(yīng)仔細檢查放置,以免再度污染。 (1) 物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用。 (2) 取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。 (3) 培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應(yīng)廢棄。 (4) 啟閉式容器,在取出時應(yīng)將篩孔關(guān)閉。 (5) 取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。 (6) 取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴禁與未滅菌物品混放。 (7) 凡屬合格物品,應(yīng)標有滅菌日期及有效期限。 (8) 每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。 四、有毒有菌污物處理要求 微生物實驗所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律不得帶出實驗室。 1. 經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌。 2. 經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)12130min高壓滅菌。 3. 染菌后的吸管，使用后放入5煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)12130 min高壓滅菌。 4. 涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。 5. 打碎的培養(yǎng)物，立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。 污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。 五、培養(yǎng)基制備要求 培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養(yǎng)要求不完全相同，培養(yǎng)目的的不同，各種培養(yǎng)基制備要求如下： 1根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進行質(zhì)量檢驗。 2PH測定及調(diào)節(jié)：PH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應(yīng)再測試一次。培養(yǎng)基PH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。 3培養(yǎng)基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養(yǎng)基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。 4盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。 5培養(yǎng)基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值，一般12115min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等，則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50左右再加入。 6每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基，使用標準菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時可置4冰箱存放。 7目前各種干燥培養(yǎng)基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應(yīng)觀察，各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長試驗良好后方可應(yīng)用，新購進的或存放過久的干燥培養(yǎng)基，在配制時也應(yīng)測PH，使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進行。 8每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄，以備查詢。 六、樣品采集及處理要求 1所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查，檢查是否有污染源存在。 2根據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應(yīng)按標準檢驗方法的要求進行。 3采樣應(yīng)注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應(yīng)用。 4樣品采集后應(yīng)立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在15環(huán)境中，如需冷凍者，則在凍存狀態(tài)下送檢。 5檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者，可拒絕檢驗。 (1) 樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。 (2) 瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。 (3) 按規(guī)定采樣數(shù)量不足者。 對送檢符合要求的樣品，檢驗室收到后，應(yīng)立即進行檢驗，如果條件不具備，應(yīng)置4冰箱存放，及時準備創(chuàng)造條件，然后進行檢驗。 6樣品檢驗時，根據(jù)其不同性狀，進行適當處理。 (1) 液體樣品接種時，應(yīng)充分混合均勻，按量吸取進行接種。 (2) 固體樣品，