第十章紫外 可見分光光度法 第一節(jié)光學(xué)分析概論 一 電磁輻射和電磁波譜二 光學(xué)分析法及其分類三 光譜法儀器 分光光度計 一 電磁輻射和電磁波譜 1 電磁輻射 電磁波 光 以巨大速度通過空間 不需要任何物質(zhì)作為傳播媒介的一種能量 2 電磁輻射的性質(zhì) 具有波 粒二向性波動性 粒子性 續(xù)前 3 電磁波譜 電磁輻射按波長順序排列 稱 射線 X射線 紫外光 可見光 紅外光 微波 無線電波 二 光學(xué)分析法及其分類 一 光學(xué)分析法依據(jù)物質(zhì)發(fā)射的電磁輻射或物質(zhì)與電磁輻射相互作用而建立起來的各種分析法的統(tǒng)稱 二 分類 1 光譜法 利用物質(zhì)與電磁輻射作用時 物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化能級躍遷而產(chǎn)生的吸收 發(fā)射或散射輻射等電磁輻射的強度隨波長變化的定性 定量分析方法 續(xù)前 2 非光譜法 利用物質(zhì)與電磁輻射的相互作用測定電磁輻射的反射 折射 干涉 衍射和偏振等基本性質(zhì)變化的分析方法分類 折射法 旋光法 比濁法 射線衍射法 3 光譜法與非光譜法的區(qū)別 續(xù)前 三 發(fā)射光譜 四 吸收光譜 例 射線 x 射線 熒光 例 原子吸收光譜 分子吸收光譜 三 光譜法儀器 分光光度計 主要特點 五個單元組成 光源 單色器 樣品池 檢測器 記錄裝置 第二節(jié)紫外 可見吸收光譜 一 紫外 可見吸收光譜的產(chǎn)生二 紫外 可見吸收光譜的電子躍遷類型三 相關(guān)的基本概念四 吸收帶類型和影響因素 一 紫外 可見吸收光譜的產(chǎn)生 1 分子吸收光譜的產(chǎn)生 由能級間的躍遷引起 能級 電子能級 振動能級 轉(zhuǎn)動能級躍遷 電子受激發(fā) 從低能級轉(zhuǎn)移到高能級的過程 若用一連續(xù)的電磁輻射照射樣品分子 將照射前后的光強度變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒂涗浵聛?就可得到光強度變化對波長的關(guān)系曲線 即為分子吸收光譜 續(xù)前 2 分子吸收光譜的分類 分子內(nèi)運動涉及三種躍遷能級 所需能量大小順序 3 紫外 可見吸收光譜的產(chǎn)生由于分子吸收紫外 可見光區(qū)的電磁輻射 分子中價電子 或外層電子 的能級躍遷而產(chǎn)生 吸收能量 兩個躍遷能級之差 二 紫外 可見吸收光譜的電子躍遷類型 預(yù)備知識 軌道 電子圍繞原子或分子運動的幾率軌道不同 電子所具有能量不同 基態(tài)與激發(fā)態(tài) 電子吸收能量 由基態(tài) 激發(fā)態(tài)c成鍵軌道與反鍵軌道 n 圖示 b 電子躍遷類型 1 躍遷 飽和烴 甲烷 乙烷 E很高 150nm 遠紫外區(qū) 2 n 躍遷 含雜原子飽和基團 OH NH2 E較大 150 250nm 真空紫外區(qū) 3 躍遷 不飽和基團 C C C O E較小 200nm體系共軛 E更小 更大4 n 躍遷 含雜原子不飽和基團 C N C O E最小 200 400nm 近紫外區(qū) 按能量大小 n n 圖示 續(xù)前 注 紫外光譜電子躍遷類型 n 躍遷 躍遷飽和化合物無紫外吸收電子躍遷類型與分子結(jié)構(gòu)及存在基團有密切聯(lián)系根據(jù)分子結(jié)構(gòu) 推測可能產(chǎn)生的電子躍遷類型 根據(jù)吸收譜帶波長和電子躍遷類型 推測分子中可能存在的基團 分子結(jié)構(gòu)鑒定 三 相關(guān)的基本概念 1 吸收光譜 吸收曲線 不同波長光對樣品作用不同 吸收強度不同以 A作圖next2 吸收光譜特征 定性依據(jù)吸收峰 max吸收谷 min肩峰 sh末端吸收 飽和 躍遷產(chǎn)生 圖示 back 續(xù)前 3 生色團 發(fā)色團 能吸收紫外 可見光的基團有機化合物 具有不飽和鍵和未成對電子的基團具n電子和 電子的基團產(chǎn)生n 躍遷和 躍遷躍遷E較低例 C C C O C N N N 4 助色團 本身無紫外吸收 但可以使生色團吸收峰加強同時使吸收峰長移的基團有機物 連有雜原子的飽和基團例 OH OR NH NR2 X 注 當(dāng)出現(xiàn)幾個發(fā)色團共軛 則幾個發(fā)色團所產(chǎn)生的吸收帶將消失 代之出現(xiàn)新的共軛吸收帶 其波長將比單個發(fā)色團的吸收波長長 強度也增強 續(xù)前 5 紅移和藍移 由于化合物結(jié)構(gòu)變化 共軛 引入助色團取代基 或采用不同溶劑后吸收峰位置向長波方向的移動 叫紅移 長移 吸收峰位置向短波方向移動 叫藍移 紫移 短移 6 增色效應(yīng)和減色效應(yīng)增色效應(yīng) 吸收強度增強的效應(yīng)減色效應(yīng) 吸收強度減小的效應(yīng)7 強帶和弱帶 max 105 強帶 min 103 弱帶 四 吸收帶類型和影響因素 1 R帶 由含雜原子的不飽和基團的n 躍遷產(chǎn)生C O C N N N E小 max250 400nm max 100溶劑極性 max 藍移 短移 2 K帶 由共軛雙鍵的 躍遷產(chǎn)生 CH CH n CH C CO max 200nm max 104共軛體系增長 max 紅移 max 溶劑極性 對于 CH CH n max不變對于 CH C CO max 紅移 續(xù)前 3 B帶 由 躍遷產(chǎn)生芳香族化合物的主要特征吸收帶 max 254nm 寬帶 具有精細結(jié)構(gòu) max 200極性溶劑中 或苯環(huán)連有取代基 其精細結(jié)構(gòu)消失 4 E帶 由苯環(huán)環(huán)形共軛系統(tǒng)的 躍遷產(chǎn)生芳香族化合物的特征吸收帶E1180nm max 104 常觀察不到 E2200nm max 7000強吸收苯環(huán)有發(fā)色團取代且與苯環(huán)共軛時 E2帶與K帶合并一起紅移 長移 圖示 圖示 圖示 續(xù)前 影響吸收帶位置的因素 1 溶劑效應(yīng) 對 max影響 nextn 躍遷 溶劑極性 max 藍移 躍遷 溶劑極性 max 紅移對吸收光譜精細結(jié)構(gòu)影響next溶劑極性 苯環(huán)精細結(jié)構(gòu)消失溶劑的選擇 極性 純度高 截止波長 max2 pH值的影響 影響物質(zhì)存在型體 影響吸收波長 圖示 back 圖示 Back 第三節(jié)基本原理 一 Lamber Beer定律二 吸光系數(shù)和吸收光譜三 偏離Beer定律的因素四 透光率的測量誤差 一 Lamber Beer定律 吸收光譜法基本定律 描述物質(zhì)對單色光吸收強弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系 假設(shè)一束平行單色光通過一個吸光物體 續(xù)前 討論 1 Lamber Beer定律的適用條件 前提 入射光為單色光溶液是稀溶液2 該定律適用于固體 液體和氣體樣品3 在同一波長下 各組分吸光度具有加和性應(yīng)用 多組分測定 二 吸光系數(shù)和吸收光譜 1 吸光系數(shù)的物理意義 單位濃度 單位厚度的吸光度 討論 1 E f 組分性質(zhì) 溫度 溶劑 當(dāng)組分性質(zhì) 溫度和溶劑一定 E f 2 不同物質(zhì)在同一波長下E可能不同 選擇性吸收 同一物質(zhì)在不同波長下E一定不同3 E 物質(zhì)對光吸收能力 定量測定靈敏度 定性 定量依據(jù) 續(xù)前 2 吸光系數(shù)兩種表示法 1 摩爾吸光系數(shù) 在一定 下 C 1mol L L 1cm時的吸光度2 百分含量吸光系數(shù) 比吸光系數(shù) 在一定 下 C 1g 100ml L 1cm時的吸光度3 兩者關(guān)系 3 吸收光譜 吸收曲線 A 續(xù)前 4 吸光度測量的條件選擇 1 測量波長的選擇 2 吸光度讀數(shù)范圍的選擇 3 參比溶液 空白溶液 的選擇 選A 0 2 0 7 注 采用空白對比消除因溶劑和容器的吸收 光的散射和界面反射等因素對透光率的干擾 三 偏離Beer定律的因素 依據(jù)Beer定律 A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點的直線偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個方面 一 光學(xué)因素 二 化學(xué)因素 一 光學(xué)因素 1 非單色光的影響 Beer定律應(yīng)用的重要前提 入射光為單色光 照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應(yīng) 必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來的光具一定的譜帶寬度 續(xù)前 2 雜散光的影響 雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi) 與所選波長相距較遠雜散光來源 儀器本身缺陷 光學(xué)元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形 吸光度變值 3 反射光和散色光的影響 反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光直接對T產(chǎn)生影響散射和反射使T A 吸收光譜變形注 一般可用空白對比校正消除4 非平行光的影響 使光程 A 吸收光譜變形 二 化學(xué)因素 Beer定律適用的另一個前提 稀溶液濃度過高會使C與A關(guān)系偏離定律 四 透光率的測量誤差 T 影響測定結(jié)果的相對誤差兩個因素 T和 T T影響因素 儀器噪音1 暗噪音2 訊號噪音 續(xù)前 1 暗噪音 與檢測器和放大電路不確切性有關(guān)與光訊號無關(guān) 續(xù)前 2 訊號噪音 與光訊號有關(guān) 表明測量誤差較小的范圍一直可延至較高吸光度區(qū) 對測定有利 第四節(jié)紫外分光光度計 1 光源 2 單色器 包括狹縫 準(zhǔn)直鏡 色散元件 續(xù)前 3 吸收池 玻璃 能吸收UV光 僅適用于可見光區(qū)石英 不能吸收紫外光 適用于紫外和可見光區(qū)要求 匹配性 對光的吸收和反射應(yīng)一致 4 檢測器 將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置 5 記錄裝置 訊號處理和顯示系統(tǒng) 類型 1 單光束分光光度計 特點 使用時來回拉動吸收池 移動誤差對光源要求高比色池配對 續(xù)前 2 雙光束分光光度計 特點 不用拉動吸收池 可以減小移動誤差對光源要求不高可以自動掃描吸收光譜 續(xù)前 3 雙波長分光光度計 特點 利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差 第五節(jié)定性和定量分析 一 定性分析二 定量分析 一 定性分析 一 定性鑒別 定性鑒別的依據(jù) 吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置 波長 吸收峰的強度相應(yīng)的吸光系數(shù) 續(xù)前 1 對比吸收光譜的一致性 同一測定條件下 與標(biāo)準(zhǔn)對照物譜圖或標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對照比較 續(xù)前 2 對比吸收光譜的特征值 續(xù)前 3 對比吸光度或吸光系數(shù)的比值 例 續(xù)前 二 純度檢查和雜質(zhì)限量測定 1 純度檢查 雜質(zhì)檢查 1 峰位不重疊 找 使主成分無吸收 雜質(zhì)有吸收 直接考察雜質(zhì)含量2 峰位重疊 主成分強吸收 雜質(zhì)無吸收 弱吸收 與純品比較 E 雜質(zhì)強吸收 主成分吸收 與純品比較 E 光譜變形 續(xù)前 2 雜質(zhì)限量的測定 例 腎上腺素中微量雜質(zhì) 腎上腺酮含量計算2mg mL 0 05mol L的HCL溶液 310nm下測定規(guī)定A310 0 05即符合要求的雜質(zhì)限量 0 06 二 定量分析 一 單組分的定量方法 1 吸光系數(shù)法2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法3 對照法 外標(biāo)一點法 續(xù)前 1 吸光系數(shù)法 絕對法 練習(xí) 例 維生素B12的水溶液在361nm處的百分吸光系數(shù)為207 用1cm比色池測得某維生素B12溶液的吸光度是0 414 求該溶液的濃度 解 練習(xí) 例 精密稱取B12樣品25 0mg 用水溶液配成100ml 精密吸取10 00ml 又置100ml容量瓶中 加水至刻度 取此溶液在1cm的吸收池中 于361nm處測定吸光度為0 507 求B12的百分含量 解 續(xù)前 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 續(xù)前 3 對照法 外標(biāo)一點法 注 當(dāng)樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋倍數(shù)相同時 練習(xí) 例 維生素B12的含量測定精密吸取B12注射液2 50mL 加水稀釋至10 00mL 另配制對照液 精密稱定對照品25 00mg 加水稀釋至1000mL 在361nm處 用1cm吸收池 分別測定吸光度為0 508和0 518 求B12注射液注射液的濃度以及標(biāo)示量的百分含量 該B12注射液的標(biāo)示量為100 g mL 解 1 對照法 練習(xí) 2 吸光系數(shù)法 續(xù)前 二 多組分的定量方法 三種情況 1 兩組分吸收光譜不重疊 互不干擾 兩組分在各自 max下不重疊 分別按單組分定量 續(xù)前 2 兩組分吸收光譜部分重疊 1 測A1 b組分不干擾 可按單組分定量測Ca 2 測A2 a組分干擾 不能按單組分定量測Ca 續(xù)前 3 兩組分吸收光譜完全重疊 混合樣品測定 1 解線性方程組法 2 等吸收雙波長消去法 3 系數(shù)倍率法 1 解線性方程組法 步驟 2 等吸收雙波長法 步驟 消除a的影響測b 續(xù)前 消去b的影響測a 注 須滿足兩個基本條件選定的兩個波長下干擾組分具有等吸收點選定的兩個波長下待測物的吸光度差值應(yīng)足夠大 3 系數(shù)倍率法 前提 干擾組分b不成峰形無等吸收點 續(xù)前 步驟 b曲線上任找一點 1另一點 2 優(yōu)點 同時將待測組分和干擾組分放大信號K倍 提高了待測組分測定靈敏度 練習(xí) 解 1 取咖啡酸 在165 干燥至恒重 精密稱取10 00mg 加少量乙醇溶解 轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶中 加水