1、,流式細(xì)胞術(shù)實驗技巧及數(shù)據(jù)分析 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 史桂英,一 流式細(xì)胞儀的基本原理 *穩(wěn)定流動 *激發(fā)光斑 *熒光補償 *熒光素選擇 二 數(shù)據(jù)分析及開窗,FCM原理示意圖,層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件,管道中層流 的形成要滿足雷諾數(shù) dV Re = 2300， 式中、分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術(shù),使細(xì)胞流動穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證.,層流技術(shù),液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）,流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。,低速 高速 不同樣本速率

2、形成的樣本流,激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng),.,20um,64um,32um 0 32um,聚焦距離,激光束,聚焦透鏡,強度,光束成形與細(xì)胞受照方式,這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個細(xì)胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照 FCM的單細(xì)胞照明技術(shù),熒光光譜重疊,FITC和PE熒光光譜重疊,Uncompensated vs Compensated,FL1,FL2,利用電子技術(shù)或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的方法稱“熒光補償”,熒光補償,熒光補償,Mean值判斷補償,雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記,FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色 FITC+T red 488 525

3、綠色 568 615 紅色 FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色 FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色 F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色 F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙紅色、紅色 F+P +PeCy5 +APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色,熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色,用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一 起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長 激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號。,Laser,CY7 755,PE,

4、ECD 620,CY5 670,488nm,能量傳遞染料：,流式細(xì)胞術(shù)操作流程：,單分散細(xì)胞,FSC,FSC信號的強弱與細(xì)胞的大小和活力相關(guān),SSC,SSC信號的強弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒多少相關(guān),細(xì)胞散色光信號,細(xì)胞熒光測量,細(xì)胞的自發(fā)熒光 未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞 在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒 光信號.,細(xì)胞的特異性熒光 經(jīng)過各種特異染色的 細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測到較強的熒光 信號.,自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖,自發(fā)熒光信號,特異染色的熒光信號,DNA分析比較,排除雙聯(lián)體細(xì)胞,細(xì)胞阻滯在G2M期,雙克隆細(xì)胞周期分析,溴脫氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一種類似物。它可以替代 胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞新合成的DNA分子中，成為S 期細(xì)胞的一種標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)采用抗BrdUrd 單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測細(xì)胞，不僅 可檢測一個細(xì)胞群體的動力學(xué)參數(shù)和DNA含量，同 時可以了解不同細(xì)胞的DNA合成能力高低。,BrdUrd和DNA雙標(biāo)記染色,BrdUrd與PI檢測,BrdUrd與PI檢測,BrdUrd與PI檢測,細(xì)胞三色熒光檢測,細(xì)胞因子測定,*檢測T細(xì)胞(CD69)活化,G6=R1*R5,*CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4熒光強度下調(diào),細(xì)胞因子分析圖,*過敏性鼻息肉與鼻息肉細(xì)胞因子比較,純化單核細(xì)胞,調(diào)節(jié)性