第第頁(yè)共14頁(yè)醫(yī)院制劑婦血寧膠囊的標(biāo)準(zhǔn)研究摘要：設(shè)計(jì)醫(yī)院制劑婦血寧膠囊標(biāo)準(zhǔn)的研究方法。醫(yī)院制劑婦血寧膠囊中三七藥材采用薄層色譜（TLC）法鑒別，活性成分人參皂苷Rg1（C42H72O14）使用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)進(jìn)行定量測(cè)定。經(jīng)由薄層色譜鑒別方法可觀察到各成分能夠有效分離，經(jīng)顯色處理后能看到清晰明亮的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)干擾；高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度線性范圍為0.1273mg/ml～1.0185mg/ml（R2=0.9998,R=0.9999，n=5）。通過(guò)運(yùn)用薄層色譜法及高效液相色譜法，二者專屬性好，皆可為醫(yī)院制劑婦血寧膠囊的標(biāo)準(zhǔn)制定提高合理提供有效的依據(jù)，以保障藥品的安全、有效、可控與穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：婦血寧膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；人參皂苷Rg1；薄層色譜法；高效液相色譜法StudyonthestandardofFuxueningcapsule,ahospitalpreparationAbstract:DesignaqualitycontrolmethodforFuxueningcapsulesbyusingThinlayerchromatographyandHighPerformanceLiquidChromatographywasusedtoidentifypanaxnotoginsenginFuxueningcapsulesanddeterminethecontentofginsenosideRg1（C42H72O14）,theactivecomponentofpanaxnotoginsenginprescription.Chromatographicconditions:chromatographiccolumn:CAPCELLPAKC18MGⅡ（5um4.6×250mm）,mobilephase:acetonitrile-water(19:81),flowrate:1ml/min,columntemperature:30℃,detectionwavelength:203nm.Wecangettheresultfromthemethod,whichcanprovidetechnicalsupportforthequalitycontrolofthepreparation..Keywords:Fuxueningcapsule;Qualitystandard;GinsenosideRg1;Thinlayerchromatography;Highperformanceliquidchromatography.前言醫(yī)院制劑婦血寧膠囊是由三七與頭頂一顆珠兩味中藥經(jīng)前處理后由濕法制粒工藝制備成顆粒裝填于硬質(zhì)膠囊殼而制得。具有活血止血、鎮(zhèn)靜安神、消腫止痛等功效。用于治療功能性子宮出血、月經(jīng)過(guò)多等病癥。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，三七可對(duì)血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)等產(chǎn)生明顯效益[1-3]，并對(duì)腫瘤有一定程度的抑制作用[4]。頭頂一顆珠為少常用中藥，歷代本草中鮮有記載，主要在我國(guó)的少數(shù)民族地區(qū)民間應(yīng)用廣泛。全方無(wú)十八反十九畏，無(wú)毒性藥材，具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、改善心功能和降壓等藥理活性[5-7]。頭頂一顆珠中國(guó)食品藥品檢定研究院無(wú)相關(guān)對(duì)照品或?qū)φ账幉?，因此無(wú)法開(kāi)展研究，本次試驗(yàn)主要考察三七薄層色譜鑒別，且采用高效液相色譜法（HPLC）法對(duì)制劑中的活性成分人參皂苷Rg1（C42H72O14）[8]進(jìn)行含量測(cè)定。本文旨在通過(guò)上述兩種研究方法控制制劑質(zhì)量，并對(duì)完善醫(yī)院制劑婦血寧膠囊質(zhì)量研究具有一定參考價(jià)值。1主要儀器與試劑1.1儀器Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫）；SB-800DTD超聲清洗器（寧波新芝）；SQP型電子分析天平（賽多利斯）；FD115型恒溫干燥箱（BINDER）；TDL-408型離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；ZF1-I多功能紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。1.2試藥乙腈（色譜純）；甲醇、氨試液、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇（分析純）；10%硫酸乙醇溶液；人參皂苷Rg1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110703-201832）；婦血寧膠囊樣品由云南中醫(yī)藥大學(xué)提供（批號(hào)：190701、190702、190703）。2實(shí)驗(yàn)方法2.1薄層色譜鑒別[8-11]2.1.1溶液制備供試品溶液：取內(nèi)容物經(jīng)研磨處理后的粉末（約1g），與水1ml混溶，再加以水飽和的正丁醇5ml，密塞，大力振搖10min促有效成分溶出同時(shí)保證分散均勻，25℃±2℃下放置2h，直至密度不同的兩重液體明顯分層，取上層，加3倍量用正丁醇飽和的水，使液體充分混合，離心，取正丁醇層，70℃±5℃加熱至無(wú)流動(dòng)，取出沿壁滴加甲醇1ml，使殘余物溶解，在甲醇揮發(fā)前迅速將所得溶液收集于干燥潔凈的容器中密閉保存，即得。陰性對(duì)照品溶液：同供試品溶液制備。（陰性對(duì)照品：按本品種處方，缺少三七，其他藥材組成不變，按藥品生產(chǎn)工藝生產(chǎn)陰性對(duì)照品。）對(duì)照品溶液制備：使用電子分析天平稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品，保證稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一，以甲醇為溶劑，制成人參皂苷Rg1對(duì)照品（1mg/ml）的對(duì)照品溶液。展開(kāi)劑：以CHCl3-CH3COOC2H5-CH3OH-H2O（15：10：22：40）在10℃以下放置分層后的下層溶液，作為展開(kāi)劑。2.1.2鑒別操作取2.2.1配制溶液各2ul，使用點(diǎn)樣針點(diǎn)樣于同一硅膠薄層G板。將硅膠板放入已使用展開(kāi)劑飽和的展開(kāi)缸中，注意觀察并記錄薄層展開(kāi)情況。待展開(kāi)劑距離薄層板上部1cm時(shí)取出，干燥后浸入10%硫酸乙醇，放入105℃恒溫干燥箱，待斑點(diǎn)顯色清晰，分別在日光及紫外光365nm下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1（A、B），得供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)。12SS’312SS’12SS’312SS’3AB(1.供試品1907012.供試品1907023.供試品190703S.對(duì)照藥材S’.陰性對(duì)照)A.日光下檢視圖B.紫外365nm下檢視圖圖1：婦血寧膠囊薄層色譜2.2人參皂苷Rg1含量測(cè)定（HPLC法）[8,11，12]2.2.1供試品溶液提取方法考察供試品溶液制備：通過(guò)收集查閱三七藥材有效成分提取相關(guān)資料，篩選出4種供試品處理方法（①三七標(biāo)準(zhǔn)法、②超聲法、③云南白藥膠囊法、④三七傷藥膠囊法）進(jìn)行考察，HPLC法含量測(cè)定結(jié)果匯總?cè)缦?見(jiàn)表1)：表1：婦血寧膠囊人參皂苷Rg1含量測(cè)定（水分：5.16%）樣品名稱峰面積(A)平均值（A）樣品濃度（mg/ml）取樣量(g)稀釋體積（mv）膠囊平均片重(g)含量(mg/粒)平均值(mg/粒)人參皂苷Rg11657.339111688.497010.5094/////1702.59497/////1700.34717/////1693.70679/////1692.53784/////三七標(biāo)準(zhǔn)法1-11795.09131/0.54161.0157500.499413.313713.6223三七標(biāo)準(zhǔn)法1-21884.77979/0.56861.0192500.499413.9309超聲法1-11752.75500/0.52880.9833500.499413.428013.2342超聲法1-21723.11194/0.51980.9954500.499413.0405云南白藥膠囊法1-19001.11523/2.71551.0024100.499413.528913.4812云南白藥膠囊法1-28952.76953/2.70091.0041100.499413.4335三七傷藥膠囊法1-34411.16650/1.33081.0466200.499412.700212.9323三七傷藥膠囊法1-44440.01807/1.33951.0163200.499413.1644對(duì)照品溶液制備：使用電子分析天平稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品，保證稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一，以甲醇為溶劑，制成人參皂苷Rg1對(duì)照品（0.5mg/ml）的對(duì)照品溶液。陰性對(duì)照品溶液：同供試品溶液制備。（陰性對(duì)照品：按本品種處方，缺少三七，其他藥材組成不變，按藥品生產(chǎn)工藝生產(chǎn)陰性對(duì)照品。）2.2.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（1）分離度考察：使用電子分析天平稱取稱取供試品（批號(hào)：190701）兩次，保證稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一①0.9918g，②1.0477g，依法操作。HPLC法測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)下表（表2，表3），結(jié)果顯示人參皂苷Rg1與周圍色譜峰分離度達(dá)到1.5以上，符合要求。表2：表3：（2）重復(fù)性考察：準(zhǔn)備供試品6份，照試驗(yàn)所得方法測(cè)定。HPLC法測(cè)量含量數(shù)據(jù)匯總見(jiàn)表4，數(shù)據(jù)計(jì)算得人參皂苷Rg1的，符合要求。表4:對(duì)照品溶液重復(fù)性考察試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)（次）含量（mg/g）平均值（mg/g）127.5227.62227.31327.88427.70527.75627.58專屬性考察：準(zhǔn)備對(duì)照品溶液，高效液相色譜儀中進(jìn)樣10μ1測(cè)定，樣品溶液與陰性樣品溶液同操作，得色譜圖(見(jiàn)圖2、圖3、圖4)。圖2：對(duì)照品（人參皂苷Rg1）圖譜圖3：樣品（婦血寧膠囊）圖譜圖4：陰性圖譜2.2.3線性使用電子分析天平稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品（含量以92.4%計(jì)）保證稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一，以甲醇為稀釋劑，配制濃度為1.0185、0.7639、0.5093、0.2546、0.1273mg/ml的溶液。進(jìn)樣10ul，記錄數(shù)據(jù)，匯總繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)：質(zhì)量濃度；縱坐標(biāo)：峰面積，見(jiàn)圖5），同時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得回歸方程:，于間線性良好，符合規(guī)定。圖5：婦血寧膠囊線性關(guān)系考察圖2.2.4精密度準(zhǔn)備對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，匯總HPLC法測(cè)定各次數(shù)對(duì)應(yīng)峰面積數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表5），計(jì)算得，結(jié)果表明符合要求。表5：對(duì)照品溶液精密度試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)（次）峰面積（A）平均值（A）11689.772581681.1945821702.5949731700.3471741657.3391151692.5378461693.706792.2.5穩(wěn)定性準(zhǔn)備1份供試品溶液，25℃±2℃下放置0,2,4,6,8,10,12h后以10μL進(jìn)樣，匯總HPLC法各放置時(shí)間下測(cè)定峰面積數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表6），計(jì)算得，結(jié)果表明供試品放置12h內(nèi)溶液狀態(tài)穩(wěn)定。表6：供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)間（h）峰面積(A)平均值(A)01715.941771712.0006821724.4364041706.8713461731.8966181701.93652101705.92236121696.999762.2.6準(zhǔn)確度（加樣回收率試樣）準(zhǔn)備每份約0.50g的已知含量供試品9份，使用電子分析天平保證稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一，移液管量取加入對(duì)照品溶液，配制試驗(yàn)梯度（50%、100%、150%）測(cè)定，匯總HPLC法測(cè)定數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表7），回收率范圍以本法測(cè)定得98.6%-103.1%，計(jì)算得平均100.7%，RSD=1.51%，結(jié)果表明符合要求。表7：供試品溶液準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)梯度取樣量（g）樣品含人參皂苷Rg1（mg）對(duì)照品加量（mg）測(cè)得總量（mg）回收率（%）50%0.508613.924466.408920.5301587103.150%0.502213.750066.408920.2032067100.750%0.498013.635616.408920.2118374102.6100%0.505213.8332913.102926.885635699.6100%0.486913.3308813.102926.4284049100.0100%0.516514.1404813.102927.3498331100.8150%0.499313.6714819.944633.341475598.6150%0.517114.1577319.944633.83557798.7150%0.487613.349519.944633.6654683101.92.2.7耐用性（1）不同品牌的同類型色譜柱：控制其他變量，考察AgilentZORBAXSB-185um4.6×250mm、waterssymmetryshieldR185um4.6×250mm、SHISEIDOCAPCELLPAKC18MGⅡ5um4.6×250mm三種類型色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。匯總HPLC法測(cè)定數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表8），結(jié)果表明這三種色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。表8：色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果影響的考察結(jié)果色譜柱實(shí)驗(yàn)溶液保留時(shí)間（min）峰面積平均值峰面積比值（供試品/對(duì)照品）理論板數(shù)AgilentZORBAXSB-185um4.6×250mm對(duì)照品26.6931760.540771758.268741.0271176926.7681755.9967011772婦血寧供試品26.3461819.747311805.8128651207826.6621791.8784211612waterssymmetryshieldR185um4.6×250mm對(duì)照品34.6541689.772581696.1837751.018852934.4451702.594978684婦血寧供試品34.0821688.056401727.22626512934.4141775.498295312SHISEIDOCAPCELLPAKC18MGⅡ5um4.6×250mm對(duì)照品41.1581646.314581689.451541.002939041.0711732.588508744婦血寧供試品41.0211727.796261692.81766897440.7771690.0964410499（2）柱溫：控制其他變量，考察柱溫于25°C、30°C、35°C下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。匯總HPLC法測(cè)定數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表9），結(jié)果表明柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。表9：柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果影響的考察結(jié)果柱溫（°C）實(shí)驗(yàn)溶液保留時(shí)間（min）峰面積（A）平均值（A）峰面積比值（供試品/對(duì)照品）理論板數(shù)25.0對(duì)照品35.3071668.862181718.11670677735.1091767.371227105婦血寧供試品34.9031749.697391745.677801.016041695234.7451741.65820614230.0對(duì)照品34.6541689.7725816964451702.594978684婦血寧供試品34.0821688.056401731.777351.020985512934.4141775.49829531235.0對(duì)照品33.9321741.7899217378451732.588506226婦血寧供試品34.2371690.708371698.139400.977521631134.0881705.570436257（3）流速：控制其他變量，考察流速分別在0.80、1.00、1.20（ml/min）下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。匯總HPLC法測(cè)定數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表10），結(jié)果表明流速對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。表10：流速對(duì)測(cè)定結(jié)果影響的考察結(jié)果流速（ml/min）實(shí)驗(yàn)溶液保留時(shí)（min）峰面積平均值峰面積比值（供試品/對(duì)照品）理論板數(shù)0.80對(duì)照品40.8322044.108402046.620491.04552040.8542049.132575466婦血寧供試品40.8592121.3918521230072124.8750051921.00對(duì)照品34.6541689.772581696.183781.02852934.4451702.594978684婦血寧供試品34.0821688.056401731.77735512934.4141775.4982953121.20對(duì)照品27.9051366.727291387.153811.04486727.8921407.580324715婦血寧供試品27.9311448.366211449.50116458729.2571450.6361168842.2.8供試品的含量測(cè)定及含量限度準(zhǔn)備6份供試品溶液（使用電子分析天平稱取本品三種不同批號(hào)的供試品，各2份，保證稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一）測(cè)定含量。匯總HPLC法測(cè)定數(shù)據(jù)如下表（見(jiàn)表11），確定本品含量限度為：人參皂苷Rg1（C42H72O14）含量≥10.27mg/粒。表11：人參皂苷Rg1含量測(cè)定結(jié)果批號(hào)峰面積（A）取樣量（g）含量（mg/g）平均值（mg/g）含量（mg/粒）平均值(mg/粒)201907011725.034911.011425.715525.636912.803012.83771718.885501.014025.5582201907021737.803341.018525.725325.777512.87331723.100101.005825.8297201907031702.944090.996825.758125.704212.83671727.633421.015525.65033討論3.1三七薄層色譜（1）提取方法選擇：在醫(yī)院制劑婦血寧的標(biāo)準(zhǔn)研究實(shí)驗(yàn)中，薄層色譜實(shí)驗(yàn)考察過(guò)羊藿三七膠囊標(biāo)