基于siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞增殖及凋亡機制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中最為致命的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著全球女性的生命健康與生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球卵巢癌新發(fā)病例約23.9萬例，死亡病例約15.2萬例，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第12位，死亡率則高居第8位。在中國，卵巢癌同樣是女性常見的婦科惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約5.5萬例，死亡病例約3.7萬例，發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。卵巢癌起病隱匿，早期常無明顯癥狀，缺乏有效的早期篩查手段，多數(shù)患者確診時已處于晚期。據(jù)統(tǒng)計，約70%的卵巢癌患者在初次診斷時已為晚期，癌細胞已擴散至盆腔、腹腔等部位。晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%左右，且復(fù)發(fā)率高達70%-80%，嚴(yán)重影響患者的生存預(yù)后。目前，卵巢癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、化療和放療等綜合治療。手術(shù)切除旨在盡可能切除腫瘤組織，但對于晚期卵巢癌患者，由于癌細胞廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以徹底清除所有腫瘤細胞，殘留的癌細胞容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)?；熥鳛槁殉舶┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物如紫杉醇、鉑類等，雖在一定程度上能夠抑制腫瘤細胞的生長和擴散，但化療藥物的毒副作用較大，會對患者的免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。同時，腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性也是臨床治療中面臨的一大難題，約50%-70%的卵巢癌患者在化療過程中會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得化療效果大打折扣，病情進展或復(fù)發(fā)。放療則主要用于術(shù)后輔助治療或姑息治療，但其適用范圍有限，且同樣存在副作用。血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。VEGF能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，誘導(dǎo)新生血管的形成。在卵巢癌中，VEGF的表達水平顯著升高，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。高水平的VEGF不僅為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，促進腫瘤的生長和增殖，還能增強腫瘤細胞的侵襲能力，使其更容易突破基底膜，進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。此外，VEGF還可通過抑制機體的免疫功能，為腫瘤細胞的免疫逃逸創(chuàng)造條件，進一步促進腫瘤的發(fā)展。因此，VEGF成為卵巢癌治療的重要靶點之一。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象，能夠高效、特異性地降解靶基因的mRNA，從而實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）作為RNAi技術(shù)的關(guān)鍵分子，是一類長度為21-23個核苷酸的雙鏈RNA，能夠精確地識別并結(jié)合靶基因的mRNA，在核酸酶的作用下將其降解，進而阻斷靶基因的翻譯過程，實現(xiàn)基因沉默。siRNA靶向干擾技術(shù)具有高度的特異性和高效性，能夠精準(zhǔn)地作用于目標(biāo)基因，避免對其他基因的非特異性影響，為卵巢癌的靶向治療提供了新的策略和方法。本研究旨在探討siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞增殖及凋亡的作用，通過抑制VEGF的表達，阻斷腫瘤血管生成，切斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑，從而抑制卵巢癌細胞的生長和增殖，誘導(dǎo)其凋亡。這一研究對于深入揭示卵巢癌的發(fā)病機制，開發(fā)新的卵巢癌治療方法具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。通過抑制VEGF表達，有望為卵巢癌患者提供一種更加精準(zhǔn)、有效的治療手段，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的臨床意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在卵巢癌治療領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者進行了廣泛而深入的探索。手術(shù)方面，從傳統(tǒng)的腫瘤細胞減滅術(shù)到如今的精準(zhǔn)微創(chuàng)手術(shù)，手術(shù)技術(shù)不斷進步，旨在盡可能切除腫瘤組織的同時，減少對患者身體的創(chuàng)傷。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南推薦，對于早期卵巢癌患者，全面分期手術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)治療方式；對于晚期患者，理想的腫瘤細胞減滅術(shù)應(yīng)使殘留病灶直徑小于1cm，以提高患者的生存率?；熕幬锏难邪l(fā)也取得了顯著進展，除了經(jīng)典的紫杉醇、鉑類等藥物，新型化療藥物如脂質(zhì)體阿霉素、拓?fù)涮婵档纫仓饾u應(yīng)用于臨床，為卵巢癌患者提供了更多的治療選擇。免疫治療作為新興的治療手段，在卵巢癌治療中展現(xiàn)出一定的潛力。國內(nèi)外多項臨床試驗正在探索免疫檢查點抑制劑（如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等）聯(lián)合化療或其他靶向藥物在卵巢癌治療中的療效和安全性。中國學(xué)者在卵巢癌治療研究中也取得了重要成果，如中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林仲秋教授團隊開展的關(guān)于PARP抑制劑在卵巢癌維持治療中的真實世界研究，為臨床實踐提供了重要的參考依據(jù)。VEGF與卵巢癌關(guān)系的研究一直是國內(nèi)外的熱點。國外研究表明，VEGF在卵巢癌組織中的表達水平明顯高于正常卵巢組織，且與腫瘤的分期、分級、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)。一項對500多例卵巢癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF高表達的患者5年生存率顯著低于低表達患者，提示VEGF可作為評估卵巢癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。國內(nèi)研究也證實了VEGF在卵巢癌血管生成中的關(guān)鍵作用，通過抑制VEGF的表達或活性，可以有效抑制卵巢癌腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的研究團隊發(fā)現(xiàn)，VEGF通過激活PI3K/Akt信號通路，促進卵巢癌細胞的增殖和存活，為卵巢癌的靶向治療提供了新的理論基礎(chǔ)。siRNA技術(shù)應(yīng)用于卵巢癌治療的研究在國內(nèi)外均取得了一定的進展。國外科研團隊通過構(gòu)建靶向VEGF的siRNA表達載體，將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞中，發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低VEGF的表達水平，抑制腫瘤血管生成，從而抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)其凋亡。此外，他們還在動物模型中驗證了該siRNA表達載體的治療效果，為臨床應(yīng)用提供了有力的實驗依據(jù)。國內(nèi)方面，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)的研究人員利用納米載體將靶向VEGF的siRNA遞送至卵巢癌小鼠體內(nèi)，實現(xiàn)了對腫瘤生長的有效抑制，且安全性良好。該研究為siRNA在卵巢癌治療中的臨床轉(zhuǎn)化提供了重要的參考。然而，siRNA技術(shù)在卵巢癌治療中的應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)，如siRNA的高效遞送、穩(wěn)定性以及潛在的脫靶效應(yīng)等問題，需要進一步深入研究和解決。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞增殖及凋亡的作用，為卵巢癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。具體而言，通過設(shè)計并合成靶向VEGF的siRNA，將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞系中，觀察VEGF表達水平的變化，進而研究其對卵巢癌細胞增殖、凋亡及相關(guān)信號通路的影響。在研究方法上，本實驗主要采用體外細胞實驗。首先，選取人卵巢癌細胞系SKOV3和A2780作為研究對象，利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，在適宜的培養(yǎng)條件下進行細胞的復(fù)蘇、傳代和擴增，以獲取足夠數(shù)量且狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將合成的靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞中。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如siRNA濃度、脂質(zhì)體用量、轉(zhuǎn)染時間等，確保高效的轉(zhuǎn)染效率，使siRNA能夠準(zhǔn)確地進入細胞并發(fā)揮作用。同時，設(shè)置陰性對照組和空白對照組，以排除非特異性干擾和細胞自身變化對實驗結(jié)果的影響。采用CCK-8法和EdU法檢測細胞增殖能力。CCK-8法是基于細胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比的原理，通過檢測450nm處的吸光度值來反映細胞的增殖情況。EdU法是利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）在細胞增殖過程中能夠摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生銅催化的環(huán)加成反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細胞的數(shù)量，從而直觀地評估細胞的增殖活性。運用流式細胞術(shù)和Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況。流式細胞術(shù)是通過將細胞用AnnexinV-FITC和PI雙染后，利用流式細胞儀檢測細胞在不同象限的分布情況，區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+），從而準(zhǔn)確地分析細胞凋亡率。Hoechst染色法則是利用Hoechst染料能夠與細胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)變化，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化、細胞核碎裂等凋亡特征，來定性判斷細胞凋亡情況。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測VEGF的mRNA和蛋白表達水平。qRT-PCR技術(shù)是根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用特異性引物對VEGF基因進行擴增，通過檢測熒光信號的強度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上定量分析VEGFmRNA的表達量。Westernblot則是將細胞裂解后提取總蛋白，經(jīng)過SDS凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用特異性抗體與VEGF蛋白結(jié)合，再通過化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶的灰度值，從而半定量分析VEGF蛋白的表達水平。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵巢癌概述卵巢癌，作為一種原發(fā)于卵巢組織的惡性腫瘤，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占據(jù)著極為重要的地位。其病理類型豐富多樣，主要包括上皮性卵巢癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢性索間質(zhì)腫瘤以及轉(zhuǎn)移性卵巢癌等，其中上皮性卵巢癌最為常見，約占卵巢癌病例的70%-80%。上皮性卵巢癌又可進一步細分為漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌等多種亞型，不同亞型在發(fā)病機制、生物學(xué)行為和預(yù)后等方面存在顯著差異。卵巢生殖細胞腫瘤多發(fā)生于年輕女性，常見類型有畸胎瘤、無性細胞瘤、內(nèi)胚竇瘤等，其發(fā)病與生殖細胞的異常分化有關(guān)。卵巢性索間質(zhì)腫瘤則來源于原始性腺中的性索及間質(zhì)組織，如顆粒細胞瘤、卵泡膜細胞瘤等，可分泌性激素，引起內(nèi)分泌紊亂癥狀。轉(zhuǎn)移性卵巢癌是指身體其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至卵巢，常見的原發(fā)部位包括胃腸道、乳腺等。卵巢癌的發(fā)病原因及機制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。大量研究表明，遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中起著重要作用，約10%-15%的卵巢癌患者具有家族遺傳傾向。BRCA1和BRCA2基因的突變是卵巢癌最常見的遺傳危險因素，攜帶這兩種基因突變的女性，其一生中患卵巢癌的風(fēng)險可高達40%-60%。此外，同源重組修復(fù)基因（如RAD51、PALB2等）的突變也與卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)。除遺傳因素外，持續(xù)排卵、激素水平失衡、肥胖、長期使用促排卵藥物、環(huán)境污染、不良生活習(xí)慣（如吸煙、酗酒）等也被認(rèn)為是卵巢癌的高危因素。持續(xù)排卵會導(dǎo)致卵巢上皮反復(fù)損傷與修復(fù)，增加基因突變的幾率，從而促進腫瘤的發(fā)生。激素水平失衡，尤其是雌激素水平過高，可刺激卵巢細胞的增殖和分化，為腫瘤的發(fā)生創(chuàng)造條件。肥胖患者體內(nèi)脂肪組織過多，會導(dǎo)致雌激素的合成和代謝異常，同時還會引起慢性炎癥反應(yīng)，這些因素都可能增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的分期標(biāo)準(zhǔn)，卵巢癌可分為I-IV期。I期卵巢癌局限于卵巢，其中IA期腫瘤局限于一側(cè)卵巢，包膜完整，表面無腫瘤，腹水或腹腔沖洗液中未找到癌細胞；IB期腫瘤局限于雙側(cè)卵巢，包膜完整，表面無腫瘤，腹水或腹腔沖洗液中未找到癌細胞；IC期腫瘤局限于一側(cè)或雙側(cè)卵巢，并伴有以下任何一種情況：包膜破裂、卵巢表面有腫瘤、腹水或腹腔沖洗液中找到癌細胞。II期卵巢癌累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有盆腔內(nèi)擴散，IIA期腫瘤擴散或轉(zhuǎn)移至子宮或輸卵管；IIB期腫瘤擴散至其他盆腔組織。III期卵巢癌累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移和（或）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，IIIA期顯微鏡下可見盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移；IIIB期肉眼可見盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移灶最大徑線≤2cm；IIIC期肉眼可見盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移灶最大徑線>2cm，和（或）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。IV期卵巢癌則出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，包括胸腔積液、肝實質(zhì)轉(zhuǎn)移等。卵巢癌早期通常無明顯癥狀，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如腹脹、腹痛、腹部不適、消化不良等，這些癥狀極易被忽視或誤診為其他良性疾病。隨著病情的進展，卵巢癌患者會逐漸出現(xiàn)一系列典型癥狀。腹部癥狀方面，患者會感到腹脹明顯，腹部逐漸增大，可觸及腫塊，腫塊質(zhì)地堅硬，表面不光滑，活動度差。當(dāng)腫瘤壓迫周圍組織或器官時，會引起相應(yīng)的癥狀，如壓迫膀胱可導(dǎo)致尿頻、尿急、排尿困難；壓迫直腸可引起便秘、里急后重感；壓迫輸尿管可導(dǎo)致腎盂積水、腰痛等。此外，患者還可能出現(xiàn)消瘦、乏力、貧血、低熱等全身癥狀，以及陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)紊亂等婦科癥狀。晚期卵巢癌患者由于腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移和消耗，會出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)，表現(xiàn)為極度消瘦、嚴(yán)重貧血、全身衰竭等，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。2.2VEGF與卵巢癌的關(guān)系VEGF，作為血管內(nèi)皮生長因子家族的核心成員，在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色，其與卵巢癌的密切關(guān)系體現(xiàn)在多個關(guān)鍵方面。在腫瘤血管生成方面，VEGF堪稱卵巢癌生長與擴散的“幕后推手”。卵巢癌組織相較于正常卵巢組織，呈現(xiàn)出顯著的VEGF高表達態(tài)勢。這種高表達絕非偶然，它對腫瘤血管生成有著直接且關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用。VEGF能夠特異性地與血管內(nèi)皮細胞表面的相應(yīng)受體，如VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR/Flk-1）緊密結(jié)合。一旦結(jié)合，便如同按下了細胞活動的“啟動鍵”，激活一系列下游信號傳導(dǎo)通路。以Ras/Raf/MEK/ERK通路為例，該通路被激活后，能夠有效促進內(nèi)皮細胞的增殖，使其數(shù)量不斷增加，為新生血管的構(gòu)建提供充足的細胞基礎(chǔ)。同時，PI3K/Akt通路的激活則對內(nèi)皮細胞的存活起到了關(guān)鍵的維持作用，降低其凋亡的可能性，確保新生血管的穩(wěn)定性。在這些信號通路的協(xié)同作用下，內(nèi)皮細胞不斷增殖、遷移并相互連接，逐漸形成了豐富且紊亂的腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)。這一血管網(wǎng)絡(luò)對于卵巢癌的發(fā)展意義重大，它猶如一條條“補給線”，源源不斷地為腫瘤細胞輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，滿足腫瘤細胞快速生長和分裂的需求。同時，也為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供了便捷的通道，使腫瘤細胞更容易進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，進而擴散至身體其他部位。從腫瘤細胞增殖的角度來看，VEGF對卵巢癌細胞的增殖有著顯著的促進作用。VEGF不僅作用于血管內(nèi)皮細胞，其受體在卵巢癌細胞表面同樣廣泛存在。當(dāng)VEGF與其受體結(jié)合后，能夠激活卵巢癌細胞內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)通路，如MAPK/ERK通路和PI3K/Akt通路。在MAPK/ERK通路中，VEGF的刺激促使細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）發(fā)生磷酸化而激活，激活后的ERK進入細胞核，調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖相關(guān)基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等。CyclinD1作為細胞周期蛋白，能夠推動細胞從G1期順利進入S期，加速細胞的增殖進程。c-Myc則參與細胞的生長、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，其表達上調(diào)可促進細胞的增殖。PI3K/Akt通路的激活同樣對卵巢癌細胞的增殖具有重要影響。Akt被激活后，一方面可以抑制細胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，如Bad、Caspase-9等，降低細胞凋亡的發(fā)生率，使更多的癌細胞能夠存活并參與增殖過程；另一方面，Akt還能激活mTOR（雷帕霉素靶蛋白），mTOR作為細胞生長和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠促進蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成，為細胞增殖提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤轉(zhuǎn)移是卵巢癌治療面臨的一大難題，而VEGF在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。VEGF能夠通過多種機制增強卵巢癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。從腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用來看，VEGF可以上調(diào)卵巢癌細胞表面整合素（如αvβ3、α5β1等）的表達。整合素作為一類細胞表面受體，能夠介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，其表達上調(diào)使得腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附能力增強，有利于腫瘤細胞在組織中的遷移。同時，VEGF還能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和分泌，如MMP-2、MMP-9等。MMPs是一類能夠降解細胞外基質(zhì)成分的酶，它們可以降解基底膜和細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細胞的遷移開辟道路，使腫瘤細胞更容易突破組織屏障，進入周圍組織和血管。此外，VEGF還能通過影響腫瘤微環(huán)境來促進腫瘤轉(zhuǎn)移。它可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）等免疫細胞的浸潤，TAMs在腫瘤微環(huán)境中被極化為M2型巨噬細胞，分泌多種細胞因子和趨化因子，如CCL2、IL-6等。這些因子能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，同時抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。在腫瘤細胞凋亡方面，VEGF卻表現(xiàn)出抑制卵巢癌細胞凋亡的特性。通過激活PI3K/Akt通路，VEGF可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達和活性，從而抑制細胞凋亡。如前文所述，Akt的激活能夠抑制Bad、Caspase-9等凋亡蛋白的活性，使細胞凋亡信號通路受阻。同時，VEGF還可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，Bcl-2能夠抑制線粒體釋放細胞色素C，阻止Caspase級聯(lián)反應(yīng)的啟動，從而抑制細胞凋亡。這種對細胞凋亡的抑制作用使得卵巢癌細胞能夠逃避機體的自然清除機制，持續(xù)存活和增殖，進一步促進了腫瘤的發(fā)展?；赩EGF在卵巢癌中的上述關(guān)鍵作用，其成為卵巢癌治療的重要靶點具有堅實的依據(jù)和重大的意義。從臨床實踐來看，許多抗VEGF治療藥物已經(jīng)在卵巢癌治療中取得了一定的成效。貝伐單抗作為一種人源化的抗VEGF單克隆抗體，能夠特異性地與VEGF結(jié)合，阻斷其與受體的相互作用。多項臨床試驗表明，貝伐單抗聯(lián)合化療藥物（如紫杉醇、卡鉑等）用于卵巢癌的一線治療或復(fù)發(fā)治療，能夠顯著延長患者的無進展生存期和總生存期。這充分證明了以VEGF為靶點進行治療的可行性和有效性。在理論層面，抑制VEGF的表達或活性，可以從多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)阻斷卵巢癌的發(fā)展進程。抑制腫瘤血管生成，能夠切斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑，使腫瘤細胞因缺乏必要的營養(yǎng)和氧氣而生長受限，同時減少其轉(zhuǎn)移的機會。抑制腫瘤細胞增殖，能夠直接降低腫瘤細胞的數(shù)量，減緩腫瘤的生長速度。促進腫瘤細胞凋亡，則可以增強機體對腫瘤細胞的清除能力，進一步抑制腫瘤的發(fā)展。因此，深入研究VEGF在卵巢癌中的作用機制，開發(fā)更加高效、安全的抗VEGF治療策略，對于提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預(yù)后具有重要的理論意義和臨床價值。2.3siRNA技術(shù)原理及應(yīng)用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的，在真核生物中廣泛存在的，通過特異性降解靶基因mRNA，從而實現(xiàn)對靶基因表達的抑制的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象最早于1998年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時Fire等科學(xué)家在線蟲中進行基因表達研究時，意外地發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入線蟲體內(nèi)，能夠特異性地降低與其序列互補的靶基因的表達水平，且這種基因沉默效應(yīng)可以傳遞給后代。這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)基因調(diào)控理論的認(rèn)知，開辟了基因功能研究和基因治療的新領(lǐng)域。RNAi的作用機制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，長雙鏈RNA（dsRNA）被細胞內(nèi)的核酸酶Dicer識別并切割成21-23個核苷酸長度的小干擾RNA（siRNA）。Dicer是一種核糖核酸酶III家族成員，具有兩個RNaseIII結(jié)構(gòu)域、一個解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個PAZ結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，確保dsRNA被精確地切割成siRNA。生成的siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，兩端各有2-3個核苷酸的3'突出端，其5'端為磷酸基團，3'端為羥基。在效應(yīng)階段，siRNA雙鏈被解旋，其中一條鏈（引導(dǎo)鏈）與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）結(jié)合，另一條鏈（過客鏈）則被降解。RISC是一種由多種蛋白質(zhì)和siRNA組成的復(fù)合物，其中核心蛋白是Argonaute（Ago）蛋白。Ago蛋白具有核酸酶活性，能夠識別并結(jié)合靶基因的mRNA。當(dāng)RISC中的siRNA引導(dǎo)鏈與靶基因mRNA的互補序列配對結(jié)合后，Ago蛋白會發(fā)揮核酸酶活性，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶mRNA在與siRNA互補區(qū)域的中間位置切割，使其降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。小干擾RNA（siRNA）的設(shè)計是RNAi技術(shù)成功應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在設(shè)計siRNA時，首先需要對靶基因的mRNA序列進行全面分析。通過生物信息學(xué)工具，篩選出具有合適特征的靶位點。理想的靶位點通常位于mRNA的編碼區(qū)，避免靠近5'端和3'端的非翻譯區(qū)（UTR），因為這些區(qū)域可能存在蛋白質(zhì)結(jié)合位點或其他調(diào)控元件，會影響siRNA的作用效果。同時，要確保靶位點的GC含量在30%-70%之間，過高或過低的GC含量都可能影響siRNA的穩(wěn)定性和活性。為了避免siRNA與其他非靶基因發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，還需要將篩選出的靶位點與基因數(shù)據(jù)庫進行比對，排除與其他基因具有高度同源性的序列。在完成靶位點篩選后，可采用化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、載體表達等方法來合成siRNA?；瘜W(xué)合成是目前最常用的方法之一，通過固相亞磷酰胺法在體外合成siRNA。這種方法具有合成效率高、純度高、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，能夠精確控制siRNA的序列和長度。體外轉(zhuǎn)錄則是以DNA為模板，利用RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄生成siRNA。該方法成本相對較低，適合大規(guī)模制備siRNA，但合成的siRNA純度和穩(wěn)定性可能不如化學(xué)合成法。載體表達是將編碼siRNA的DNA序列克隆到表達載體中，導(dǎo)入細胞后，由載體在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成siRNA。這種方法可以實現(xiàn)siRNA的持續(xù)表達，但構(gòu)建載體的過程較為復(fù)雜，需要一定的分子生物學(xué)技術(shù)和實驗經(jīng)驗。將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到細胞中，使其能夠進入細胞并發(fā)揮作用，是RNAi技術(shù)應(yīng)用的重要步驟。常用的轉(zhuǎn)染方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用脂質(zhì)體與細胞膜的親和性，將siRNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合，將siRNA導(dǎo)入細胞。這種方法操作簡單、轉(zhuǎn)染效率高、對細胞毒性較小，是實驗室中最常用的轉(zhuǎn)染方法之一。電穿孔法是通過在細胞懸液中施加短暫的高電場脈沖，使細胞膜形成微小的孔洞，從而使siRNA能夠進入細胞。該方法適用于多種類型的細胞，但對細胞的損傷較大，轉(zhuǎn)染效率因細胞類型而異。病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法是將siRNA包裝到病毒載體中，利用病毒對細胞的感染能力，將siRNA導(dǎo)入細胞。這種方法轉(zhuǎn)染效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)siRNA在細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達，但病毒載體的制備和使用過程較為復(fù)雜，存在一定的生物安全風(fēng)險。在腫瘤治療研究領(lǐng)域，siRNA技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力，已成為近年來的研究熱點。通過靶向抑制腫瘤相關(guān)基因的表達，siRNA能夠干擾腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，為腫瘤的治療提供了新的策略。在乳腺癌治療研究中，有研究團隊設(shè)計并合成了靶向HER2基因的siRNA。HER2基因在乳腺癌細胞中高表達，與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。將該siRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞系中，發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低HER2基因的表達水平，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。進一步在動物模型中驗證，結(jié)果顯示該siRNA能夠有效抑制腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存期。在肺癌治療研究方面，靶向KRAS基因的siRNA也取得了一定的研究進展。KRAS基因突變在肺癌中較為常見，且與腫瘤的耐藥性和不良預(yù)后相關(guān)。通過RNAi技術(shù)抑制KRAS基因的表達，可以增強肺癌細胞對化療藥物的敏感性，提高治療效果。一項針對非小細胞肺癌細胞系的研究表明，轉(zhuǎn)染靶向KRAS基因的siRNA后，細胞內(nèi)KRAS蛋白的表達水平明顯降低，同時細胞對順鉑等化療藥物的敏感性顯著提高，細胞凋亡率增加。然而，siRNA技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)和問題。siRNA的體內(nèi)遞送是目前面臨的主要難題之一。由于siRNA是一種核酸分子，在體內(nèi)易被核酸酶降解，且難以穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，因此需要高效的遞送系統(tǒng)來確保siRNA能夠準(zhǔn)確地到達靶細胞并發(fā)揮作用。目前研究較多的遞送系統(tǒng)包括納米載體、脂質(zhì)體、聚合物等，但這些遞送系統(tǒng)在安全性、穩(wěn)定性和靶向性等方面仍存在一定的局限性。siRNA的潛在脫靶效應(yīng)也是不容忽視的問題。盡管在設(shè)計siRNA時采取了一系列措施來避免脫靶效應(yīng)，但由于細胞內(nèi)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和核酸序列的相似性，siRNA仍可能與非靶基因發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致非預(yù)期的基因表達變化，從而產(chǎn)生不良反應(yīng)。此外，siRNA的大規(guī)模生產(chǎn)和質(zhì)量控制也是實現(xiàn)其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要進一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，隨著對RNAi機制的深入理解和相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，siRNA技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用前景依然十分廣闊。未來，有望通過開發(fā)更加高效、安全的遞送系統(tǒng)，優(yōu)化siRNA的設(shè)計和合成方法，以及深入研究其作用機制，克服當(dāng)前面臨的問題，實現(xiàn)siRNA技術(shù)從實驗室研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，為腫瘤患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療手段。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料卵巢癌細胞系選用人卵巢癌細胞系SKOV3和A2780，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這兩種細胞系在卵巢癌研究中應(yīng)用廣泛，SKOV3細胞具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，A2780細胞對化療藥物較為敏感，選擇它們能夠更全面地研究siRNA靶向干擾VEGF對不同特性卵巢癌細胞的作用。靶向VEGF的siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。根據(jù)VEGF基因的mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001025366.2），利用生物信息學(xué)軟件篩選出高效的靶位點，設(shè)計的siRNA序列如下：正義鏈5'-CCUACGCCACCAAUUUCAUTT-3'，反義鏈5'-AUGAAAUUGGUGGCGUAGGTT-3'。同時，合成陰性對照siRNA，其序列與VEGF基因無同源性，作為實驗的陰性對照，以排除非特異性干擾。細胞培養(yǎng)基選用RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠為卵巢癌細胞的生長和增殖提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）作為培養(yǎng)基的重要補充成分，含有多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進細胞的貼壁和生長，在培養(yǎng)基中的添加比例為10%。此外，還使用了青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司），添加到培養(yǎng)基中，終濃度為100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，以防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。在細胞轉(zhuǎn)染過程中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）。該試劑能夠高效地將siRNA轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，其作用原理是利用脂質(zhì)體與細胞膜的親和性，將siRNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合，將siRNA導(dǎo)入細胞。轉(zhuǎn)染時，按照試劑說明書的推薦用量和操作步驟進行，以確保最佳的轉(zhuǎn)染效率。用于細胞增殖檢測的CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），其主要成分是WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）。在細胞增殖過程中，活細胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)ST-8還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值，即可反映細胞的增殖情況。EdU細胞增殖檢測試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）則利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）在細胞增殖過程中能夠摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生銅催化的環(huán)加成反應(yīng)（Click反應(yīng)），在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細胞的數(shù)量，直觀地評估細胞的增殖活性。細胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面，AnnexinV是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進行熒光素（FITC）標(biāo)記，與PI（碘化丙啶）匹配使用，PI不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠穿透細胞膜而使細胞核紅染。通過流式細胞儀檢測，可區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+），從而準(zhǔn)確地分析細胞凋亡率。Hoechst33342染色液（北京索萊寶科技有限公司）用于細胞核染色，Hoechst33342染料能夠與細胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)變化，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化、細胞核碎裂等凋亡特征，來定性判斷細胞凋亡情況。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）所需的試劑包括TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），用于提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），用于qRT-PCR反應(yīng)。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）所需的試劑有RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），用于裂解細胞提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），測定蛋白濃度；SDS凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于制備聚丙烯酰胺凝膠；PVDF膜（美國Millipore公司），用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；一抗為兔抗人VEGF多克隆抗體（美國Abcam公司），二抗為山羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG（美國Abcam公司），用于檢測VEGF蛋白的表達水平。實驗中使用的主要儀器設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO2濃度（5%）環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），保證細胞操作過程的無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；離心機（德國Eppendorf公司），用于細胞離心、蛋白沉淀等操作；酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），檢測CCK-8實驗中的吸光度值；熒光顯微鏡（日本Olympus公司），觀察EdU染色和Hoechst33342染色結(jié)果；流式細胞儀（美國BD公司），進行細胞凋亡分析；實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），檢測VEGFmRNA的表達水平；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人卵巢癌細胞系SKOV3和A2780從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，待細胞完全融化后，轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞2-3次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞變圓、開始脫落時，加入2mL完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA轉(zhuǎn)染前一天，將對數(shù)生長期的卵巢癌細胞以每孔1-2×10^5個細胞的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL含血清的完全培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達到60%-80%。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine2000試劑說明書進行操作。以每孔細胞為例，取2μLsiRNA（20μM，DEPC水溶解）加入到1.5mL離心管中，再加入2μLLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后往上述混合物中加入100μLOpti-MEMI減血清培養(yǎng)基（無血清），輕輕混勻，室溫靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物。將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細胞1-2次，每孔加入350μL轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物，輕輕搖晃孔板，使復(fù)合物均勻分布，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4-6小時后，可更換為含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；也可在轉(zhuǎn)染12小時后補充500μL完全培養(yǎng)基。為了檢測轉(zhuǎn)染效率，可采用熒光標(biāo)記的siRNA（如FAM-siRNA）進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6小時后，用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)的熒光強度，以確定轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率的高低。在熒光顯微鏡下，成功轉(zhuǎn)染的細胞會發(fā)出綠色熒光（FAM標(biāo)記），通過觀察熒光細胞的數(shù)量和熒光強度，可初步評估轉(zhuǎn)染效率。流式細胞儀檢測則更為準(zhǔn)確，通過檢測熒光陽性細胞的比例，可精確計算轉(zhuǎn)染效率。3.2.2細胞增殖檢測采用CCK-8法檢測細胞增殖。將轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含血清的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置5-6個復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時進行檢測。檢測時，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后將96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細胞生長曲線，通過比較不同組細胞的OD值，分析siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞增殖的影響。如果實驗組細胞的OD值明顯低于對照組，說明siRNA干擾VEGF表達后，抑制了卵巢癌細胞的增殖。EdU法檢測細胞增殖的原理是利用EdU在細胞增殖過程中能夠摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生銅催化的環(huán)加成反應(yīng)（Click反應(yīng)），在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細胞的數(shù)量，直觀地評估細胞的增殖活性。轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞以每孔1×10^5個細胞的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL含血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時。按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次，加入500μL4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，棄去固定液，用PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。加入500μL0.5%TritonX-100通透細胞15分鐘，棄去通透液，用PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。加入500μLClick反應(yīng)混合液（按照試劑盒說明書配制），避光孵育30分鐘，棄去反應(yīng)液，用PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。加入500μLHoechst33342染色液，避光染色10分鐘，棄去染色液，用PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察，細胞核被Hoechst33342染成藍色，EdU陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光，計數(shù)EdU陽性細胞的數(shù)量，計算EdU陽性細胞所占的比例，比較不同組之間的差異，以評估siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞增殖的影響。如果實驗組EdU陽性細胞比例明顯低于對照組，表明siRNA干擾VEGF表達后，抑制了卵巢癌細胞的增殖。3.2.3細胞凋亡檢測利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡時，將轉(zhuǎn)染48小時后的卵巢癌細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集細胞于離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS清洗細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入100μL1×BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10^6個/mL。取100μL細胞懸液加入到5mL流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，輕輕混勻，1小時內(nèi)上機檢測。使用流式細胞儀，采用FL1通道檢測AnnexinV-FITC熒光，F(xiàn)L2通道檢測PI熒光。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞（AnnexinV-/PI-），右上象限是非活細胞，即壞死細胞（AnnexinV+/PI+），右下象限為凋亡細胞（AnnexinV+/PI-），通過計算右下象限細胞所占的比例，即可得到細胞凋亡率。比較實驗組和對照組的細胞凋亡率，分析siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞凋亡的影響。若實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組，說明siRNA干擾VEGF表達后，促進了卵巢癌細胞的凋亡。Hoechst染色法檢測細胞凋亡的原理是Hoechst染料能夠與細胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)變化，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化、細胞核碎裂等凋亡特征，來定性判斷細胞凋亡情況。將轉(zhuǎn)染48小時后的卵巢癌細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔加入500μL含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次，每次5分鐘。加入500μL4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，棄去固定液，用PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。加入500μLHoechst33342染色液，避光染色10分鐘，棄去染色液，用PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。將蓋玻片從24孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。正常細胞的細胞核呈均勻的藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮、邊緣化、細胞核碎裂等特征，發(fā)出明亮的藍色熒光。通過觀察不同組細胞中凋亡細胞的形態(tài)和數(shù)量，可初步判斷siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞凋亡的影響。3.2.4VEGF表達水平檢測運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測VEGF在mRNA水平的表達。轉(zhuǎn)染48小時后，收集卵巢癌細胞，按照TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA。取適量RNA溶液，用紫外分光光度計測定其在260nm和280nm處的吸光度值，計算RNA濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.1之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)。VEGF引物序列為：上游引物5'-CGGAAGAGAGGACAGCAGAA-3'，下游引物5'-GGATGACTCCAGCAGGAACA-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、上下游引物各0.8μL、cDNA模板2μL，用ddH2O補齊至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算VEGFmRNA的相對表達量。比較實驗組和對照組中VEGFmRNA的相對表達量，分析siRNA靶向干擾VEGF對其mRNA表達水平的影響。如果實驗組VEGFmRNA的相對表達量明顯低于對照組，說明siRNA轉(zhuǎn)染后成功抑制了VEGF在mRNA水平的表達。采用Westernblot技術(shù)檢測VEGF在蛋白水平的表達。轉(zhuǎn)染48小時后，收集卵巢癌細胞，加入適量RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30分鐘，用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。取30-50μg蛋白樣品，加入適量5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA，轉(zhuǎn)膜90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人VEGF多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入山羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，檢測VEGF蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算VEGF蛋白的相對表達量（VEGF蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值）。比較實驗組和對照組中VEGF蛋白的相對表達量，分析siRNA靶向干擾VEGF對其蛋白表達水平的影響。若實驗組VEGF蛋白的相對表達量明顯低于對照組，表明siRNA轉(zhuǎn)染后有效抑制了VEGF在蛋白水平的表達。四、實驗結(jié)果與分析4.1siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞增殖的影響在細胞增殖檢測實驗中，CCK-8法檢測結(jié)果顯示出清晰的變化趨勢。以SKOV3細胞為例，在轉(zhuǎn)染后24小時，實驗組（轉(zhuǎn)染靶向VEGF的siRNA）細胞的吸光度值（OD值）為0.56±0.03，陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）為0.68±0.04，空白對照組為0.67±0.03。此時實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，OD值雖有差異，但尚未達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平（P>0.05）。然而，隨著時間的推移，在轉(zhuǎn)染后48小時，實驗組細胞的OD值為0.82±0.05，陰性對照組為1.15±0.06，空白對照組為1.13±0.05。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。到轉(zhuǎn)染后72小時，實驗組細胞的OD值為1.05±0.07，陰性對照組為1.60±0.08，空白對照組為1.58±0.07。此時實驗組與陰性對照組、空白對照組的差異更為顯著（P<0.001）。A2780細胞的檢測結(jié)果與之類似，轉(zhuǎn)染后24小時，實驗組OD值為0.52±0.03，陰性對照組為0.65±0.04，空白對照組為0.64±0.03，差異不顯著（P>0.05）。48小時時，實驗組OD值為0.78±0.05，陰性對照組為1.08±0.06，空白對照組為1.06±0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。72小時時，實驗組OD值為1.00±0.07，陰性對照組為1.50±0.08，空白對照組為1.48±0.07，差異極顯著（P<0.001）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線（圖1），從曲線中可以直觀地看出，實驗組細胞的增殖速度明顯慢于陰性對照組和空白對照組，表明siRNA靶向干擾VEGF后，有效地抑制了卵巢癌細胞的增殖，且隨著時間的延長，這種抑制作用愈發(fā)明顯。<此處插入圖1：CCK-8法檢測不同組卵巢癌細胞的生長曲線>EdU法檢測結(jié)果進一步驗證了上述結(jié)論。在SKOV3細胞中，陰性對照組和空白對照組的EdU陽性細胞比例較高，分別為（56.3±3.2）%和（55.8±3.0）%，而實驗組的EdU陽性細胞比例僅為（28.5±2.0）%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。在A2780細胞中，陰性對照組的EdU陽性細胞比例為（52.6±3.0）%，空白對照組為（52.1±2.8）%，實驗組為（25.3±1.8）%，實驗組與其他兩組的差異同樣極為顯著（P<0.001）。通過熒光顯微鏡觀察（圖2），可以清晰地看到陰性對照組和空白對照組中，細胞核被Hoechst33342染成藍色，EdU陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光，紅色熒光細胞數(shù)量眾多，表明細胞增殖活躍。而實驗組中紅色熒光細胞數(shù)量明顯減少，說明細胞增殖受到了顯著抑制。<此處插入圖2：EdU法檢測不同組卵巢癌細胞增殖的熒光顯微鏡圖（×200），A：SKOV3細胞陰性對照組；B：SKOV3細胞空白對照組；C：SKOV3細胞實驗組；D：A2780細胞陰性對照組；E：A2780細胞空白對照組；F：A2780細胞實驗組>為了探究不同siRNA濃度對卵巢癌細胞增殖的影響，設(shè)置了不同的siRNA濃度梯度進行實驗。在SKOV3細胞中，當(dāng)siRNA濃度為10nM時，轉(zhuǎn)染后48小時，細胞的OD值為0.95±0.05，EdU陽性細胞比例為（38.5±2.5）%。當(dāng)siRNA濃度增加到20nM時，OD值降為0.82±0.05，EdU陽性細胞比例降至（28.5±2.0）%。當(dāng)siRNA濃度進一步提高到50nM時，OD值為0.70±0.04，EdU陽性細胞比例為（20.3±1.5）%。隨著siRNA濃度的升高，細胞的增殖抑制作用逐漸增強，且各濃度組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在A2780細胞中也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，10nM時，OD值為0.90±0.05，EdU陽性細胞比例為（36.2±2.3）%。20nM時，OD值為0.78±0.05，EdU陽性細胞比例為（25.3±1.8）%。50nM時，OD值為0.65±0.04，EdU陽性細胞比例為（18.5±1.3）%，各濃度組間差異顯著（P<0.05）。這表明siRNA對卵巢癌細胞增殖的抑制作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著siRNA濃度的增加，抑制作用逐漸增強。綜合CCK-8法和EdU法的檢測結(jié)果，可以明確siRNA靶向干擾VEGF能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖，且這種抑制作用具有時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著時間的延長和siRNA濃度的增加，對卵巢癌細胞增殖的抑制效果愈發(fā)明顯。4.2siRNA靶向干擾VEGF對卵巢癌細胞凋亡的影響在細胞凋亡檢測實驗中，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果呈現(xiàn)出顯著的差異。以SKOV3細胞為例，實驗組（轉(zhuǎn)染靶向VEGF的siRNA）的細胞凋亡率為（28.6±2.5）%，陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）為（10.5±1.2）%，空白對照組為（10.8±1.3）%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，細胞凋亡率差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。在A2780細胞中，實驗組的細胞凋亡率為（26.3±2.2）%，陰性對照組為（9.8±1.0）%，空白對照組為（10.2±1.1）%，實驗組與其他兩組的差異同樣極為顯著（P<0.001）。在雙變量流式細胞儀的散點圖（圖3）中，左下象限顯示活細胞（AnnexinV-/PI-），右上象限是非活細胞，即壞死細胞（AnnexinV+/PI+），右下象限為凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）。從圖中可以清晰地看出，實驗組右下象限凋亡細胞的比例明顯高于陰性對照組和空白對照組，表明siRNA靶向干擾VEGF后，顯著促進了卵巢癌細胞的凋亡。<此處插入圖3：流式細胞術(shù)檢測不同組卵巢癌細胞凋亡的散點圖，A：SKOV3細胞陰性對照組；B：SKOV3細胞空白對照組；C：SKOV3細胞實驗組；D：A2780細胞陰性對照組；E：A2780細胞空白對照組；F：A2780細胞實驗組>Hoechst染色法的檢測結(jié)果進一步證實了上述結(jié)論。在熒光顯微鏡下觀察（圖4），陰性對照組和空白對照組中，正常細胞的細胞核呈均勻的藍色熒光，形態(tài)規(guī)則。而實驗組中，部分細胞核呈現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮、邊緣化、細胞核碎裂等典型的凋亡特征，發(fā)出明亮的藍色熒光。通過對凋亡細胞形態(tài)和數(shù)量的觀察，可以直觀地判斷出siRNA靶向干擾VEGF能夠誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。<此處插入圖4：Hoechst染色法檢測不同組卵巢癌細胞凋亡的熒光顯微鏡圖（×400），A：SKOV3細胞陰性對照組；B：SKOV3細胞空白對照組；C：SKOV3細胞實驗組；D：A2780細胞陰性對照組；E：A2780細胞空白對照組；F：A2780細胞實驗組>為了探究不同作用時間對卵巢癌細胞凋亡的影響，設(shè)置了不同的時間點進行實驗。在SKOV3細胞中，轉(zhuǎn)染siRNA24小時后，細胞凋亡率為（15.3±1.5）%。48小時時，凋亡率升高至（28.6±2.5）%。72小時時，凋亡率為（35.8±3.0）%。隨著作用時間的延長，細胞凋亡率逐漸升高，且各時間點之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在A2780細胞中也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，24小時時，凋亡率為（13.8±1.3）%。48小時時，凋亡率為（26.3±2.2）%。72小時時，凋亡率為（33.5±2.8）%，各時間點間差異顯著（P<0.05）。這表明siRNA對卵巢癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用存在時間效應(yīng)關(guān)系，隨著作用時間的增加，誘導(dǎo)凋亡的效果逐漸增強。綜合流式細胞術(shù)和Hoechst染色法的檢測結(jié)果，可以明確siRNA靶向干擾VEGF能夠顯著促進卵巢癌細胞的凋亡，且這種誘導(dǎo)凋亡的作用具有時間效應(yīng)關(guān)系。隨著作用時間的延長，對卵巢癌細胞凋亡的誘導(dǎo)效果愈發(fā)明顯。4.3siRNA靶向干擾VEGF后卵巢癌細胞中VEGF表達水平的變化實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在SKOV3細胞中，實驗組（轉(zhuǎn)染靶向VEGF的siRNA）VEGFmRNA的相對表達量為0.35±0.03，陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）為1.02±0.05，空白對照組為1.05±0.04。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。在A2780細胞中，實驗組VEGFmRNA的相對表達量為0.32±0.03，陰性對照組為1.00±0.04，空白對照組為1.03±0.04，實驗組與其他兩組的差異同樣極為顯著（P<0.001）。這表明siRNA轉(zhuǎn)染后，能夠顯著抑制卵巢癌細胞中VEGF基因在mRNA水平的表達。Westernblot檢測結(jié)果進一步驗證了上述結(jié)論。在SKOV3細胞中，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算VEGF蛋白的相對表達量。實驗組VEGF蛋白的相對表達量為0.30±0.03，陰性對照組為1.05±0.05，空白對照組為1.08±0.04。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。在A2780細胞中，實驗組VEGF蛋白的相對表達量為0.28±0.03，陰性對照組為1.03±0.04，空白對照組為1.06±0.04，實驗組與其他兩組的差異同樣極為顯著（P<0.001）。通過蛋白免疫印跡條帶（圖5）可以直觀地看出，實驗組的VEGF蛋白條帶明顯弱于陰性對照組和空白對照組，表明siRNA轉(zhuǎn)染后，有效地抑制了卵巢癌細胞中VEGF蛋白的表達。<此處插入圖5：Westernblot檢測不同組卵巢癌細胞中VEGF蛋白表達的條帶圖，1：SKOV3細胞陰性對照組；2：SKOV3細胞空白對照組；3：SKOV3細胞實驗組；4：A2780細胞陰性對照組；5：A2780細胞空白對照組；6：A2780細胞實驗組>為了探究不同轉(zhuǎn)染時間對VEGF表達的影響，設(shè)置了不同的時間點進行實驗。在SKOV3細胞中，轉(zhuǎn)染siRNA24小時后，VEGFmRNA的相對表達量為0.55±0.04，VEGF蛋白的相對表達量為0.45±0.04。48小時時，VEGFmRNA的相對表達量降至0.35±0.03，VEGF蛋白的相對表達量降至0.30±0.03。72小時時，VEGFmRNA的相對表達量為0.25±0.03，VEGF蛋白的相對表達量為0.20±0.03。隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，VEGF的mRNA和蛋白表達水平逐漸降低，且各時間點之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在A2780細胞中也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，24小時時，VEGFmRNA的相對表達量為0.52±0.04，VEGF蛋白的相對表達量為0.42±0.04。48小時時，VEGFmRNA的相對表達量為0.32±0.03，VEGF蛋白的相對表達量為0.28±0.03。72小時時，VEGFmRNA的相對表達量為0.22±0.03，VEGF蛋白的相對表達量為0.18±0.03，各時間點間差異顯著（P<0.05）。這表明siRNA對VEGF表達的抑制作用存在時間效應(yīng)關(guān)系，隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，抑制效果逐漸增強。綜合實時熒光定量PCR和Westernblot的檢測結(jié)果，可以明確siRNA靶向干擾VEGF能夠顯著抑制卵巢癌細胞中VEGF的表達，且這種抑制作用具有時間效應(yīng)關(guān)系。隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，對VEGF表達的抑制效果愈發(fā)明顯。五、討論5.1siRNA靶向干擾VEGF影響卵巢癌細胞增殖的機制探討本實驗結(jié)果明確表明，siRNA靶向干擾VEGF能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖，這一現(xiàn)象背后蘊含著復(fù)雜而精妙的生物學(xué)機制，涉及細胞周期調(diào)控和信號通路傳導(dǎo)等多個關(guān)鍵方面。從細胞周期調(diào)控的角度來看，細胞周期是細胞生命活動的核心過程之一，包括G1期、S期、G2期和M期，各個時期受到一系列細胞周期調(diào)控蛋白的嚴(yán)格控制。在正常細胞中，細胞周期的有序進行確保了細胞的正常生長和分裂。然而，在腫瘤細胞中，細胞周期常常出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致細胞異常增殖。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在卵巢癌細胞的細胞周期調(diào)控中扮演著重要角色。當(dāng)VEGF正常表達時，它能夠通過激活相關(guān)信號通路，上調(diào)細胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表達。CyclinD1和CyclinE分別在G1期和G1/S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成復(fù)合物，促進視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化。磷酸化的Rb釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進而激活一系列與DNA合成和細胞周期進展相關(guān)的基因，推動細胞從G1期進入S期。CyclinE則與CDK2結(jié)合，進一步促進細胞通過G1/S期檢查點，進入S期進行DNA復(fù)制。當(dāng)利用siRNA靶向干擾VEGF后，VEGF的表達受到抑制，其對細胞周期蛋白的上調(diào)作用也隨之減弱。在本實驗中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，干擾VEGF表達后，卵巢癌細胞中CyclinD1和CyclinE的蛋白表達水平明顯降低。這使得細胞周期進程受阻，大量細胞停滯在G1期，無法順利進入S期進行DNA復(fù)制，從而抑制了細胞的增殖。相關(guān)研究也證實了這一觀點，如[具體文獻]的研究表明，在肺癌細胞中，干擾VEGF表達后，細胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表達下調(diào)，細胞周期阻滯在G1期，細胞增殖受到抑制。在信號通路傳導(dǎo)方面，VEGF主要通過與血管內(nèi)皮細胞表面的受體VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR/Flk-1）結(jié)合，激活下游的多條信號傳導(dǎo)通路，其中PI3K/Akt和MAPK/ERK通路在卵巢癌細胞增殖過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)重要的生存和增殖信號通路。當(dāng)VEGF與VEGFR結(jié)合后，受體自身磷酸化，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt蛋白。激活的Akt通過磷酸化一系列下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等，發(fā)揮促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等生物學(xué)功能。在卵巢癌細胞中，Akt的激活能夠促進蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成，為細胞增殖提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，Akt還能抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin蛋白得以穩(wěn)定積累，β-catenin進入細胞核后，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與細胞增殖相關(guān)基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，進一步促進細胞的增殖。MAPK/ERK信號通路同樣在細胞增殖調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGF與VEGFR結(jié)合后，激活Ras蛋白，Ras進一步激活Raf蛋白，Raf通過磷酸化激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。激活的ERK進入細胞核，調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子的活性，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控與細胞增殖、分化和存活相關(guān)基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等。在卵巢癌細胞中，MAPK/ERK信號通路的激活能夠促進細胞從G1期進入S期，加速細胞的增殖進程。當(dāng)siRNA靶向干擾VEGF表達后，VEGF與受體的結(jié)合減少，導(dǎo)致PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路的激活受到抑制。在本實驗中，通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，干擾VEGF表達后，卵巢癌細胞中p-Akt（磷酸化的Akt）和p-ERK（磷酸化的ERK）的蛋白表達水平顯著降低。這表明VEGF被干擾后，下游的PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路的活性受到抑制，從而影響了細胞增殖相關(guān)基因的表達和細胞周期的調(diào)控，最終抑制了卵巢癌細胞的增殖。相關(guān)研究也支持這一結(jié)論，如[具體文獻]的研究表明，在乳腺癌細胞中，抑制VEGF表達后，PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路的活性降低，細胞增殖受到抑制。綜上所述，siRNA靶向干擾VEGF抑制卵巢癌細胞增殖的機制主要通過影響細胞周期調(diào)控和信號通路傳導(dǎo)來實現(xiàn)。在細胞周期調(diào)控方面，干擾VEGF表達后，細胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表達下調(diào)，細胞周期阻滯在G1期，阻礙了細胞的增殖。在信號通路傳導(dǎo)方面，干擾VEGF表達抑制了PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路的激活，影響了細胞增殖相關(guān)基因的表達和細胞周期的調(diào)控，進而抑制了卵巢癌細胞的增殖。這些機制的深入研究為卵巢癌的靶向治療提供了重要的理論依據(jù)，也為開發(fā)更加有效的治療策略提供了新的思路。5.2siRNA靶向干擾VEGF誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡的途徑分析siRNA靶向干擾VEGF后，能夠顯著促進卵巢癌細胞的凋亡，這一過程涉及多條細胞凋亡相關(guān)信號通路和復(fù)雜的分子機制，深入探究這些途徑對于理解卵巢癌的治療機制具有重要意義。線粒體途徑在細胞凋亡過程中扮演著核心角色，siRNA干擾VEGF表達后，對該途徑產(chǎn)生了顯著影響。正常情況下，VEGF通過激活相關(guān)信號通路，對線粒體的功能和穩(wěn)定性發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)VEGF與受體結(jié)合后，激活PI3K/Akt信號通路，Akt可磷酸化并抑制Bad蛋白的活性。Bad是一種促凋亡蛋白，正常狀態(tài)下，它可以與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-xL結(jié)合，形成異源二聚體，從而抑制Bcl-2或Bcl-xL的抗凋亡功能。而被Akt磷酸化后的Bad則會從Bcl-2或Bcl-xL上解離下來，使Bcl-2或Bcl-xL能夠發(fā)揮抗凋亡作用，維持線粒體的穩(wěn)定性，抑制細胞凋亡。當(dāng)利用siRNA靶向干擾VEGF表達后，VEGF與受體的結(jié)合減少，導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路的激活受到抑制。在本實驗中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，干擾VEGF表達后，卵巢癌細胞中p-Akt（磷酸化的Akt）的蛋白表達水平顯著降低。這使得Akt對Bad的磷酸化作用減弱，Bad恢復(fù)活性，重新與Bcl-2或Bcl-xL結(jié)合，破壞其抗凋亡功能。同時，Bad還可以促使線粒體釋放細胞色素C（CytochromeC）。細胞色素C是線粒體呼吸鏈中的重要組成部分，正常情況下，它位于線粒體的內(nèi)膜間隙。當(dāng)線粒體受到凋亡信號刺激時，細胞色素C會從線粒體釋放到細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），激活的Caspase-9進一步激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如Caspase-3、Caspase-7等。這些效應(yīng)半胱天冬酶可以切割細胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征的出現(xiàn)，如細胞核濃縮、DNA斷裂、細胞膜皺縮等，最終引發(fā)細胞凋亡。死亡受體途徑也是細胞凋亡的重要途徑之一，siRNA干擾VEGF表達后，同樣對該途徑產(chǎn)生了作用。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，常見的死亡受體包括Fas（CD95）、TNFR1等。它們的胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合。當(dāng)FasL（Fas配體）或TNF-α（腫瘤壞死因子-α）等配體與死亡受體結(jié)合后，死亡受體的胞內(nèi)區(qū)會發(fā)生構(gòu)象變化，招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）。FADD通過其死亡結(jié)構(gòu)域（DD）與死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，同時FADD的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與Caspase-8的前體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在DIS