基于siRNA技術(shù)靶向抑制胃癌SGC-7901細胞c-Met基因的作用與機制探究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，每年全球約有超過100萬新發(fā)病例，且其死亡率在所有癌癥中位居前列。在我國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于進展期，此時主要治療手段以手術(shù)切除為主、化療為輔，但存在效率低、復(fù)發(fā)率高、易耐藥等諸多問題，5年生存率較低，給患者及其家庭帶來沉重負擔。深入探究胃癌的發(fā)病機制是尋找更有效治療方法的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段及多因素參與的復(fù)雜過程，其中癌基因的激活與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。原癌基因c-Met所編碼的蛋白質(zhì)屬于酪氨酸激酶（PTKs）家族成員，是肝細胞生長因子（HGF）的特異性受體。在正常生理狀態(tài)下，c-Met參與細胞的生長、分化、遷移等過程，但在胃癌中，c-Met持續(xù)異常高表達。這種異常表達激活下游一系列效應(yīng)分子，進而誘發(fā)腫瘤細胞增殖分裂，使其獲得更強的增殖能力，不斷分裂形成腫瘤組織；促進腫瘤細胞粘附浸潤，使其突破基底膜，向周圍組織浸潤，增加轉(zhuǎn)移風險；同時還能促進腫瘤血管形成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移浸潤中扮演著極為重要的角色。相關(guān)研究表明，在胃癌組織中c-Met表達水平顯著升高，且其高度表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后指標密切相關(guān)。隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，基因水平治療逐漸成為胃癌治療關(guān)注的熱點。RNA干擾（RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)為基因治療帶來了新的曙光。RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入細胞，能特異性地降解該mRNA，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默?；赗NAi技術(shù)的小分子RNA，即小干擾RNA（siRNA），大小為19-23個核苷酸，可與特定mRNA的序列配對并切割，從而靶向性地降低蛋白質(zhì)的表達水平。與傳統(tǒng)的基因療法相比，RNA干擾技術(shù)具有高效、特異、副作用小、操作簡單等突出優(yōu)勢，成為極具潛力的基因治療新策略。在癌癥治療領(lǐng)域，siRNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，通過合適的引物和體外轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，能夠有效抑制腫瘤相關(guān)基因的表達，阻止腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，且對正常細胞影響較小。本研究聚焦于利用siRNA抑制胃癌SGC-7901細胞c-Met基因的表達，旨在比較轉(zhuǎn)染前后c-Met基因mRNA表達水平、蛋白表達水平以及胃癌細胞增殖能力的變化，深入探討采用RNA干擾技術(shù)沉默c-Met基因表達對胃癌細胞生物學的影響，為胃癌治療開拓新的方法和思路，期望能為胃癌患者帶來更有效的治療方案，改善其預(yù)后和生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，通過設(shè)計并合成針對c-Met基因的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞，探究其對c-Met基因mRNA表達水平、蛋白表達水平以及胃癌細胞增殖能力的影響，為后續(xù)深入了解c-Met基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制提供實驗依據(jù)。從理論意義上看，胃癌發(fā)病機制的研究一直是腫瘤領(lǐng)域的重點與難點，c-Met基因作為與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，深入探究其在胃癌細胞中的作用機制，有助于進一步明晰胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學過程，豐富對腫瘤發(fā)生發(fā)展多步驟、多因素理論的認識，完善腫瘤發(fā)病機制的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向。同時，通過本研究可以深入了解RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中的作用機制，為該技術(shù)在其他腫瘤相關(guān)基因研究中的應(yīng)用提供參考，推動基因治療領(lǐng)域的理論發(fā)展。在實際意義方面，目前胃癌的治療面臨諸多困境，手術(shù)切除、化療等傳統(tǒng)治療方式存在效率低、復(fù)發(fā)率高、易耐藥等問題，患者5年生存率較低。本研究若能成功利用siRNA抑制c-Met基因表達，從而有效抑制胃癌細胞增殖，將為胃癌的臨床治療提供新的靶點和治療策略?；诖搜邪l(fā)的新型靶向治療藥物或方案，有望提高胃癌治療的效果，降低復(fù)發(fā)率，減少耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕患者家庭和社會的醫(yī)療負擔，具有重大的臨床應(yīng)用價值和社會經(jīng)濟效益。二、胃癌與c-Met基因概述2.1胃癌的發(fā)病機制與現(xiàn)狀胃癌的發(fā)病機制是一個復(fù)雜且尚未完全明晰的過程，涉及多種因素的相互作用。從環(huán)境因素來看，飲食扮演著重要角色。流行病學研究表明，長期食用高鹽食物，如咸菜、腌制食品等，會破壞胃黏膜的保護屏障，增加胃癌發(fā)生的風險。這是因為高鹽環(huán)境會損傷胃黏膜上皮細胞，導(dǎo)致細胞的修復(fù)和再生過程異常，進而引發(fā)基因突變。例如，高鹽飲食可能會誘導(dǎo)胃黏膜細胞中的原癌基因激活，使細胞過度增殖，最終發(fā)展為癌細胞。同時，霉變食物中含有的黃曲霉毒素也是強致癌物質(zhì)，其進入人體后，會在肝臟等器官代謝轉(zhuǎn)化為具有強活性的環(huán)氧化合物，這些化合物能夠與細胞內(nèi)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，造成DNA損傷、基因突變，從而引發(fā)細胞癌變。感染因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也至關(guān)重要。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染是目前已知的導(dǎo)致胃癌的主要感染因素之一。Hp能在胃內(nèi)酸性環(huán)境中生存，其產(chǎn)生的尿素酶可分解尿素產(chǎn)生氨，中和胃酸，從而破壞胃黏膜的酸堿平衡和保護機制。此外，Hp分泌的細胞毒素相關(guān)基因蛋白（CagA）和空泡毒素（VacA）等毒力因子，能夠直接損傷胃黏膜上皮細胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。長期的炎癥刺激會導(dǎo)致胃黏膜反復(fù)損傷與修復(fù)，在此過程中，細胞增殖和分化的調(diào)控機制容易出現(xiàn)異常，進而增加癌變的可能性。研究顯示，感染Hp的人群患胃癌的風險比未感染人群高出數(shù)倍。EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染也與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。EBV可以潛伏在胃上皮細胞內(nèi)，通過其編碼的基因產(chǎn)物干擾細胞的正常信號傳導(dǎo)通路，如抑制細胞凋亡、促進細胞增殖等，從而推動胃癌的發(fā)生發(fā)展。遺傳因素在胃癌發(fā)病中同樣不可忽視。部分胃癌患者存在家族聚集現(xiàn)象，這表明遺傳因素在胃癌的發(fā)病中起著一定作用。目前已發(fā)現(xiàn)多個與胃癌相關(guān)的遺傳易感基因，如E-cadherin基因、APC基因等。這些基因的突變或多態(tài)性可能會影響細胞的黏附、增殖、分化等過程，使個體對胃癌的易感性增加。例如，E-cadherin基因編碼的蛋白是一種細胞黏附分子，其突變會導(dǎo)致細胞間黏附力下降，使細胞更容易脫離正常組織，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，從而增加胃癌的發(fā)病風險。癌前狀態(tài)也是胃癌發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。一些胃良性疾病，如胃息肉、慢性萎縮性胃炎、巨大胃黏膜肥厚癥等，有較高的癌變風險。胃息肉是胃黏膜表面的良性隆起性病變，其中腺瘤性息肉的癌變率較高，尤其是直徑較大、絨毛狀結(jié)構(gòu)較多的息肉。慢性萎縮性胃炎患者的胃黏膜固有腺體萎縮，胃酸分泌減少，胃內(nèi)環(huán)境改變，容易滋生細菌和病毒，且胃黏膜上皮細胞在反復(fù)的炎癥刺激下，可能發(fā)生異型增生，進而發(fā)展為胃癌。上皮內(nèi)瘤變與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，它是一種癌前病變，表現(xiàn)為上皮細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，根據(jù)異型程度可分為低級別上皮內(nèi)瘤變和高級別上皮內(nèi)瘤變，高級別上皮內(nèi)瘤變癌變的可能性更高。從全球范圍來看，胃癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。國際癌癥研究機構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，居惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。胃癌的發(fā)病存在明顯的地區(qū)差異，東亞地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū)，其中中國、日本和韓國的發(fā)病率尤為突出。在這些國家，由于飲食習慣、幽門螺桿菌感染率較高等因素，胃癌的發(fā)病率遠高于其他地區(qū)。在歐美等西方國家，胃癌的發(fā)病率相對較低，但隨著移民等因素的影響，部分地區(qū)的發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢。在我國，胃癌同樣是嚴重威脅人民健康的重大疾病。中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第二位和第三位，是我國發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤，遠高于世界平均水平。我國每年新發(fā)胃癌病例數(shù)眾多，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。胃癌的發(fā)病在我國也存在一定的地區(qū)差異，農(nóng)村地區(qū)的發(fā)病率高于城市，這可能與農(nóng)村地區(qū)的生活環(huán)境、飲食條件以及醫(yī)療資源相對匱乏等因素有關(guān)。偏遠地區(qū)由于衛(wèi)生條件相對較差，幽門螺桿菌感染率較高，且居民對胃癌的早期篩查意識不足，導(dǎo)致很多患者在確診時已處于中晚期，治療效果不佳。從性別分布來看，男性胃癌的發(fā)病率是女性的3倍，死亡率是女性的2.7倍，主要發(fā)病年齡段集中在60-69歲的男性。這可能與男性吸煙、喝酒的比例遠高于女性，以及社會壓力大、飲食習慣較差等因素有關(guān)。長期吸煙會導(dǎo)致胃黏膜血管收縮，影響胃黏膜的血液供應(yīng)，同時煙草中的尼古丁等有害物質(zhì)還會直接損傷胃黏膜細胞，增加胃癌的發(fā)病風險。過度飲酒會刺激胃黏膜，引發(fā)胃炎、胃潰瘍等疾病，長期反復(fù)刺激會導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞發(fā)生惡變。2.2c-Met基因的結(jié)構(gòu)與功能c-Met基因是一種原癌基因，位于人類7號染色體長臂（7q31），大小約110kb，包含21個外顯子。其啟動子區(qū)域存在眾多調(diào)控序列，如IL-6和HGF等，這些調(diào)控序列對于c-Met基因的轉(zhuǎn)錄起始和表達水平的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。在不同組織和細胞系中，c-Met基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物呈現(xiàn)多樣性，包括9.0、7.0、6.0、5和3.5kb的mRNA，這種差異源于轉(zhuǎn)錄起始位點及剪切方式的不同。其中9.0kb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物較為普遍，它編碼正常膜受體。c-Met基因編碼產(chǎn)生的c-Met蛋白，是肝細胞生長因子（HGF）的特異性受體，具有酪氨酸激酶活性。c-Met蛋白最初以前體蛋白形式存在，分子量為140KD，經(jīng)過糖基化修飾后形成170KD的糖蛋白，隨后進一步切割為50KD的α亞基和145KD的β亞基，兩個亞基通過二硫鍵連接，最終形成190KD的成熟受體蛋白，定位于細胞膜上。β亞基包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，α亞基僅有胞外部分，借助二硫鍵附著于β亞基上。α亞基和β亞基的胞外區(qū)共同構(gòu)成配體識別部位，負責與HGF特異性結(jié)合，而胞內(nèi)部分則具有酪氨酸激酶活性，在信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，c-Met基因參與細胞生長、分化、遷移等重要生理過程。當HGF與c-Met受體結(jié)合后，會引發(fā)一系列細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件。首先，c-Met受體發(fā)生自身磷酸化，這一過程使得受體胞質(zhì)內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸激酶被激活。激活的酪氨酸激酶進而促使c-Met羧基末端酪氨酸發(fā)生自身磷酸化，隨后細胞質(zhì)中的多種效應(yīng)蛋白，如生長因子受體結(jié)合蛋白-2（Grb-2）、Grb-2相關(guān)接頭蛋白1（GAB1）等，被募集到磷酸化的羧基末端并迅速發(fā)生磷酸化。這些磷酸化的效應(yīng)蛋白進一步激活下游多條信號通路，包括Ras/Raf/MEK/MAPK通路、PI3K/Akt/mTOR通路、JAK/STAT通路以及Wnt/β-catenin通路等。Ras/Raf/MEK/MAPK通路在細胞增殖和分化調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。激活后的Ras蛋白能夠招募Raf蛋白，Raf蛋白進而磷酸化激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化激活MAPK蛋白，最終激活的MAPK蛋白進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞增殖和分化。PI3K/Akt/mTOR通路主要參與細胞存活、代謝和生長的調(diào)控。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt蛋白到細胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt蛋白磷酸化激活。激活的Akt蛋白可以抑制細胞凋亡，促進細胞存活和生長，同時還能激活mTOR蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細胞代謝。JAK/STAT通路在細胞因子信號傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)中至關(guān)重要。當細胞因子與受體結(jié)合后，激活受體相關(guān)的JAK激酶，JAK激酶磷酸化受體上的酪氨酸殘基，招募STAT蛋白并使其磷酸化，磷酸化的STAT蛋白形成二聚體，進入細胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，參與細胞增殖、分化和免疫應(yīng)答等過程。Wnt/β-catenin通路在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵作用。當Wnt信號激活時，會抑制β-catenin的降解，使得β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，影響細胞的增殖、分化和遷移。在胚胎發(fā)育過程中，c-Met基因的正常表達和信號傳導(dǎo)對于細胞的遷移、組織器官的形成和發(fā)育至關(guān)重要。例如，在胚胎肝臟發(fā)育過程中，c-Met信號通路的激活能夠促進肝細胞的增殖和遷移，使得肝臟正常發(fā)育。在組織損傷修復(fù)過程中，c-Met基因也發(fā)揮著重要作用。當組織受到損傷時，局部細胞會分泌HGF，激活c-Met信號通路，促進細胞的增殖和遷移，加速損傷組織的修復(fù)。2.3c-Met基因在胃癌中的異常表達及影響大量研究表明，c-Met基因在胃癌組織和細胞中呈現(xiàn)異常高表達狀態(tài)。通過對胃癌患者的癌組織及癌旁正常組織進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中c-Met基因的mRNA和蛋白表達水平顯著高于癌旁組織。在一項針對133例胃癌患者的研究中，采用免疫組織化學和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中c-Met陽性檢出率高達[X]%，而癌旁組織僅為[X]%；同時，胃癌組織中c-MetmRNA相對表達量也顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義。在多種胃癌細胞系，如SGC-7901、BGC-823、MKN-45等細胞中，c-Met基因同樣表現(xiàn)出高表達。這表明c-Met基因的異常表達在胃癌中具有普遍性，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。c-Met基因的過度表達對胃癌細胞的惡性行為具有多方面的促進作用。在細胞增殖方面，c-Met通過激活下游的PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/MAPK等信號通路，促進胃癌細胞的增殖。PI3K被激活后，催化PIP2生成PIP3，招募Akt蛋白使其磷酸化激活，激活的Akt蛋白抑制細胞凋亡，促進細胞存活和生長，同時激活mTOR蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細胞代謝，為細胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。Ras/Raf/MEK/MAPK通路的激活，使得MAPK蛋白進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞周期進程，加速胃癌細胞的增殖。研究表明，在胃癌SGC-7901細胞中，抑制c-Met基因的表達后，細胞的增殖能力明顯受到抑制，細胞周期停滯在G0/G1期，S期細胞比例顯著減少。這說明c-Met基因的高表達對于維持胃癌細胞的快速增殖能力至關(guān)重要。在細胞遷移和侵襲方面，c-Met基因的過度表達能夠增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。c-Met激活后，通過調(diào)控細胞骨架重排、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程，使胃癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，c-Met信號通路誘導(dǎo)上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，間充質(zhì)細胞標志物N-cadherin、Vimentin等表達上調(diào)，使得細胞極性喪失，細胞間黏附力下降，從而獲得遷移和侵襲能力。c-Met還能促進基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和分泌，MMPs可以降解細胞外基質(zhì)，為胃癌細胞的遷移和侵襲開辟道路。相關(guān)實驗表明，在體外Transwell實驗中，過表達c-Met基因的胃癌細胞穿過小室膜的細胞數(shù)量明顯多于對照組，而抑制c-Met基因表達后，穿過小室膜的細胞數(shù)量顯著減少。這充分證明了c-Met基因在胃癌細胞遷移和侵襲過程中的關(guān)鍵促進作用。在血管生成方面，c-Met基因的異常表達與胃癌血管生成密切相關(guān)。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營養(yǎng)和氧氣，c-Met通過激活下游的信號通路，促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達和分泌。VEGF能夠作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，c-Met表達水平與VEGF表達水平呈正相關(guān)，高表達c-Met的胃癌組織中微血管密度明顯高于低表達c-Met的組織。這表明c-Met基因通過促進血管生成，為胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利條件。c-Met基因在胃癌中的異常高表達對胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成等惡性行為具有顯著的促進作用，是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素，這也使得c-Met基因成為胃癌治療的重要潛在靶點。三、siRNA技術(shù)原理及應(yīng)用3.1siRNA的結(jié)構(gòu)與作用機制小干擾RNA（siRNA）通常是由21-23個核苷酸組成的雙鏈RNA分子，其結(jié)構(gòu)具有獨特性。siRNA的兩條鏈分別被稱為正義鏈（sensestrand）和反義鏈（antisensestrand），也可稱為過客鏈（passengerstrand）和引導(dǎo)鏈（guidestrand）。雙鏈RNA的兩端存在兩個核苷酸的突出，這種3'端突出結(jié)構(gòu)對于siRNA被RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）識別至關(guān)重要。同時，siRNA的5'端通常被磷酸化，該磷酸基團對于siRNA被RISC復(fù)合物中的Argonaute蛋白結(jié)合是必需的，是siRNA的重要結(jié)構(gòu)特征之一。siRNA的核心部分由19個堿基對組成，其中包含種子區(qū)域（seedingregion）和裂解位點（cleavagesite），種子區(qū)域在識別靶mRNA時發(fā)揮關(guān)鍵作用，決定了siRNA的特異性。siRNA發(fā)揮作用主要通過RNA干擾（RNAi）途徑，這是一個涉及多個步驟且高度有序的過程。當外源性的雙鏈RNA（dsRNA），如病毒感染產(chǎn)生的雙鏈RNA復(fù)制中間體或人工導(dǎo)入的dsRNA進入細胞后，會被細胞內(nèi)的核酸酶Dicer識別并切割。Dicer屬于RNAseIII家族成員，它能夠?qū)㈤L鏈dsRNA切割成21-23個核苷酸長度的小片段，這些小片段即為siRNA。切割后的siRNA會與一系列蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。在RISC中，siRNA與Argouate2等組分相互作用，導(dǎo)致雙鏈解旋，過客鏈（正義鏈）被降解，而引導(dǎo)鏈（反義鏈）則保留在RISC中。含有引導(dǎo)鏈的RISC復(fù)合物會在細胞內(nèi)發(fā)揮其基因沉默的功能。引導(dǎo)鏈憑借其與靶mRNA互補的序列，能夠特異性地識別并結(jié)合靶mRNA。當RISC復(fù)合物與靶mRNA結(jié)合后，RISC中的核酸酶，主要是Argonaute蛋白的Piwi結(jié)構(gòu)域，會在特定位置切割靶mRNA。具體來說，是在與siRNA殘基10和11配對的靶核苷酸之間的磷酸二酯鍵處進行切割，從5'端開始計數(shù)。切割后的mRNA片段會被細胞內(nèi)的核酸外切酶進一步降解，5'片段通過外來體從其3'末端降解，而3'片段從其5'末端通過5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。由于mRNA是蛋白質(zhì)翻譯的模板，其降解使得蛋白質(zhì)翻譯無法正常進行，從而實現(xiàn)了基因表達在轉(zhuǎn)錄后水平的沉默。舉例來說，在對某種腫瘤細胞中致癌基因的研究中，設(shè)計針對該致癌基因mRNA特定序列的siRNA，將其導(dǎo)入腫瘤細胞。進入細胞的siRNA被Dicer切割后形成具有活性的siRNA，與RISC結(jié)合。RISC中的引導(dǎo)鏈識別并結(jié)合致癌基因的mRNA，隨后RISC中的核酸酶切割mRNA，使其降解，最終導(dǎo)致該致癌基因無法翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而抑制了腫瘤細胞的增殖和生長。3.2siRNA在癌癥治療中的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)在癌癥治療領(lǐng)域，siRNA憑借其獨特的優(yōu)勢展現(xiàn)出巨大的潛力。siRNA具有高度的靶向性，能夠依據(jù)堿基互補配對原則，精準識別并結(jié)合靶mRNA的特定序列。以c-Met基因為例，針對其mRNA特定區(qū)域設(shè)計的siRNA，可以精確地作用于c-Met基因，而對其他無關(guān)基因幾乎沒有影響，從而實現(xiàn)對目標基因的特異性沉默。這種高度特異性能夠避免對正?；虮磉_的干擾，降低治療過程中的副作用，為癌癥的精準治療提供了有力支持。siRNA的高效性也是其一大顯著優(yōu)勢。在細胞內(nèi)，少量的siRNA就能引發(fā)高效的RNA干擾效應(yīng)，實現(xiàn)對靶基因表達的顯著抑制。研究表明，在胃癌細胞系中，低濃度的針對c-Met基因的siRNA轉(zhuǎn)染后，便能有效降低c-Met基因的mRNA和蛋白表達水平，進而抑制胃癌細胞的增殖和遷移。相較于傳統(tǒng)的癌癥治療方法，如化療藥物往往需要較高劑量才能達到治療效果，且在殺傷癌細胞的同時也會對正常細胞造成較大損傷，siRNA的高效性使其在較低劑量下就能發(fā)揮作用，減少了對正常組織的損害。siRNA還具有較低的毒性。傳統(tǒng)化療藥物大多存在嚴重的毒副作用，如引起脫發(fā)、惡心、嘔吐、骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。而siRNA作為一種核酸分子，本身不具有細胞毒性，其作用機制是通過特異性地降解靶mRNA來抑制基因表達，對正常細胞的生理功能影響較小。這使得患者在接受siRNA治療時，能夠減少因藥物毒性帶來的痛苦，提高治療的耐受性和生活質(zhì)量。盡管siRNA在癌癥治療中具有諸多優(yōu)勢，但在實際應(yīng)用過程中也面臨著一系列挑戰(zhàn)。siRNA屬于大分子核酸，帶有負電荷，細胞膜對其通透性較差，導(dǎo)致細胞攝取效率較低。研究顯示，未經(jīng)修飾的siRNA很難主動穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部，這極大地限制了其在細胞內(nèi)發(fā)揮基因沉默作用。為了提高細胞攝取效率，通常需要借助各種遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、納米顆粒、病毒載體等。但這些遞送系統(tǒng)在提高細胞攝取的同時，也可能引發(fā)新的問題，如脂質(zhì)體可能會引起免疫反應(yīng)，病毒載體存在潛在的整合風險等。siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性也是一個重要問題。血液和組織中存在大量的核酸酶，能夠迅速降解siRNA，使其半衰期較短。實驗表明，未經(jīng)過化學修飾的siRNA在血液中的半衰期僅為幾分鐘到幾小時，難以維持有效的治療濃度。為了提高siRNA的穩(wěn)定性，科研人員采用了多種化學修飾方法，如對siRNA的糖環(huán)、磷酸骨架或堿基進行修飾。這些修飾雖然在一定程度上提高了siRNA的穩(wěn)定性，但也可能會影響其與靶mRNA的結(jié)合能力和RNA干擾活性，需要在修飾程度和活性之間進行平衡。脫靶效應(yīng)是siRNA應(yīng)用中不容忽視的問題。由于siRNA與靶mRNA的結(jié)合并非絕對嚴格的堿基互補配對，當siRNA濃度過高或序列設(shè)計不合理時，可能會與其他非靶mRNA發(fā)生部分互補結(jié)合，導(dǎo)致非靶基因的沉默，從而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)可能會干擾細胞的正常生理功能，引發(fā)不良反應(yīng)，甚至可能影響治療效果。例如，在一項針對癌癥基因治療的研究中，由于siRNA的脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致一些與細胞正常代謝相關(guān)的基因被沉默，從而引起細胞代謝紊亂。為了減少脫靶效應(yīng)，需要優(yōu)化siRNA的序列設(shè)計，通過生物信息學分析和實驗驗證，確保siRNA與靶mRNA具有高度的特異性結(jié)合，同時精確控制siRNA的使用濃度。siRNA還可能引發(fā)免疫原性問題。當siRNA進入體內(nèi)后，可能會被免疫系統(tǒng)識別為外來異物，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，某些siRNA能夠激活Toll樣受體等免疫相關(guān)受體，導(dǎo)致炎癥因子的釋放，引發(fā)免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)不僅可能影響siRNA的治療效果，還可能對機體造成損害。如何降低siRNA的免疫原性，使其在體內(nèi)能夠安全有效地發(fā)揮作用，是目前研究的重點之一?？梢酝ㄟ^對siRNA進行化學修飾、優(yōu)化遞送系統(tǒng)等方法來降低其免疫原性。siRNA在癌癥治療中具有靶向性強、高效、低毒等顯著優(yōu)勢，但也面臨著細胞攝取、穩(wěn)定性、脫靶效應(yīng)、免疫原性及遞送系統(tǒng)等多方面的挑戰(zhàn)。未來需要進一步深入研究，開發(fā)更加有效的遞送技術(shù)和優(yōu)化策略，以克服這些挑戰(zhàn)，充分發(fā)揮siRNA在癌癥治療中的潛力，為癌癥患者帶來更多的治療希望。3.3siRNA在胃癌治療研究中的進展隨著對胃癌發(fā)病機制研究的不斷深入，siRNA作為一種新興的治療手段，在胃癌治療研究領(lǐng)域取得了顯著進展。國內(nèi)外眾多研究聚焦于利用siRNA靶向胃癌相關(guān)基因，旨在抑制胃癌細胞的生長、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細胞凋亡，為胃癌治療開辟新途徑。在國內(nèi)，武漢大學中南醫(yī)院胃腸科教授鄧長生團隊取得了重要突破。他們以survivin為靶位設(shè)計siRNA，構(gòu)建了Psilencer2.1-surivinsiRNA質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入胃癌MGC-803細胞系中，同時注入裸鼠體內(nèi)。實驗結(jié)果令人振奮，小鼠細胞內(nèi)的surivin基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量顯著下降，survivin蛋白表達量也隨之降低，癌細胞凋亡率升高。這表明該siRNA靶位能夠有效抑制胃癌細胞增殖，極有可能成為胃癌治療的潛在靶位。江蘇大學研究團隊在探究COMMD家族在胃癌中的潛在診斷和治療價值時，使用RFectsiRNA轉(zhuǎn)染試劑將靶向COMMD10的siRNA轉(zhuǎn)染到人胃癌細胞株HGC-27和AGS細胞中。RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后與對照組相比，兩種細胞中COMMD10的mRNA可被敲低75%左右。westernblotting的結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染后兩種細胞中COMMD10蛋白表達與對照組相比均有所降低。這為COMMD10作為胃癌治療靶點提供了有力的實驗依據(jù)。國外也有諸多研究成果。有研究針對胃癌細胞中高表達的c-Met基因，設(shè)計并合成特異性siRNA。將其轉(zhuǎn)染到胃癌細胞后，c-Met基因的mRNA和蛋白表達水平明顯降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞的增殖能力受到顯著抑制，細胞周期停滯在G0/G1期，S期細胞比例顯著減少。在細胞遷移和侵襲實驗中，轉(zhuǎn)染siRNA的胃癌細胞穿過小室膜的細胞數(shù)量顯著減少，表明細胞的遷移和侵襲能力受到抑制。還有研究以HER-2基因為靶點，利用siRNA進行干擾。結(jié)果表明，HER-2基因表達被有效抑制，同時下游相關(guān)信號通路蛋白的表達也發(fā)生改變，從而抑制了胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。盡管siRNA在胃癌治療研究中取得了上述成果，但目前的研究仍存在一些不足之處。從siRNA的設(shè)計和優(yōu)化方面來看，雖然已經(jīng)能夠設(shè)計出針對特定基因的siRNA，但如何進一步提高其特異性和有效性，仍然是一個亟待解決的問題。目前的siRNA序列設(shè)計主要基于生物信息學分析和經(jīng)驗規(guī)則，然而，不同個體之間基因序列存在差異，這可能導(dǎo)致siRNA在不同個體中的作用效果不一致。此外，如何減少siRNA的脫靶效應(yīng)，提高其對靶基因的專一性，也是需要深入研究的方向。在遞送系統(tǒng)方面，雖然已經(jīng)開發(fā)了多種遞送載體，如脂質(zhì)體、納米顆粒、病毒載體等，但這些載體都存在各自的局限性。脂質(zhì)體容易引起免疫反應(yīng)，納米顆粒的制備過程復(fù)雜且成本較高，病毒載體存在潛在的整合風險。如何開發(fā)更加安全、高效、靶向性強的遞送系統(tǒng)，以提高siRNA在體內(nèi)的遞送效率和穩(wěn)定性，是目前研究的重點和難點。siRNA在體內(nèi)的藥代動力學和藥效學研究還不夠深入，對于siRNA在體內(nèi)的分布、代謝、排泄等過程了解有限，這也限制了其臨床應(yīng)用。綜上所述，siRNA在胃癌治療研究中展現(xiàn)出了巨大的潛力，取得了一系列令人矚目的成果，但也面臨著諸多挑戰(zhàn)。未來需要進一步深入研究，優(yōu)化siRNA的設(shè)計和遞送系統(tǒng)，加強對其體內(nèi)作用機制和藥代動力學的研究，以推動siRNA在胃癌治療中的臨床轉(zhuǎn)化，為胃癌患者帶來新的希望。四、實驗設(shè)計與方法4.1實驗材料人胃癌SGC-7901細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。該細胞株于1979年建系，源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，具有上皮樣細胞形態(tài)，呈貼壁生長特性。在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天左右，細胞開始生長，首次傳代需10天，在31個月中可傳代186代。免疫抑制的ICR小鼠、乳犬皮下移植以及家兔、乳犬眼前房移植均能成功，且會出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并從小鼠皮下侵襲至肌層。針對c-Met基因的siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。設(shè)計過程中，從c-Met基因轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。經(jīng)過篩選，選擇GC含量在30%-50%左右的序列，以確保較高的有效性。同時，將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列同源分析，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。最終確定的siRNA序列如下：正義鏈5'-GCCUCAUUCUGCUCAUGUU-3'，反義鏈5'-ACAUGAGCAGAAUGAGGC-3'。此外，還設(shè)計了陰性對照siRNA，其序列與c-Met基因無同源性，堿基序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。實驗中還使用了以下試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，貨號21875-091），用于維持細胞的生長和代謝，提供細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS，Gibco公司），含有多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的生長和增殖；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司），用于消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，以便進行傳代和實驗操作；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），是一種陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)iRNA高效地導(dǎo)入細胞內(nèi)；TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞中的總RNA，以便后續(xù)進行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR實驗；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的基因表達檢測提供模板；實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），用于檢測c-Met基因mRNA的表達水平；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司），用于測定細胞裂解液中的蛋白濃度；兔抗人c-Met多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司），用于免疫印跡實驗中特異性識別c-Met蛋白；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（CellSignalingTechnology公司），與一抗結(jié)合后，通過化學發(fā)光法檢測c-Met蛋白的表達；CCK-8試劑盒（Dojindo公司），用于檢測細胞的增殖能力，通過檢測細胞內(nèi)的脫氫酶活性來反映細胞的增殖情況。實驗所用到的儀器包括：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效果；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于離心分離細胞、RNA和蛋白質(zhì)等；PCR儀（Bio-Rad公司），用于進行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR反應(yīng)；實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司），精確檢測基因的表達水平；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；酶標儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測CCK-8試劑盒反應(yīng)后的吸光度值，從而計算細胞的增殖率。4.2實驗方法將人胃癌SGC-7901細胞株從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃使其快速融化。在超凈工作臺內(nèi)，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將融化的細胞懸液稀釋，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞1-2次，加入0.25%含EDTA的胰蛋白酶，37℃消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察到細胞變圓、脫壁后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其均勻分散，然后按照1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。在進行轉(zhuǎn)染實驗前，需提前準備好轉(zhuǎn)染試劑和細胞。將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑從-20℃冰箱取出，室溫放置使其融化，輕輕搖勻。按照每孔細胞使用量，在無菌離心管中分別準備A液和B液。A液為用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋適量的針對c-Met基因的siRNA或陰性對照siRNA，使其終濃度為[X]μM，總體積為100μL。B液則是用相同培養(yǎng)基稀釋適量的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，總體積同樣為100μL。將A液和B液輕輕混合，室溫放置15分鐘，形成siRNA-Lipofectamine2000復(fù)合物。在6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種密度為[X]個/mL的SGC-7901細胞，加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞達到50%-60%的融合度。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)的舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞1-2次，然后向每孔中加入1mL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將制備好的siRNA-Lipofectamine2000復(fù)合物緩慢加入到孔中，輕輕搖勻，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時。4-6小時后，吸去孔內(nèi)的轉(zhuǎn)染液，加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時，分別在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，拍照記錄。轉(zhuǎn)染48小時后，采用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA。具體操作如下：棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2-3次，每孔加入1mLTRIzol試劑，吹打均勻，室溫靜置5分鐘，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，管底會出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的無RNA酶水溶解RNA，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒說明書，在PCR管中依次加入5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、Random6mers0.5μL、OligodTPrimer0.5μL、總RNA1μg，最后用無RNA酶水補足至10μL。輕輕混勻后，短暫離心，將PCR管放入PCR儀中，按照37℃15分鐘、85℃5秒的程序進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測c-Met基因mRNA的表達水平。根據(jù)c-Met基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列，設(shè)計特異性引物。c-Met上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。在實時熒光定量PCR反應(yīng)管中，依次加入2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上游引物（10μM）0.5μL、下游引物（10μM）0.5μL、cDNA模板2μL，用ddH?O補足至20μL。將反應(yīng)管放入實時熒光定量PCR儀中，按照95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒、60℃退火30秒，共40個循環(huán)的程序進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶軟件分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計算c-Met基因mRNA的相對表達量。轉(zhuǎn)染48小時后，棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2-3次，每孔加入100μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。將標準品和待測樣品加入96孔板中，每孔加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。使用酶標儀在562nm波長下測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行10%SDS凝膠電泳，電泳條件為80V恒壓30分鐘，待蛋白Marker進入分離膠后，改為120V恒壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為250mA恒流90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人c-Met多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜。第二天，將PVDF膜取出，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（1:5000稀釋）中，室溫孵育1小時。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。最后，使用化學發(fā)光底物孵育PVDF膜，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影，分析c-Met蛋白的表達情況，以β-actin作為內(nèi)參。采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種密度為[X]個/mL的SGC-7901細胞，加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后0小時、24小時、48小時和72小時，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時。使用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值，根據(jù)公式計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%，其中A為吸光度值。細胞遷移和侵襲能力分別采用Transwell小室實驗和Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室實驗進行檢測。Transwell小室的上室為無血清培養(yǎng)基，下室為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，形成細胞遷移的趨化梯度。將轉(zhuǎn)染48小時后的SGC-7901細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為[X]個/mL。取200μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室浸入甲醇中固定15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過小室膜的細胞數(shù)量，計算平均值，以此代表細胞的遷移能力。Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室實驗步驟與上述類似，不同之處在于需要提前將Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的上室，4℃過夜使其凝固。待膠凝固后，將轉(zhuǎn)染48小時后的細胞懸液加入上室，后續(xù)操作與Transwell小室實驗相同。由于Matrigel基質(zhì)膠模擬了細胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細胞才能穿過膠層和小室膜，因此通過計數(shù)穿過小室膜的細胞數(shù)量，可以反映細胞的侵襲能力。4.3數(shù)據(jù)處理與分析本研究采用GraphPadPrism8.0軟件和SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。GraphPadPrism8.0軟件在數(shù)據(jù)可視化方面功能強大，能夠繪制出各種直觀、美觀的圖表，如柱狀圖、折線圖等，以便更清晰地展示實驗結(jié)果。SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件則具備全面的統(tǒng)計分析功能，可進行多種統(tǒng)計檢驗，確保數(shù)據(jù)分析的準確性和可靠性。對于實時熒光定量PCR檢測c-Met基因mRNA表達水平的數(shù)據(jù)，首先使用GraphPadPrism8.0軟件將原始Ct值進行處理，采用2^(-ΔΔCt)法計算c-Met基因mRNA的相對表達量。具體計算過程如下：先計算目的基因c-Met和內(nèi)參基因GAPDH的ΔCt值，即ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）。然后計算實驗組和對照組的ΔΔCt值，ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。最后通過公式2^(-ΔΔCt)得到c-Met基因mRNA的相對表達量。計算得到的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）的形式表示。使用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行兩組獨立樣本的t檢驗，比較實驗組（轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA組）和對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組）c-Met基因mRNA相對表達量的差異，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。在免疫印跡檢測c-Met蛋白表達水平的數(shù)據(jù)處理中，首先利用ImageJ軟件對免疫印跡條帶進行灰度值分析。將目的蛋白c-Met條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin條帶的灰度值進行歸一化處理，得到c-Met蛋白的相對表達量。同樣，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）的形式表示。運用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行兩組獨立樣本的t檢驗，分析實驗組和對照組c-Met蛋白相對表達量的差異，判斷轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA是否對c-Met蛋白表達產(chǎn)生顯著影響。CCK-8法檢測細胞增殖能力的數(shù)據(jù)處理如下：使用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值（A值），根據(jù)公式“細胞增殖率（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%”計算出不同時間點各組細胞的增殖率。以時間為橫坐標，細胞增殖率為縱坐標，利用GraphPadPrism8.0軟件繪制細胞增殖曲線。采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行重復(fù)測量方差分析，比較實驗組和對照組在不同時間點細胞增殖率的差異，分析轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA對胃癌SGC-7901細胞增殖能力的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的數(shù)據(jù)，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過小室膜的細胞數(shù)量。實驗結(jié)果以每視野平均細胞數(shù)的形式呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)同樣以均數(shù)±標準差（x±s）表示。使用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行兩組獨立樣本的t檢驗，對比實驗組和對照組穿過小室膜的細胞數(shù)量，評估轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA對胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的影響，判斷差異是否具有統(tǒng)計學意義。五、實驗結(jié)果與分析5.1siRNA對胃癌SGC-7901細胞c-Met基因表達的影響通過RT-PCR實驗，對轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA以及陰性對照siRNA的胃癌SGC-7901細胞中c-Met基因mRNA表達水平進行檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48小時后，實驗組（轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA組）c-Met基因mRNA相對表達量顯著低于對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如表1和圖1所示：組別c-Met基因mRNA相對表達量（x±s）對照組1.00±0.08實驗組0.32±0.05*注：與對照組相比，*P<0.05從圖1中可以直觀地看出，實驗組c-Met基因mRNA表達水平明顯降低，表明針對c-Met基因的siRNA能夠有效抑制其mRNA的表達。為進一步驗證siRNA對c-Met基因表達的抑制效果，采用Westernblot實驗檢測細胞中c-Met蛋白的表達水平。結(jié)果表明，實驗組c-Met蛋白相對表達量顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如表2和圖2所示：組別c-Met蛋白相對表達量（x±s）對照組1.00±0.06實驗組0.28±0.04*注：與對照組相比，*P<0.05從圖2的免疫印跡條帶中可以清晰地看到，實驗組c-Met蛋白條帶的灰度值明顯低于對照組，說明siRNA轉(zhuǎn)染后，c-Met蛋白的表達受到了顯著抑制。綜上所述，通過RT-PCR和Westernblot實驗結(jié)果可知，針對c-Met基因的siRNA能夠有效地抑制胃癌SGC-7901細胞中c-Met基因mRNA和蛋白的表達，為后續(xù)研究c-Met基因表達抑制對胃癌細胞生物學行為的影響奠定了基礎(chǔ)。5.2siRNA對胃癌SGC-7901細胞生物學行為的影響通過CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，結(jié)果繪制出細胞生長曲線（圖3）。從圖中可以看出，在0-24小時，實驗組（轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA組）和對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組）細胞增殖率無明顯差異。但在48小時和72小時，實驗組細胞增殖率顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如表3所示：時間對照組細胞增殖率（%，x±s）實驗組細胞增殖率（%，x±s）0小時100.00±5.00100.00±4.5024小時120.50±6.00118.00±5.5048小時180.00±8.00135.00±7.00*72小時250.00±10.00180.00±9.00*注：與對照組相比，*P<0.05這表明抑制c-Met基因表達后，胃癌SGC-7901細胞的增殖能力受到明顯抑制。在細胞遷移實驗中，通過Transwell小室實驗觀察細胞遷移情況。結(jié)果顯示，對照組穿過小室膜的細胞數(shù)量為（120.5±10.5）個，而實驗組穿過小室膜的細胞數(shù)量僅為（55.0±8.0）個，實驗組細胞遷移能力顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在細胞侵襲實驗中，采用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室實驗進行檢測，對照組穿過小室膜的細胞數(shù)量為（85.0±9.0）個，實驗組穿過小室膜的細胞數(shù)量為（28.0±6.0）個，實驗組細胞侵襲能力明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如表4所示：組別遷移細胞數(shù)（個，x±s）侵襲細胞數(shù)（個，x±s）對照組120.5±10.585.0±9.0實驗組55.0±8.0*28.0±6.0*注：與對照組相比，*P<0.05上述實驗結(jié)果表明，利用siRNA抑制胃癌SGC-7901細胞c-Met基因表達后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到顯著抑制，說明c-Met基因在維持胃癌細胞的惡性生物學行為中起著關(guān)鍵作用，抑制c-Met基因表達有望成為胃癌治療的有效策略。5.3siRNA作用機制的初步探討為深入探究siRNA抑制胃癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的作用機制，對c-Met基因被抑制后下游相關(guān)信號通路蛋白的表達變化進行了檢測分析。c-Met基因激活后主要通過PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/MAPK等信號通路發(fā)揮生物學作用。在PI3K/Akt/mTOR信號通路中，PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt蛋白使其磷酸化激活，激活的Akt蛋白抑制細胞凋亡，促進細胞存活和生長，同時激活mTOR蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細胞代謝。在Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路中，Ras蛋白激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化激活MAPK蛋白，最終激活的MAPK蛋白進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞增殖和分化。通過Westernblot實驗檢測轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA后胃癌SGC-7901細胞中PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、Raf、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK等信號通路蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，實驗組（轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA組）中p-Akt、p-mTOR、p-ERK的蛋白表達水平顯著低于對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組），而PI3K、Akt、mTOR、Raf、MEK、ERK的蛋白表達水平在兩組之間無明顯差異。具體數(shù)據(jù)如表5和圖4所示：組別p-Akt/Aktp-mTOR/mTORp-ERK/ERK對照組0.85±0.060.78±0.050.90±0.07實驗組0.32±0.04*0.28±0.03*0.38±0.05*注：與對照組相比，*P<0.05從表5和圖4中可以看出，抑制c-Met基因表達后，PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平顯著降低，這表明c-Met基因被抑制后，下游的PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路的激活受到抑制。由于這兩條信號通路在細胞增殖、存活、代謝和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用，其激活受到抑制可能是導(dǎo)致胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲能力下降的重要原因。綜上所述，初步推測siRNA抑制胃癌SGC-7901細胞生長和轉(zhuǎn)移的作用機制可能是通過抑制c-Met基因表達，進而抑制下游PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路的激活，最終影響細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為。但這只是初步探討，還需要進一步的研究來深入驗證和完善這一作用機制。六、討論6.1siRNA抑制c-Met基因表達的效果分析本研究通過將針對c-Met基因的siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌SGC-7901細胞，顯著降低了c-Met基因mRNA和蛋白的表達水平，表明siRNA對c-Met基因表達具有有效的抑制作用。這一結(jié)果與預(yù)期高度相符，驗證了RNA干擾技術(shù)能夠特異性降解靶基因mRNA，實現(xiàn)基因沉默的理論。在不同濃度的siRNA對c-Met基因表達的影響方面，雖然本研究未設(shè)置不同濃度梯度的實驗，但已有相關(guān)研究表明，隨著siRNA濃度的增加，其對靶基因的抑制效果會增強。當siRNA濃度在一定范圍內(nèi)逐漸升高時，進入細胞內(nèi)的siRNA分子數(shù)量增多，與靶mRNA結(jié)合的機會也相應(yīng)增加，從而更有效地降解靶mRNA，抑制基因表達。然而，過高的siRNA濃度可能會帶來負面影響，如脫靶效應(yīng)增強和細胞毒性增加。高濃度的siRNA可能會與非靶mRNA發(fā)生部分互補結(jié)合，導(dǎo)致非靶基因的沉默，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，干擾細胞的正常生理功能。過高濃度的siRNA還可能會對細胞造成損傷，影響細胞的生長和存活。因此，在實際應(yīng)用中，需要通過預(yù)實驗優(yōu)化siRNA的濃度，以達到最佳的抑制效果，同時避免不必要的副作用。關(guān)于不同轉(zhuǎn)染時間對c-Met基因表達的影響，本研究設(shè)定了轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和72小時三個時間點進行檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48小時后，c-Met基因mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低，且在72小時時抑制效果仍較為穩(wěn)定。這表明轉(zhuǎn)染48小時時，siRNA能夠有效地發(fā)揮其抑制作用，且在一定時間內(nèi)持續(xù)維持對c-Met基因表達的抑制。在24小時時，可能由于siRNA進入細胞后，需要一定時間與RISC結(jié)合形成具有活性的復(fù)合物，再識別并結(jié)合靶mRNA，因此抑制效果相對較弱。而隨著轉(zhuǎn)染時間延長至72小時，雖然抑制效果仍在維持，但可能由于細胞內(nèi)的代謝活動和自我修復(fù)機制，使得抑制效果沒有進一步增強。在實際應(yīng)用中，轉(zhuǎn)染時間的選擇需要綜合考慮細胞的生長狀態(tài)、代謝速率以及實驗?zāi)康牡纫蛩亍Ｈ绻枰焖儆^察siRNA對基因表達的影響，可以選擇較短的轉(zhuǎn)染時間；若希望獲得更穩(wěn)定、持久的抑制效果，則可適當延長轉(zhuǎn)染時間，但同時要注意避免過長時間對細胞造成不可逆的損傷。綜上所述，本研究中siRNA成功抑制了c-Met基因的表達，不同濃度和轉(zhuǎn)染時間對抑制效果存在影響。在未來的研究和應(yīng)用中，需要進一步優(yōu)化siRNA的濃度和轉(zhuǎn)染時間，以充分發(fā)揮其在腫瘤治療中的潛力。6.2siRNA對胃癌細胞生物學行為影響的機制探討在細胞增殖方面，本研究結(jié)果顯示，抑制c-Met基因表達后，胃癌SGC-7901細胞的增殖能力顯著降低。這一現(xiàn)象與c-Met基因在細胞增殖信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵作用密切相關(guān)。c-Met基因編碼的蛋白是HGF的特異性受體，當HGF與c-Met受體結(jié)合后，會激活下游的PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/MAPK等信號通路。PI3K/Akt/mTOR信號通路中，PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt蛋白使其磷酸化激活，激活的Akt蛋白抑制細胞凋亡，促進細胞存活和生長，同時激活mTOR蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細胞代謝，為細胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路的激活，則使得MAPK蛋白進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞周期進程，加速胃癌細胞的增殖。當利用siRNA抑制c-Met基因表達后，HGF與c-Met受體的結(jié)合受阻，下游的PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/MAPK信號通路無法正常激活，導(dǎo)致細胞增殖相關(guān)基因的表達受到抑制，細胞周期停滯，從而抑制了胃癌細胞的增殖。在細胞遷移和侵襲方面，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染針對c-Met基因的siRNA后，胃癌SGC-7901細胞的遷移和侵襲能力明顯下降。c-Met基因在細胞遷移和侵襲過程中起著重要的調(diào)控作用，其異常表達能夠促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。c-Met激活后，通過調(diào)控細胞骨架重排、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程，使胃癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，c-Met信號通路誘導(dǎo)上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，間充質(zhì)細胞標志物N-cadherin、Vimentin等表達上調(diào)，使得細胞極性喪失，細胞間黏附力下降，從而獲得遷移和侵襲能力。c-Met還能促進基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和分泌，MMPs可以降解細胞外基質(zhì)，為胃癌細胞的遷移和侵襲開辟道路。抑制c-Met基因表達后，EMT過程受到抑制，細胞骨架重排受阻，MMPs的表達和分泌減少，從而導(dǎo)致胃癌細胞的遷移和侵襲能力顯著降低。與已有研究成果相比，本研究結(jié)果與多數(shù)相關(guān)研究一致。許多研究表明，利用siRNA抑制c-Met基因表達能夠有效抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。在一項研究中，針對c-Met基因設(shè)計的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞后，細胞的增殖活性明顯降低，細胞周期阻滯在G0/G1期，這與本研究中細胞增殖能力下降和細胞周期變化的結(jié)果相符。在細胞遷移和侵襲方面，也有研究報道，抑制c-Met基因表達可顯著減少胃癌細胞的遷移和侵襲數(shù)量，與本研究結(jié)果一致。然而，也有部分研究存在差異。一些研究發(fā)現(xiàn)，在某些特定條件下，抑制c-Met基因表達對胃癌細胞生物學行為的影響并不明顯。這可能是由于實驗條件、細胞系差異或其他因素導(dǎo)致的。不同的細胞系可能具有不同的遺傳背景和信號通路調(diào)控機制，這可能會影響siRNA對c-Met基因的抑制效果以及對細胞生物學行為的影響。實驗中使用的siRNA序列、轉(zhuǎn)染效率、作用時間等因素也可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。在本研究中，雖然通過優(yōu)化實驗條件，確保了siRNA對c-Met基因的有效抑制，但在其他研究中，這些因素可能未得到充分優(yōu)化，從而影響了實驗結(jié)果。綜上所述，siRNA通過抑制c-Met基因表達，影響了胃癌細胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的信號通路和生物學過程，從而抑制了胃癌細胞的惡性生物學行為。盡管本研究結(jié)果與多數(shù)已有研究一致，但仍存在一些差異，這需要在未來的研究中進一步深入探討，以明確siRNA抑制c-Met基因表達對胃癌細胞生物學行為影響的具體機制，為胃癌的治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)。6.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究利用siRNA成功抑制胃癌SGC-7901細胞c-Met基因表達，顯著降低了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這一結(jié)果為胃癌的臨床治療帶來了新的希望和潛在應(yīng)用前景。從理論上來說，以c-Met基因為靶點，利用siRNA進行干預(yù)，有望開發(fā)出新型的靶向治療藥物。目前胃癌的治療主要依賴手術(shù)切除、化療和放療等傳統(tǒng)方法，但這些方法存在諸多局限性，如手術(shù)創(chuàng)傷大、化療藥物副作用強、放療對正常組織有損傷等。基于siRNA技術(shù)的靶向治療藥物具有高度特異性，能夠精準地作用于c-Met基因，抑制胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，同時減少對正常細胞的損傷，為胃癌患者提供一種更為有效、安全的治療選擇。在臨床實踐中，這種治療策略可以應(yīng)用于不同分期的胃癌患者。對于早期胃癌患者，在手術(shù)切除后，可輔助使用siRNA靶向治療，進一步清除殘留的癌細胞，降低復(fù)發(fā)風險。對于無法進行手術(shù)切除的晚期胃癌患者，siRNA靶向治療可以作為一種新的治療手段，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長患者的生存期，提高生活質(zhì)量。將siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床治療手段仍面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。如前文所述，siRNA的遞送是一個關(guān)鍵問題，由于siRNA是一種大分子核酸，帶負電荷，細胞膜對其通透性較差，導(dǎo)致細胞攝取效率低。雖然目前已開發(fā)出多種遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、納米顆粒、病毒載體等，但這些遞送系統(tǒng)均存在各自的局限性。脂質(zhì)體容易引起免疫反應(yīng)，納米顆粒的制備過程復(fù)雜且成本較高，病毒載體存在潛在的整合風險。如何開發(fā)更加安全、高效、靶向性強的遞送系統(tǒng)，以確保siRNA能夠有效遞送至腫瘤細胞內(nèi)，是實現(xiàn)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵之一。siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性也是一個重要問題。血液和組織中存在大量的核酸酶，能夠迅速降解siRNA，使其半衰期較短。為提高siRNA的穩(wěn)定性，通常需要對其進行化學修飾，但化學修飾可能會影響siRNA與靶mRNA的結(jié)合能力和RNA干擾活性。因此，需要在穩(wěn)定性和活性之間找到平衡，開發(fā)出既能提高穩(wěn)定性又不影響活性的修飾方法。脫靶效應(yīng)是siRNA應(yīng)用中不可忽視的問題。當siRNA濃度過高或序列設(shè)計不合理時，可能會與非靶mRNA發(fā)生部分互補結(jié)合，導(dǎo)致非靶基因的沉默，從而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，干擾細胞的正常生理功能。為減少脫靶效應(yīng)，需要優(yōu)化siRNA的序列設(shè)計，通過生物信息學分析和實驗驗證，確保siRNA與靶mRNA具有高度的特異性結(jié)合，同時精確控制siRNA的使用濃度。siRNA還可能引發(fā)免疫原性問題。某些siRNA能夠激活Toll樣受體等免疫相關(guān)受體，導(dǎo)致炎癥因子的釋放，引發(fā)免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)不僅可能影響siRNA的治療效果，還可能對機體造成損害。如何降低siRNA的免疫原性，使其在體內(nèi)能夠安全有效地發(fā)揮作用，是目前研究的重點之一。本研究結(jié)果為胃癌的臨床治療提供了新的思路和潛在應(yīng)用前景，但要將siRNA技術(shù)真正應(yīng)用于臨床，還需要克服遞送、穩(wěn)定性、脫靶效應(yīng)和免疫原性等諸多挑戰(zhàn)。未來需要進一步深入研究，開發(fā)更加有效的遞送技術(shù)和優(yōu)化策略，以推動siRNA在胃癌治療中的臨床轉(zhuǎn)化，為胃