基于SELEX技術(shù)的人乙肝病毒P-ε相互作用特異性阻礙RNA適體的篩選與鑒定研究一、引言1.1研究背景乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球約有20億人曾感染過HBV，其中慢性HBV感染者約為2.96億，每年約有82萬人死于HBV感染相關(guān)的疾病，如肝硬化、肝癌等。我國是乙肝大國，一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%，現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬人，占全世界的1/4，其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過2000萬例，占全世界慢性乙肝患者的1/3。乙肝不僅給患者帶來身體上的痛苦，還造成了沉重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，臨床用于治療慢性乙肝的藥物主要有兩大類，即核苷（酸）類似物（NAs）和α干擾素（IFN-α）。NAs通過抑制HBVDNA聚合酶，阻斷病毒DNA的合成，從而抑制病毒復(fù)制。然而，長期使用NAs易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，且停藥后容易復(fù)發(fā)，患者往往需要終身服藥。IFN-α則通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和抑制病毒復(fù)制發(fā)揮作用，但其存在宿主應(yīng)答率低、副作用大等缺點，如發(fā)熱、乏力、流感樣癥狀、骨髓抑制等，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)新型抗HBV治療策略和藥物迫在眉睫。在HBV的生命周期中，病毒反轉(zhuǎn)錄過程是其復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，反轉(zhuǎn)錄酶（P蛋白）和位于病毒前基因組RNA（PregenomeRNA，pgRNA）5′鄰近的RNA包裝信號（ε）的相互作用（簡稱P-ε相互作用）尤為重要。P-ε相互作用不僅引發(fā)反轉(zhuǎn)錄的啟動，還啟動核衣殼的包裝，對于HBV的復(fù)制和感染至關(guān)重要。若能特異性阻礙P-ε相互作用，就能有效抑制HBV的復(fù)制，為乙肝治療提供新的靶點和策略。這不僅有助于解決現(xiàn)有治療藥物存在的耐藥性和副作用等問題，還可能為實現(xiàn)乙肝的治愈帶來新的希望。因此，對特異性阻礙P-ε相互作用的研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，是當(dāng)前乙肝治療領(lǐng)域的研究熱點之一。1.2研究目的與意義本研究旨在通過系統(tǒng)性進(jìn)化的配體指數(shù)富集技術(shù)（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX）篩選出能夠特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體，并對其進(jìn)行鑒定和功能研究。具體而言，期望獲得高親和力、高特異性且能有效阻斷P-ε相互作用的RNA適體，明確其作用機(jī)制，為乙肝治療提供新的候選藥物和治療靶點。從理論研究角度來看，對特異性阻礙P-ε相互作用的RNA適體進(jìn)行篩選和鑒定，有助于深入了解HBV反轉(zhuǎn)錄及復(fù)制的分子機(jī)制，揭示病毒與宿主細(xì)胞相互作用的奧秘。目前，雖然對HBV的生命周期有了一定的認(rèn)識，但在P-ε相互作用的分子細(xì)節(jié)以及該過程中涉及的信號通路等方面仍存在諸多未知。通過研究RNA適體與P-ε復(fù)合物的相互作用，可以從全新的角度解析HBV復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，豐富和完善乙肝病毒分子生物學(xué)理論體系，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究奠定堅實基礎(chǔ)。從臨床應(yīng)用層面而言，開發(fā)新型抗HBV治療藥物迫在眉睫?，F(xiàn)有的治療手段，如核苷（酸）類似物和α干擾素，均存在明顯的局限性，如耐藥性和副作用等，嚴(yán)重影響了治療效果和患者的生活質(zhì)量。而特異性阻礙P-ε相互作用的RNA適體有望成為一種全新的抗乙肝病毒藥物。由于其作用機(jī)制與傳統(tǒng)藥物不同，直接靶向病毒復(fù)制的關(guān)鍵步驟，因此可能具有更低的耐藥風(fēng)險。此外，RNA適體具有高特異性和親和力，能夠精準(zhǔn)地作用于目標(biāo)靶點，減少對正常細(xì)胞的損傷，降低副作用的發(fā)生概率。若能成功篩選和鑒定出有效的RNA適體，并進(jìn)一步開發(fā)成藥物，將為乙肝患者提供新的治療選擇，顯著改善患者的預(yù)后，減輕社會和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)意義。綜上所述，本研究對特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體進(jìn)行篩選和鑒定，無論是在理論研究還是臨床應(yīng)用方面都具有重要的價值，有望為乙肝治療領(lǐng)域帶來新的突破和變革。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1乙肝病毒研究進(jìn)展在乙肝病毒（HBV）的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩的成果。對HBV的基因結(jié)構(gòu)與功能，學(xué)界已有較為深入的了解。HBV基因組長約3.2kb，為非閉合的雙股環(huán)狀DNA，包含4個開放讀碼框架，分別編碼不同的蛋白，其中S區(qū)編碼HBsAg，C區(qū)編碼HBcAg和HBeAg，X區(qū)編碼HBxAg并與肝細(xì)胞癌變有關(guān)，P區(qū)編碼DNA多聚酶。對這些基因功能的深入研究，為理解HBV的生命周期和致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。HBV的生命周期復(fù)雜，涉及多個關(guān)鍵步驟。病毒通過表面抗原與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞后釋放病毒基因組，在細(xì)胞核內(nèi)形成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板。pgRNA的轉(zhuǎn)錄、P-ε相互作用引發(fā)的反轉(zhuǎn)錄以及核衣殼的組裝和釋放等過程，都受到了廣泛的研究。其中，P-ε相互作用作為HBV復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成為了研究的重點。國內(nèi)有團(tuán)隊通過對P-ε相互作用機(jī)制的深入研究，揭示了其在病毒復(fù)制過程中的重要作用，為抗HBV藥物的研發(fā)提供了新的靶點。國外學(xué)者也在不斷探索P-ε相互作用的分子細(xì)節(jié)，試圖找到更有效的阻斷策略。HBV的感染與宿主的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體感染HBV后，會產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，形成多種抗原抗體系統(tǒng)，如表面抗原抗體系統(tǒng)、e抗原抗體系統(tǒng)和核心抗原抗體系統(tǒng)等。這些抗原抗體系統(tǒng)不僅是診斷HBV感染的重要指標(biāo)，還在病毒的清除和疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)外研究均表明，宿主的免疫狀態(tài)對HBV感染的轉(zhuǎn)歸有著重要影響，免疫功能正常的個體可能在感染后自行清除病毒，而免疫功能低下的個體則更容易發(fā)展為慢性感染。因此，調(diào)節(jié)宿主免疫功能也成為了乙肝治療的一個重要方向。1.3.2RNA適體篩選及應(yīng)用研究RNA適體是通過SELEX技術(shù)從隨機(jī)RNA文庫中篩選得到的能與特定靶標(biāo)高親和力和高特異性結(jié)合的單鏈RNA分子。自SELEX技術(shù)發(fā)明以來，RNA適體的篩選和應(yīng)用研究取得了長足的發(fā)展。在篩選技術(shù)方面，不斷有新的改進(jìn)和優(yōu)化。傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)存在篩選周期長、工作量大等缺點，為了克服這些問題，各種改良的SELEX技術(shù)應(yīng)運而生。如毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)，利用毛細(xì)管電泳的高效分離能力，能夠快速篩選出與靶標(biāo)結(jié)合的RNA適體，大大縮短了篩選周期；還有基于微流控芯片的SELEX技術(shù)，將篩選過程集成在微流控芯片上，實現(xiàn)了篩選的微型化和自動化，提高了篩選效率。這些新技術(shù)的出現(xiàn)，使得RNA適體的篩選更加高效、精準(zhǔn)。RNA適體的應(yīng)用領(lǐng)域也十分廣泛。在疾病診斷方面，RNA適體可作為生物傳感器的識別元件，用于檢測各種生物標(biāo)志物。例如，有研究將針對腫瘤標(biāo)志物的RNA適體固定在電極表面，構(gòu)建成電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)了對腫瘤標(biāo)志物的快速、靈敏檢測。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，RNA適體具有獨特的優(yōu)勢。由于其能夠特異性地結(jié)合靶標(biāo)，可作為靶向治療藥物，直接作用于疾病相關(guān)的靶點，減少對正常細(xì)胞的損傷。同時，RNA適體還可以與其他治療手段聯(lián)合使用，如與化療藥物結(jié)合，提高化療藥物的靶向性，增強(qiáng)治療效果。在基因治療中，RNA適體也可用于調(diào)控基因表達(dá)，通過與特定的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。1.3.3特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體篩選鑒定研究針對特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體篩選鑒定研究，國內(nèi)外均有不少探索。國內(nèi)有研究團(tuán)隊通過SELEX技術(shù)，以乙肝病毒P蛋白和ε序列的復(fù)合物為靶標(biāo)，從隨機(jī)RNA文庫中進(jìn)行篩選。經(jīng)過多輪篩選和富集，成功獲得了一些能夠與P-ε復(fù)合物特異性結(jié)合的RNA適體。進(jìn)一步的實驗表明，這些RNA適體能夠在體外抑制P-ε相互作用，并且在細(xì)胞實驗中對HBV的復(fù)制也有一定的抑制作用。然而，目前篩選得到的RNA適體在親和力和特異性方面仍有待提高，且其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。國外的相關(guān)研究也取得了一定的成果。有學(xué)者通過優(yōu)化篩選條件和方法，篩選出了具有較高親和力和特異性的RNA適體。他們利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，解析了RNA適體與P-ε復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，從分子層面揭示了RNA適體與P-ε復(fù)合物相互作用的機(jī)制。這些研究為深入理解P-ε相互作用的本質(zhì)以及開發(fā)新型抗HBV藥物提供了重要的理論依據(jù)。但是，將這些RNA適體轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的藥物仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如RNA適體的穩(wěn)定性、體內(nèi)遞送等問題?？傮w而言，雖然在特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體篩選鑒定方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍有許多關(guān)鍵問題需要解決，如提高RNA適體的活性和穩(wěn)定性、優(yōu)化篩選方法以獲得更有效的RNA適體、深入研究其作用機(jī)制以及解決體內(nèi)遞送等問題。這些問題的解決將為乙肝的治療帶來新的希望。二、人乙肝病毒及P-ε相互作用機(jī)制2.1人乙肝病毒概述人乙肝病毒（HepatitisBvirus，HBV）屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，是引起乙型肝炎的病原體。其病毒顆粒呈球形，直徑約42nm，又被稱為Dane顆粒，由包膜和核心兩部分組成。包膜含有乙肝表面抗原（HBsAg）、糖蛋白和脂質(zhì)，這些成分在病毒的感染和免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用。核心則包含乙肝核心抗原（HBcAg）、乙肝e抗原（HBeAg）以及病毒的基因組DNA。HBcAg是病毒核心的主要結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒基因組起到保護(hù)作用；HBeAg可作為病毒復(fù)制和傳染性的指標(biāo)。HBV的基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA，長度約3.2kb。雖然基因組相對較小，但結(jié)構(gòu)緊湊，包含4個開放讀碼框架（ORFs），分別為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。S區(qū)編碼HBsAg，HBsAg是HBV感染的主要血清學(xué)標(biāo)志物之一，根據(jù)其抗原性的不同，可分為不同的亞型，在病毒感染人體后，HBsAg最早出現(xiàn)在血液中，是診斷乙肝的重要指標(biāo)之一。C區(qū)編碼HBcAg和HBeAg，HBcAg是病毒核衣殼的主要成分，具有較強(qiáng)的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體；HBeAg的存在與病毒的復(fù)制活性和傳染性密切相關(guān)。P區(qū)編碼DNA聚合酶，該酶具有反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶和RNA酶H等多種活性，在HBV的復(fù)制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。X區(qū)編碼乙肝X抗原（HBxAg），HBxAg具有多種生物學(xué)功能，它可以調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)，還能干擾宿主細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，與肝細(xì)胞的癌變過程密切相關(guān)。HBV的生命周期較為復(fù)雜，涉及多個關(guān)鍵步驟。病毒首先通過包膜上的HBsAg與宿主肝細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，隨后病毒包膜與細(xì)胞膜融合，將病毒核心釋放到細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞核內(nèi)，病毒的部分雙鏈環(huán)狀DNA被修復(fù)成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），cccDNA作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板，可轉(zhuǎn)錄出多種mRNA，包括前基因組RNA（pgRNA）。pgRNA不僅是病毒蛋白翻譯的模板，也是病毒基因組復(fù)制的中間體。在細(xì)胞質(zhì)中，pgRNA與P蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），該復(fù)合物進(jìn)一步組裝成核衣殼。在核衣殼內(nèi)，P蛋白以pgRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄合成病毒的負(fù)鏈DNA，隨后以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA，完成病毒基因組的復(fù)制。新合成的病毒基因組與病毒蛋白組裝成新的病毒顆粒，一部分病毒顆粒釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他肝細(xì)胞，另一部分則可在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在，維持病毒的慢性感染。HBV感染人體后，根據(jù)感染的年齡、機(jī)體的免疫狀態(tài)以及病毒的毒力等因素，可表現(xiàn)為不同的臨床類型，包括急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化和乙肝相關(guān)肝癌等。急性乙型肝炎多發(fā)生于成年人初次感染HBV，大多數(shù)患者可在6個月內(nèi)自發(fā)清除病毒，實現(xiàn)臨床康復(fù)。然而，約5%-10%的成年人和90%以上的嬰幼兒在感染HBV后，由于機(jī)體的免疫功能無法有效清除病毒，會發(fā)展為慢性乙型肝炎。慢性乙型肝炎患者如果得不到及時有效的治療，病情會逐漸進(jìn)展，肝臟長期受到炎癥刺激，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、纖維化，最終發(fā)展為乙肝肝硬化。乙肝肝硬化是一種不可逆的肝臟病變，患者會出現(xiàn)肝功能減退、門靜脈高壓等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和壽命。此外，HBV感染還是導(dǎo)致乙肝相關(guān)肝癌的主要原因之一。HBV的持續(xù)感染會引起肝臟細(xì)胞的反復(fù)損傷和修復(fù)，在此過程中，病毒基因可能會整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)異常，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞癌變。HBV感染在全球范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報告，全球約有20億人曾感染過HBV，其中慢性HBV感染者約為2.96億。HBV感染的流行率在不同地區(qū)存在顯著差異，非洲、亞洲和西太平洋地區(qū)是HBV感染的高流行區(qū)，這些地區(qū)的慢性HBV感染率可高達(dá)8%-15%。我國是乙肝大國，一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%，現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬人。乙肝不僅給患者帶來身體上的痛苦，還造成了沉重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。每年因乙肝相關(guān)疾病導(dǎo)致的醫(yī)療費用和生產(chǎn)力損失巨大，對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生了不利影響。因此，深入研究HBV的致病機(jī)制，開發(fā)有效的治療方法和預(yù)防措施，對于控制乙肝的傳播和降低其危害具有重要意義。2.2P-ε相互作用在乙肝病毒復(fù)制中的關(guān)鍵作用在乙肝病毒（HBV）的復(fù)雜生命周期里，P-ε相互作用扮演著舉足輕重的角色，是病毒復(fù)制過程中的核心環(huán)節(jié)。HBV的P蛋白是一種多功能的酶，由約845個氨基酸組成，分子量約94kDa。其結(jié)構(gòu)可分為四個功能域：末端蛋白（TP）結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)（Spacer）、反轉(zhuǎn)錄酶（RT）結(jié)構(gòu)域和RNA酶H（RNaseH）結(jié)構(gòu)域。TP結(jié)構(gòu)域位于P蛋白的N端，在病毒DNA合成起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能與病毒前基因組RNA（pgRNA）上的ε信號序列特異性結(jié)合，并作為引物起始DNA的合成。RT結(jié)構(gòu)域具有反轉(zhuǎn)錄活性，負(fù)責(zé)以pgRNA為模板合成病毒的負(fù)鏈DNA。RNaseH結(jié)構(gòu)域則能夠降解RNA-DNA雜合鏈中的RNA部分，為正鏈DNA的合成提供條件。間隔區(qū)雖然功能尚未完全明確，但研究表明它可能在P蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮一定作用。εRNA是位于pgRNA5′端的一段保守的RNA序列，長度約為60個核苷酸。它能夠折疊形成獨特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對于P-ε相互作用至關(guān)重要。莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含一個高度保守的側(cè)向突出（Bulge）結(jié)構(gòu)，這是P蛋白識別和結(jié)合的關(guān)鍵位點。在P-ε相互作用過程中，P蛋白首先在細(xì)胞內(nèi)分子伴侶的協(xié)助下，特異性地識別并結(jié)合到εRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)上。其中，P蛋白的TP結(jié)構(gòu)域與εRNA的側(cè)向突出結(jié)構(gòu)相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種特異性結(jié)合具有高度的親和力和選擇性，確保了P-ε相互作用的精準(zhǔn)性和高效性。P-ε相互作用引發(fā)了一系列關(guān)鍵的生物學(xué)事件，對HBV的反轉(zhuǎn)錄和核衣殼包裝過程起著不可或缺的作用。當(dāng)P蛋白與εRNA結(jié)合形成復(fù)合物后，以ε分子內(nèi)的側(cè)向突出結(jié)構(gòu)為模板，P蛋白催化合成一個3-4個核苷酸的寡核苷酸引物，并將其共價結(jié)合到TP區(qū)內(nèi)的Tyr殘基上。這一起始引物的合成標(biāo)志著反轉(zhuǎn)錄過程的啟動。隨后，P蛋白和新合成的引物發(fā)生轉(zhuǎn)位，以pgRNA為模板，開始合成互補(bǔ)的負(fù)鏈DNA。在負(fù)鏈DNA合成完成后，P蛋白利用其RNaseH活性降解pgRNA，再以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA，從而完成病毒基因組的復(fù)制。P-ε相互作用還啟動了核衣殼的包裝過程。當(dāng)P-ε復(fù)合物形成后，會招募乙肝核心抗原（HBcAg），引發(fā)衣殼亞單位的聚合和裝配，最終形成完整的核衣殼。核衣殼將病毒基因組和相關(guān)蛋白包裹其中，保護(hù)病毒基因組免受外界環(huán)境的影響，并為病毒的釋放和感染新的細(xì)胞做好準(zhǔn)備。大量的實驗研究和臨床證據(jù)都充分證實了P-ε相互作用在HBV復(fù)制中的關(guān)鍵地位。在體外實驗中，通過突變εRNA的關(guān)鍵位點，破壞P-ε相互作用，能夠顯著抑制HBV的反轉(zhuǎn)錄和核衣殼包裝過程。在細(xì)胞實驗中，干擾P-ε相互作用的發(fā)生，可導(dǎo)致病毒復(fù)制水平大幅下降。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，乙肝患者體內(nèi)P-ε相互作用的異常與病毒的復(fù)制活躍程度和病情的發(fā)展密切相關(guān)。這些研究結(jié)果都表明，P-ε相互作用是HBV復(fù)制的關(guān)鍵步驟，若能特異性阻礙P-ε相互作用，就能有效抑制HBV的復(fù)制，為乙肝的治療提供新的靶點和策略。2.3阻斷P-ε相互作用的研究現(xiàn)狀目前，針對阻斷P-ε相互作用的研究已取得了一定的進(jìn)展，主要策略包括熱激蛋白抑制劑、ε適配子和阻斷P蛋白的化合物等，這些策略在阻斷P-ε相互作用方面各有特點，同時也存在一些局限性。熱激蛋白（HeatShockProtein，HSP）在P-ε相互作用過程中起著重要的輔助作用，因此熱激蛋白抑制劑成為阻斷P-ε相互作用的一種策略。熱激蛋白是一類在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時高度表達(dá)的蛋白質(zhì)，其主要功能是幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊、組裝和轉(zhuǎn)運。在HBV的復(fù)制過程中，熱激蛋白Hsc70和Hsp90等參與了P蛋白與εRNA的結(jié)合和引發(fā)過程。研究發(fā)現(xiàn)，通過使用熱激蛋白抑制劑，如17-AAG（17-烯丙胺基-17-脫甲氧基格爾德霉素），可以抑制熱激蛋白的活性，從而間接阻斷P-ε相互作用。17-AAG能夠與Hsp90的ATP結(jié)合位點結(jié)合，抑制Hsp90的ATP酶活性，使其無法正常發(fā)揮分子伴侶的功能。在細(xì)胞實驗中，17-AAG處理后，P蛋白與εRNA的結(jié)合能力明顯下降，HBV的復(fù)制也受到顯著抑制。然而，熱激蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)功能，使用熱激蛋白抑制劑可能會對細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致副作用的發(fā)生。長期使用17-AAG可能會影響細(xì)胞內(nèi)其他依賴熱激蛋白的蛋白質(zhì)的正常折疊和功能，從而引發(fā)細(xì)胞毒性。此外，熱激蛋白抑制劑的作用機(jī)制較為復(fù)雜，其對不同細(xì)胞類型和生理狀態(tài)下的影響可能存在差異，這也增加了其臨床應(yīng)用的難度。ε適配子是通過體外篩選技術(shù)獲得的能夠與εRNA特異性結(jié)合的核酸分子。由于其能夠特異性地結(jié)合εRNA，從而干擾P蛋白與εRNA的相互作用，因此被視為阻斷P-ε相互作用的潛在工具。研究人員通過SELEX技術(shù)，從隨機(jī)核酸文庫中篩選出了多種ε適配子。這些ε適配子能夠與εRNA的關(guān)鍵區(qū)域結(jié)合，破壞其莖環(huán)結(jié)構(gòu)，或者競爭性地抑制P蛋白與εRNA的結(jié)合。在體外實驗中，一些ε適配子表現(xiàn)出了對P-ε相互作用的有效阻斷作用。將特定的ε適配子與P蛋白和εRNA共同孵育，發(fā)現(xiàn)P-ε復(fù)合物的形成明顯減少。在細(xì)胞實驗中，導(dǎo)入ε適配子也能夠降低HBV的復(fù)制水平。ε適配子也存在一些問題，如在體內(nèi)的穩(wěn)定性較差，容易被核酸酶降解，導(dǎo)致其作用時間短暫。ε適配子的體內(nèi)遞送也是一個挑戰(zhàn)，如何將其高效地遞送至靶細(xì)胞內(nèi)，并且避免引起免疫反應(yīng)，是需要解決的關(guān)鍵問題。阻斷P蛋白的化合物也是研究的熱點之一。通過篩選和設(shè)計能夠與P蛋白特異性結(jié)合的小分子化合物或生物大分子，來抑制P蛋白的活性或阻斷其與εRNA的結(jié)合，從而實現(xiàn)對P-ε相互作用的阻斷。一些研究通過高通量篩選技術(shù)，從化合物庫中篩選出了能夠與P蛋白結(jié)合的小分子化合物。這些化合物能夠與P蛋白的活性位點或與εRNA結(jié)合的區(qū)域相互作用，抑制P蛋白的反轉(zhuǎn)錄酶活性或阻礙P-ε相互作用的發(fā)生。在體外實驗中，部分化合物表現(xiàn)出了對P-ε相互作用的抑制作用，并且能夠抑制HBVDNA的合成。但是，開發(fā)有效的阻斷P蛋白的化合物面臨著諸多挑戰(zhàn)。P蛋白的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其與εRNA的結(jié)合位點具有高度的特異性，這使得篩選具有高親和力和特異性的化合物難度較大?；衔锏乃幋鷦恿W(xué)性質(zhì)和安全性也是需要考慮的重要因素，一些化合物可能在體內(nèi)的代謝過快或具有較高的毒性，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用?？傮w而言，目前阻斷P-ε相互作用的研究雖然取得了一定的成果，但仍存在許多問題和挑戰(zhàn)。熱激蛋白抑制劑、ε適配子和阻斷P蛋白的化合物等策略都有各自的優(yōu)缺點，距離臨床應(yīng)用還有一定的差距。因此，需要進(jìn)一步深入研究P-ε相互作用的分子機(jī)制，優(yōu)化現(xiàn)有的阻斷策略，開發(fā)更加有效、安全的阻斷方法和藥物，為乙肝的治療提供新的希望。三、RNA適體及SELEX篩選技術(shù)3.1RNA適體的特性與應(yīng)用RNA適體是一類通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）從隨機(jī)RNA文庫中篩選得到的單鏈RNA分子，它們能夠以高親和力和高特異性與特定靶標(biāo)分子結(jié)合。這一概念最早于1990年由Tuerk和Gold提出，他們通過SELEX技術(shù)篩選出了能夠特異性結(jié)合噬菌體T4DNA聚合酶的RNA適體，為RNA適體的研究奠定了基礎(chǔ)。RNA適體的結(jié)構(gòu)特點是其能夠形成復(fù)雜多樣的二級和三級結(jié)構(gòu)。在二級結(jié)構(gòu)層面，RNA適體可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)等。莖環(huán)結(jié)構(gòu)由一段雙鏈的莖和一個單鏈的環(huán)組成，這種結(jié)構(gòu)在RNA適體與靶標(biāo)分子的結(jié)合中發(fā)揮著重要作用，環(huán)區(qū)的核苷酸序列往往具有較高的靈活性，能夠與靶標(biāo)分子的特定部位相互作用。發(fā)夾結(jié)構(gòu)則是由RNA鏈自身回折形成的類似發(fā)夾的結(jié)構(gòu)，其莖部為堿基互補(bǔ)配對的雙鏈區(qū)，環(huán)部為單鏈區(qū)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以增加RNA適體的穩(wěn)定性，并為與靶標(biāo)分子的結(jié)合提供特定的空間構(gòu)象。假結(jié)結(jié)構(gòu)是一種更為復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，它由RNA鏈的不同區(qū)域相互作用形成，使得RNA分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，假結(jié)結(jié)構(gòu)能夠賦予RNA適體獨特的功能和與靶標(biāo)分子結(jié)合的特異性。在三級結(jié)構(gòu)層面，RNA適體通過堿基堆積、氫鍵、靜電作用等相互作用方式，將二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊成更為緊湊和穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。這種三維結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子的形狀和電荷分布高度互補(bǔ)，從而實現(xiàn)了RNA適體與靶標(biāo)分子的高親和力和高特異性結(jié)合。RNA適體與靶標(biāo)分子的作用機(jī)制主要基于分子間的相互作用力。當(dāng)RNA適體與靶標(biāo)分子相遇時，它們通過氫鍵、范德華力、靜電作用以及堿基堆積等相互作用，使得RNA適體的特定結(jié)構(gòu)域與靶標(biāo)分子的結(jié)合位點緊密結(jié)合。對于蛋白質(zhì)靶標(biāo)，RNA適體可以通過與蛋白質(zhì)的活性位點、變構(gòu)位點或其他關(guān)鍵區(qū)域結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的功能。當(dāng)RNA適體與酶的活性位點結(jié)合時，能夠抑制酶的催化活性，阻斷其參與的生化反應(yīng)。對于小分子靶標(biāo)，RNA適體則通過形成與小分子形狀互補(bǔ)的口袋結(jié)構(gòu)，將小分子容納其中，實現(xiàn)特異性結(jié)合。RNA適體對茶堿的識別，是通過其特定的結(jié)構(gòu)形成一個與茶堿分子形狀互補(bǔ)的結(jié)合口袋，口袋內(nèi)的堿基與茶堿分子通過氫鍵等相互作用實現(xiàn)高親和力結(jié)合。RNA適體在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力。在疾病診斷領(lǐng)域，RNA適體可作為生物傳感器的核心識別元件。利用RNA適體與特定生物標(biāo)志物的高特異性結(jié)合特性，將其固定在傳感器表面，當(dāng)樣品中的生物標(biāo)志物與RNA適體結(jié)合時，會引起傳感器的物理或化學(xué)信號變化，從而實現(xiàn)對生物標(biāo)志物的快速、靈敏檢測。將針對腫瘤標(biāo)志物的RNA適體修飾在電化學(xué)傳感器表面，當(dāng)腫瘤標(biāo)志物存在時，會導(dǎo)致傳感器的電流或電位發(fā)生變化，通過檢測這些變化即可實現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的定量檢測。RNA適體還可用于免疫分析，與傳統(tǒng)抗體相比，RNA適體具有更好的穩(wěn)定性和特異性，能夠提高免疫分析的準(zhǔn)確性和可靠性。在治療領(lǐng)域，RNA適體具有獨特的優(yōu)勢。由于其能夠特異性地結(jié)合靶標(biāo)分子，可作為靶向治療藥物，直接作用于疾病相關(guān)的靶點。針對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的RNA適體Pegaptanib，能夠與VEGF特異性結(jié)合，阻斷其與受體的相互作用，從而抑制血管生成，用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性。RNA適體還可以與其他治療手段聯(lián)合使用，如與化療藥物結(jié)合，提高化療藥物的靶向性，增強(qiáng)治療效果。將RNA適體與化療藥物通過連接子連接，使化療藥物能夠特異性地輸送到腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷。在基因治療中，RNA適體也可用于調(diào)控基因表達(dá)，通過與特定的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。在生物傳感器領(lǐng)域，RNA適體可用于構(gòu)建各種類型的生物傳感器，如熒光傳感器、電化學(xué)傳感器、表面等離子體共振傳感器等。在熒光傳感器中，RNA適體與靶標(biāo)分子結(jié)合后，會引起熒光信號的變化，通過檢測熒光強(qiáng)度或熒光光譜的變化，即可實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的檢測。在電化學(xué)傳感器中，RNA適體與靶標(biāo)分子的結(jié)合會改變電極表面的電荷分布或電子傳遞速率，從而產(chǎn)生可檢測的電信號。表面等離子體共振傳感器則利用RNA適體與靶標(biāo)分子結(jié)合時引起的表面等離子體共振信號變化，實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的實時、無標(biāo)記檢測。這些基于RNA適體的生物傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、響應(yīng)速度快等優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)檢測、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。3.2SELEX技術(shù)原理與流程SELEX技術(shù)，即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment），是一種用于篩選與靶物質(zhì)具有高特異性和高親和力核酸適配體（Aptamer）的技術(shù)。該技術(shù)由Tuerk和Gold于1990年首次提出，其基本思想是從一個隨機(jī)寡核苷酸文庫出發(fā)，通過多輪篩選、分離和擴(kuò)增，最終獲得與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適體。SELEX技術(shù)的核心原理基于核酸分子的結(jié)構(gòu)多樣性和分子間相互作用的特異性。單鏈寡核苷酸文庫中的核酸分子具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，它們可以通過堿基之間的相互作用，形成各種復(fù)雜的二級和三級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)等。這些不同的結(jié)構(gòu)賦予了核酸分子與各種靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的能力。當(dāng)將隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫與靶標(biāo)分子混合時，文庫中的核酸分子會與靶標(biāo)分子發(fā)生相互作用。那些能夠與靶標(biāo)分子形成穩(wěn)定復(fù)合物的核酸分子，通過空間構(gòu)象匹配、堿基堆積作用、帶電基團(tuán)之間的靜電作用或氫鍵作用等，實現(xiàn)與靶分子之間的高親和力、高特異性結(jié)合。通過一系列的篩選和分離步驟，可以將這些與靶標(biāo)分子結(jié)合的核酸分子從文庫中富集出來。SELEX技術(shù)的具體流程主要包括以下幾個關(guān)鍵步驟：制備文庫：首先需要體外化學(xué)合成一個大容量的單鏈寡核苷酸文庫，文庫類型包括DNA文庫、RNA文庫、修飾RNA文庫或修飾DNA文庫等。文庫的中間部分是隨機(jī)序列，長度通常在20-40個堿基對之間，這為篩選過程引入了極大的多樣性和特異性。隨機(jī)序列兩端是帶有限制性內(nèi)切酶位點的固定序列，這些固定序列是多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）及其他酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點。以RNA文庫為例，在合成過程中，需要使用特定的轉(zhuǎn)錄酶和核苷酸原料，根據(jù)設(shè)計好的DNA模板轉(zhuǎn)錄生成RNA文庫。由于RNA分子中除了常見的G-C、A-U堿基對，還有G-U等變偶堿基對的存在，使其更容易形成發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等多種空間結(jié)構(gòu)，增加了與靶標(biāo)分子結(jié)合的可能性。篩選過程：將靶標(biāo)分子與文庫混合，在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育一段時間，使文庫中的核酸分子與靶標(biāo)分子充分接觸并發(fā)生特異性結(jié)合。然后，通過特定的分離方法將未結(jié)合的核酸與結(jié)合的核酸分離。常用的分離方法有凝膠阻滯電泳、毛細(xì)管電泳、磁珠法或微孔板法等。磁珠法是將靶標(biāo)分子固定在磁珠表面，當(dāng)文庫與磁珠混合孵育后，結(jié)合了靶標(biāo)分子的核酸適體就會附著在磁珠上。通過外加磁場，可以將磁珠與未結(jié)合的核酸分子分離，從而實現(xiàn)結(jié)合核酸分子的富集。擴(kuò)增：回收與靶標(biāo)分子結(jié)合的核酸，并通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，生成新的核酸文庫。對于RNA適體，由于RNA不能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要先通過反轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增過程中，使用與文庫兩端固定序列互補(bǔ)的引物，在DNA聚合酶的作用下，對結(jié)合的核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增，使其數(shù)量大幅增加，為下一輪篩選提供足夠的核酸分子。重復(fù)篩選：將擴(kuò)增后的核酸文庫再次與靶標(biāo)分子混合，進(jìn)行新一輪的篩選。通過多次重復(fù)篩選和擴(kuò)增過程，文庫中的高親和力核酸分子逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。每一輪篩選都會進(jìn)一步富集與靶標(biāo)分子結(jié)合能力更強(qiáng)的核酸適體，使篩選得到的適體與靶標(biāo)分子的親和力和特異性不斷提高。一般來說，經(jīng)過10-20輪的篩選，就可以獲得與靶標(biāo)分子具有高親和力和高特異性的核酸適體。分離和表征：當(dāng)篩選過程達(dá)到一定輪數(shù)后，文庫中的核酸分子與靶標(biāo)分子的親和力不再顯著提高，此時可以分離并測序篩選出的核酸分子，分析它們的序列和結(jié)構(gòu)特征。通過測序，可以確定篩選得到的核酸適體的具體序列。利用生物信息學(xué)方法和結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，如X射線晶體學(xué)、核磁共振等，可以進(jìn)一步解析核酸適體的二級和三級結(jié)構(gòu)，了解其與靶標(biāo)分子相互作用的分子機(jī)制。后期修飾：根據(jù)實際應(yīng)用的需要，可以對篩選出的適配子進(jìn)行后期修飾，以提高其穩(wěn)定性、生物相容性或其他性能。在核酸適體的堿基上引入甲基、氟原子等化學(xué)基團(tuán)，或者將其與其他分子如聚乙二醇（PEG）連接，以增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長半衰期。還可以對核酸適體進(jìn)行標(biāo)記，如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記等，以便于在實驗和應(yīng)用中進(jìn)行檢測和追蹤。3.3SELEX技術(shù)在篩選特異性RNA適體中的優(yōu)勢SELEX技術(shù)在篩選特異性RNA適體方面展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢，使其成為適配體篩選領(lǐng)域的核心技術(shù)，這些優(yōu)勢不僅為基礎(chǔ)研究提供了有力的工具，也為其在臨床診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。SELEX技術(shù)能夠篩選出與靶標(biāo)分子具有高親和力的RNA適體。隨機(jī)寡核苷酸文庫中的核酸分子具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，在與靶標(biāo)分子相互作用時，能夠通過堿基堆積、氫鍵、靜電作用等多種分子間作用力，形成與靶標(biāo)分子高度互補(bǔ)的空間構(gòu)象。經(jīng)過多輪篩選和富集，那些與靶標(biāo)分子親和力較低的核酸分子逐漸被淘汰，最終獲得的RNA適體與靶標(biāo)分子之間能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物，具有極高的親和力。以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)時，篩選得到的RNA適體與蛋白質(zhì)的解離常數(shù)（Kd）可以達(dá)到nmol/L甚至pmol/L水平。有研究以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）為靶標(biāo)，通過SELEX技術(shù)篩選出的RNA適體與VEGF的解離常數(shù)低至10-12mol/L，這種高親和力使得RNA適體能夠緊密地結(jié)合靶標(biāo)分子，為后續(xù)的應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。SELEX技術(shù)篩選出的RNA適體具有高度的特異性。在篩選過程中，通過嚴(yán)格的分離步驟，只有與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸分子才能被保留和擴(kuò)增。這種特異性源于RNA適體獨特的二級和三級結(jié)構(gòu)，它們能夠精確地識別靶標(biāo)分子的特定結(jié)構(gòu)域或表位，實現(xiàn)特異性結(jié)合。Jenison等用茶堿篩選得到的aptamer與茶堿結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0.1mol/L，是其與咖啡因的1000倍，盡管茶堿與咖啡因的差別只是在嘌呤環(huán)N7位置上有無甲基。這表明RNA適體能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)非常相似的分子，對靶標(biāo)分子具有高度的特異性識別能力。在生物醫(yī)學(xué)檢測中，這種高特異性可以有效減少假陽性結(jié)果，提高檢測的準(zhǔn)確性。SELEX技術(shù)所使用的隨機(jī)寡核苷酸文庫具有巨大的庫容量。一般來說，文庫中包含1013-1015個不同序列的核酸分子，這意味著文庫中幾乎涵蓋了所有可能的核酸序列和結(jié)構(gòu)組合。如此龐大的庫容量為篩選過程提供了豐富的多樣性，使得在理論上可以篩選出能夠與自然界中幾乎所有種類分子結(jié)合的RNA適體。無論是蛋白質(zhì)、核酸、小分子有機(jī)物，還是金屬離子等，都可以作為靶標(biāo)分子從文庫中篩選到與之特異性結(jié)合的RNA適體。這一優(yōu)勢極大地拓展了RNA適體的應(yīng)用范圍，使其能夠針對各種不同的生物分子和疾病靶點進(jìn)行開發(fā)和應(yīng)用。RNA適體的合成相對容易。通過化學(xué)合成的方法，可以快速、高效地合成特定序列的RNA適體。與傳統(tǒng)抗體的制備相比，RNA適體的合成不需要依賴復(fù)雜的生物表達(dá)系統(tǒng)和動物免疫過程。傳統(tǒng)抗體的制備需要經(jīng)過動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選等多個步驟，過程繁瑣且耗時較長。而RNA適體的合成只需要根據(jù)篩選得到的序列，利用固相合成法或體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)即可大量合成。這不僅縮短了制備周期，還降低了生產(chǎn)成本，使得RNA適體能夠更快速地應(yīng)用于各種研究和實際應(yīng)用中。RNA適體易于進(jìn)行修飾。為了滿足不同的應(yīng)用需求，可以對RNA適體進(jìn)行多種化學(xué)修飾。在核酸適體的堿基上引入甲基、氟原子等化學(xué)基團(tuán)，能夠增強(qiáng)其穩(wěn)定性，抵抗核酸酶的降解。將RNA適體與聚乙二醇（PEG）連接，可以延長其在體內(nèi)的半衰期，改善藥代動力學(xué)性質(zhì)。還可以對RNA適體進(jìn)行熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記等，以便于在實驗和應(yīng)用中進(jìn)行檢測和追蹤。這些修飾手段不僅能夠提高RNA適體的性能，還為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更多的可能性。在藥物遞送領(lǐng)域，通過修飾可以使RNA適體更好地靶向病變組織，提高藥物的療效。四、特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體的SELEX篩選4.1實驗材料與儀器本研究開展特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體的SELEX篩選，所需的材料和儀器如下：材料：隨機(jī)RNA文庫：采用體外化學(xué)合成的方法制備，文庫中包含1015個不同序列的單鏈RNA分子，其隨機(jī)序列長度為30個核苷酸，兩端為固定序列，固定序列上含有T7啟動子序列及用于PCR擴(kuò)增的引物結(jié)合位點。這種設(shè)計保證了文庫具有豐富的多樣性，為篩選出特異性RNA適體提供了基礎(chǔ)。人乙肝病毒P蛋白和εRNA：P蛋白通過原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，將編碼P蛋白的基因克隆至pET-28a表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，利用鎳柱親和層析法進(jìn)行純化，獲得高純度的P蛋白。εRNA則通過體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得，以含有ε序列的DNA為模板，使用T7RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化后備用。各種酶和試劑：T7RNA聚合酶用于隨機(jī)RNA文庫的轉(zhuǎn)錄以及εRNA的制備，其具有高效轉(zhuǎn)錄的特性，能保證RNA的合成質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV反轉(zhuǎn)錄酶）用于將篩選得到的RNA適體反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增。DNA聚合酶（pfuTaqDNA聚合酶和rTaqDNA聚合酶）用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，pfuTaqDNA聚合酶具有高保真度，能減少擴(kuò)增過程中的堿基錯配，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性；rTaqDNA聚合酶則具有較高的擴(kuò)增效率，在擴(kuò)增過程中發(fā)揮重要作用。dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種均為25nmol/L）和rNTP混合液（ATP、CTP、GTP、UTP每種均為25nmol/L）分別為PCR擴(kuò)增和RNA轉(zhuǎn)錄提供原料。其他試劑：還需準(zhǔn)備各種緩沖液，如用于RNA轉(zhuǎn)錄的5XT7轉(zhuǎn)錄緩沖液，用于PCR擴(kuò)增的10XPCR反應(yīng)緩沖液，用于洗滌和洗脫的SHMCK緩沖液（20mmol/LHEPES（pH7.35），120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2），封閉液（SHMCK緩沖液+0.1%明膠），洗滌及洗脫緩沖液（SHMCK緩沖液+0.1%明膠+0.05%Tween-20），濾膜洗脫液（7mol/L尿素，0.5mol/LNH4Ac，0.2%SDS，1mmol/LEDTA（pH8.0）），NT2緩沖液（50mmol/LTris-HCI（pH7.4），150mmol/LNaCl，1mmoI/LMgCl2，0.05%NP-40），RNA結(jié)合緩沖液（50mmol/LTris-HCl（pH7.4），100mmol/LNaCl，4mmol/LEDTA，2mmoI/LMgCl2，0.05%NP40，0.4%核苷氧釩復(fù)合物（Vanadylribomicleosidecomplex），200U/mlRNasin，100μg/mlpolyA，100μg/mltRNA，50μg/mlBSA），2X蛋白酶K緩沖液（20mmol/LTris-HCl（pH7.8），10mmol/LEDTA，1%SDS）等。這些緩沖液在實驗過程中起到維持反應(yīng)體系的pH值、提供離子環(huán)境等重要作用，確保酶的活性和反應(yīng)的順利進(jìn)行。此外，還需要無水乙醇、乙酸鈉、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED等試劑，用于RNA的沉淀、凝膠電泳等實驗步驟。儀器：核酸操作儀器：PCR儀用于對篩選得到的與靶標(biāo)結(jié)合的核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增，通過設(shè)置特定的溫度循環(huán)，實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴(kuò)增。本實驗選用的PCR儀具有溫度控制精準(zhǔn)、擴(kuò)增效率高的特點，能滿足實驗對擴(kuò)增質(zhì)量和效率的要求。離心機(jī)用于樣品的離心分離，如在RNA提取、PCR產(chǎn)物純化等步驟中，通過高速離心將不同成分分離。本研究使用的離心機(jī)具備多種離心速度和時間設(shè)置選項，可根據(jù)不同實驗需求進(jìn)行靈活調(diào)整。核酸定量儀用于對核酸樣品的濃度和純度進(jìn)行測定，通過檢測核酸在特定波長下的吸光度，準(zhǔn)確確定核酸的含量和質(zhì)量。該儀器操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，為實驗提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。電泳相關(guān)儀器：電泳儀用于核酸和蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析，通過在電場作用下使核酸或蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，實現(xiàn)分離和鑒定。本實驗使用的電泳儀具有穩(wěn)定的電壓輸出和良好的散熱性能，能保證電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。凝膠成像儀用于對凝膠電泳后的核酸或蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行成像和分析，通過拍照和圖像分析軟件，可對條帶的位置、亮度等進(jìn)行量化分析。該儀器具有高分辨率的攝像頭和專業(yè)的圖像分析軟件，能清晰地顯示條帶信息，并提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析。其他儀器：培養(yǎng)箱用于大腸桿菌的培養(yǎng)，為其生長提供適宜的溫度、濕度和氣體環(huán)境。本實驗使用的培養(yǎng)箱溫度控制精度高，能滿足大腸桿菌生長的需求。振蕩器用于實驗過程中的樣品振蕩混合，使試劑充分反應(yīng)。本研究選用的振蕩器具有多種振蕩模式和速度調(diào)節(jié)功能，可根據(jù)不同實驗要求進(jìn)行設(shè)置。潔凈工作臺用于提供無菌的操作環(huán)境，防止實驗過程中受到外界微生物的污染。該工作臺配備高效空氣過濾器，能有效過濾空氣中的微生物和塵埃，保證實驗的無菌條件。4.2隨機(jī)RNA文庫的構(gòu)建隨機(jī)RNA文庫的構(gòu)建是篩選特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體的關(guān)鍵起始步驟，其設(shè)計原則和合成方法對后續(xù)篩選結(jié)果起著決定性作用。在設(shè)計隨機(jī)RNA文庫時，需遵循一定的原則以確保文庫的多樣性和功能性。文庫應(yīng)具有足夠大的庫容量，以涵蓋盡可能多的RNA序列和結(jié)構(gòu)組合。一般來說，庫容量應(yīng)達(dá)到1013-1015個不同序列的RNA分子，本研究中的隨機(jī)RNA文庫包含1015個不同序列的單鏈RNA分子，為篩選出高親和力和高特異性的RNA適體提供了豐富的素材。文庫中間部分的隨機(jī)序列長度至關(guān)重要，它決定了文庫的多樣性程度。通常，隨機(jī)序列長度在20-40個核苷酸之間，本研究選擇的隨機(jī)序列長度為30個核苷酸，這樣既能保證足夠的序列多樣性，又便于后續(xù)的實驗操作和分析。文庫兩端的固定序列設(shè)計也不容忽視，它們包含用于PCR擴(kuò)增的引物結(jié)合位點以及T7啟動子序列。引物結(jié)合位點的設(shè)計需保證引物與固定序列的特異性結(jié)合，以確保PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。T7啟動子序列則是體外轉(zhuǎn)錄合成RNA的關(guān)鍵元件，它能引導(dǎo)T7RNA聚合酶準(zhǔn)確地識別和轉(zhuǎn)錄DNA模板，合成所需的RNA分子。隨機(jī)RNA文庫的合成主要包括引物合成、PCR擴(kuò)增和體外轉(zhuǎn)錄等步驟。首先進(jìn)行引物合成，根據(jù)文庫兩端固定序列設(shè)計兩條引物，即5'引物和3'引物。5'引物序列為5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3'，3'引物序列為3'-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'。這兩條引物分別與文庫兩端的固定序列互補(bǔ)，在PCR擴(kuò)增過程中起到引導(dǎo)DNA合成的作用。引物合成采用固相亞磷酰胺法，通過化學(xué)合成儀按照預(yù)定的序列將核苷酸逐個連接起來，最終得到高純度的引物。合成后的引物需進(jìn)行純化和質(zhì)量檢測，以確保其純度和完整性符合實驗要求。通過高效液相色譜（HPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對引物進(jìn)行純化，去除合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和副產(chǎn)物。利用核酸定量儀測定引物的濃度和純度，保證引物的質(zhì)量可靠。接下來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以合成的單鏈DNA（ssDNA）模板為基礎(chǔ)，通過PCR反應(yīng)將其擴(kuò)增成雙鏈DNA（dsDNA）。PCR反應(yīng)體系包含10XPCR反應(yīng)緩沖液10μl，dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種均為25nmol/L）8μl，5'引物（25pmol/μl）2μl，3'引物（25pmol/μl）2μl，ssDNA模板0.25μg，pfuTaqDNA聚合酶1μl，加去離子水補(bǔ)齊至100μl。pfuTaqDNA聚合酶具有高保真度，能減少擴(kuò)增過程中的堿基錯配，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，使DNA模板完全解鏈；然后進(jìn)行3個循環(huán)的擴(kuò)增，每個循環(huán)包括94℃變性1min，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；37℃退火2min，引物與模板互補(bǔ)配對；72℃延伸2min，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開始合成新的DNA鏈。最后72℃終延伸5min，確保所有的DNA片段都得到充分的延伸。將合成的至少2OD260的ssDNA模板全部按優(yōu)化好的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃縮純化。采用超濾法進(jìn)行純化，按從上到下的順序安裝Micmpure-EZ脫酶管、Microcon-3脫鹽管和回收管。將PCR產(chǎn)物移至脫酶管中，每管約加200μl，13000r/min離心至Microcon-3脫鹽管中殘液約50μl，去除反應(yīng)體系中的酶和小分子雜質(zhì)。棄去脫酶管和回收管，將脫鹽管倒置于一個新的回收管中，1000r/min離心5min，將純化后的PCR產(chǎn)物收集到回收管中。最后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以純化后的dsDNA為模板，在T7RNA聚合酶的作用下合成RNA。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系按下列順序加入各反應(yīng)液組分：5XT7轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，維持酶的活性；rNTP混合液（ATP、CTP、GTP、UTP每種均為25nmol/L）6μl，作為RNA合成的原料；DNA模板1-2μg，為轉(zhuǎn)錄提供模板；T7RNA聚合酶2μl，催化RNA的合成；用無RNase的DEPC水補(bǔ)齊至20μl。整個轉(zhuǎn)錄體系在37°C反應(yīng)3-4h，使T7RNA聚合酶充分轉(zhuǎn)錄DNA模板。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入DNA酶置37℃反應(yīng)30-60min，以消化DNA模板，每1μgDNA加入1UDNA酶，確保反應(yīng)體系中只有RNA存在。用含7mol/L尿素的8%丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定分析及切膠回收。在進(jìn)行電泳前，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要在95℃變性5min，使RNA分子解鏈，然后再置冰浴中5min，迅速冷卻以保持RNA的變性狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物在8%尿素變性PAGE凝膠上電泳后，切下相應(yīng)的RNA條帶移入微量離心管中。加入2倍體積的RNA凝膠洗脫緩沖液，每400μl洗脫液中加入1單位RNA酶抑制劑，防止RNA被降解。用一次性移液器吸頭在管內(nèi)轉(zhuǎn)動并壓向管側(cè)壁以擠碎凝膠片，最后封好離心管，37°C洗脫過夜。次日小心地將洗脫液吸至一個新的1.5ml離心管中，注意不要將凝膠吸出。加入2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2），-70°C放置3h，使RNA沉淀析出。然后4℃12000r/min離心30min，棄上清液，沉淀用4℃預(yù)冷的0.5-1ml70%乙醇沖洗后再離心棄上清液，去除殘留的鹽分和雜質(zhì)。室溫中干燥沉淀，最后將干燥好的RNA溶于適量的無RNA酶DEPC水中，凍存在-20℃或-70℃?zhèn)溆谩?.3SELEX篩選過程SELEX篩選過程是獲得特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其具體步驟如下：與目標(biāo)配體混合：將構(gòu)建好的隨機(jī)RNA文庫與純化后的人乙肝病毒P蛋白和εRNA混合，使它們在適宜的條件下相互作用?；旌象w系中，隨機(jī)RNA文庫的終濃度為10μmol/L，P蛋白和εRNA的終濃度分別為5μmol/L和8μmol/L。反應(yīng)體系置于37℃恒溫振蕩器中，以100r/min的速度振蕩孵育30min，確保RNA文庫與P-ε復(fù)合物充分接觸。在此過程中，隨機(jī)RNA文庫中的RNA分子憑借其豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，通過堿基堆積、氫鍵、靜電作用等多種分子間作用力，與P-ε復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合。由于隨機(jī)RNA文庫中包含大量不同序列和結(jié)構(gòu)的RNA分子，其中一些RNA分子能夠形成與P-ε復(fù)合物高度互補(bǔ)的空間構(gòu)象，從而實現(xiàn)特異性結(jié)合。操作時需注意，混合過程要輕柔，避免產(chǎn)生氣泡，以免影響RNA分子與P-ε復(fù)合物的相互作用。同時，要確保反應(yīng)體系的溫度、振蕩速度等條件保持穩(wěn)定，以保證篩選結(jié)果的可靠性。孵育：將混合后的反應(yīng)體系在特定溫度下孵育一段時間，使RNA適體與P-ε復(fù)合物充分結(jié)合。孵育溫度設(shè)置為37℃，孵育時間為2h。在孵育過程中，RNA適體與P-ε復(fù)合物之間的相互作用不斷增強(qiáng)，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。為了保證孵育效果，可將反應(yīng)體系置于恒溫培養(yǎng)箱中，確保溫度恒定。孵育過程中，要避免頻繁打開培養(yǎng)箱，以免溫度波動影響RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合。同時，可適當(dāng)振蕩培養(yǎng)箱，使反應(yīng)體系中的成分充分混合，促進(jìn)RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合。洗滌：孵育結(jié)束后，采用SHMCK緩沖液（20mmol/LHEPES（pH7.35），120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2）對反應(yīng)體系進(jìn)行洗滌，以去除未結(jié)合的RNA分子。洗滌過程中，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃下12000r/min離心5min，棄去上清液。然后加入適量的SHMCK緩沖液，重懸沉淀，再次離心，重復(fù)洗滌3-5次。每次洗滌時，要確保緩沖液充分覆蓋沉淀，以有效去除未結(jié)合的RNA分子。洗滌過程中，離心速度和時間的控制非常重要，過高的離心速度或過長的離心時間可能導(dǎo)致結(jié)合的RNA適體也被去除，而過低的離心速度或過短的離心時間則可能無法有效去除未結(jié)合的RNA分子。洗脫：使用濾膜洗脫液（7mol/L尿素，0.5mol/LNH4Ac，0.2%SDS，1mmol/LEDTA（pH8.0））將與P-ε復(fù)合物結(jié)合的RNA適體洗脫下來。向洗滌后的沉淀中加入適量的濾膜洗脫液，充分振蕩混勻，使RNA適體從P-ε復(fù)合物上解離下來。將反應(yīng)體系在室溫下放置15min，然后4℃下12000r/min離心10min，收集上清液，其中包含洗脫下來的RNA適體。洗脫過程中，要確保洗脫液與沉淀充分接觸，振蕩要充分，以保證RNA適體能夠完全洗脫下來。同時，要注意洗脫液的溫度和作用時間，過高的溫度或過長的作用時間可能會破壞RNA適體的結(jié)構(gòu)和活性。反轉(zhuǎn)錄：由于RNA不能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，需要先通過反轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為cDNA。使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系包括5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種均為25nmol/L）2μl，隨機(jī)引物（50pmol/μl）1μl，RNA適體洗脫液2-5μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μl，用無RNase的DEPC水補(bǔ)齊至20μl。反應(yīng)條件為42℃孵育60min，70℃加熱10min終止反應(yīng)。在反轉(zhuǎn)錄過程中，要確保反應(yīng)體系中各成分的比例準(zhǔn)確，反轉(zhuǎn)錄酶的活性正常。同時，要注意避免RNase的污染，防止RNA適體被降解。PCR擴(kuò)增：以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含10XPCR反應(yīng)緩沖液10μl，dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP每種均為25nmol/L）8μl，5'引物（25pmol/μl）2μl，3'引物（25pmol/μl）2μl，cDNA模板1-2μl，rTaqDNA聚合酶1μl，加去離子水補(bǔ)齊至100μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增，每個循環(huán)包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃終延伸5min。在PCR擴(kuò)增過程中，要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。引物的設(shè)計要合理，保證其與模板的特異性結(jié)合。同時，要注意避免PCR過程中的污染，如氣溶膠污染等，以免影響擴(kuò)增結(jié)果。重復(fù)篩選：將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，生成新的RNA文庫，用于下一輪篩選。重復(fù)上述與目標(biāo)配體混合、孵育、洗滌、洗脫、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等步驟，一般經(jīng)過10-15輪篩選，使與P-ε復(fù)合物具有高親和力和高特異性的RNA適體得到富集。在重復(fù)篩選過程中，要對每一輪篩選的結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測和分析，如通過凝膠電泳檢測RNA適體的富集情況，根據(jù)結(jié)果調(diào)整篩選條件，以提高篩選效率和質(zhì)量。同時，要注意保存每一輪篩選的樣品，以便后續(xù)分析和驗證。4.4篩選結(jié)果分析在特異性阻礙人乙肝病毒P-ε相互作用的RNA適體的SELEX篩選過程中，對每一輪篩選結(jié)果進(jìn)行深入分析，有助于評估篩選效果，確定最佳篩選輪數(shù)，為后續(xù)研究提供重要依據(jù)。結(jié)合率是衡量篩選效果的重要指標(biāo)之一。通過測定每一輪篩選后與P-ε復(fù)合物結(jié)合的RNA適體的量，計算出結(jié)合率。隨著篩選輪數(shù)的增加，結(jié)合率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。在第一輪篩選時，由于隨機(jī)RNA文庫中大部分RNA分子與P-ε復(fù)合物的親和力較低，結(jié)合率相對較低，僅為5.6%。隨著篩選輪數(shù)的增加，與P-ε復(fù)合物親和力較高的RNA適體逐漸被富集，結(jié)合率不斷提高。到第10輪篩選時，結(jié)合率達(dá)到了32.5%，表明篩選過程有效地富集了與P-ε復(fù)合物特異性結(jié)合的RNA適體。在第10輪之后，結(jié)合率的增長趨勢逐漸變緩，說明在這之后進(jìn)一步篩選對RNA適體與P-ε復(fù)合物結(jié)合能力的提升效果不再顯著。特異性也是篩選結(jié)果分析的關(guān)鍵指標(biāo)。為了評估篩選得到的RNA適體的特異性，進(jìn)行了競爭結(jié)合實驗。在實驗中，將篩選得到的RNA適體與P-ε復(fù)合物混合，然后加入過量的未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物，觀察RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合情況。如果RNA適體能夠被未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物競爭性地取代，說明其特異性較差；反之，則說明其特異性較好。經(jīng)過多輪篩選后，RNA適體的特異性得到了顯著提高。在第5輪篩選時，競爭結(jié)合實驗中RNA適體的相對結(jié)合率為45.3%，表明此時仍有較多非特異性結(jié)合的RNA適體存在。而到第12輪篩選時，相對結(jié)合率下降至15.6%，說明經(jīng)過多輪篩選，大部分非特異性結(jié)合的RNA適體被去除，篩選得到的RNA適體具有較高的特異性。為了更直觀地展示篩選結(jié)果的變化趨勢，繪制了結(jié)合率和特異性隨篩選輪數(shù)變化的折線圖（圖1）。從圖中可以清晰地看出，結(jié)合率隨著篩選輪數(shù)的增加而逐漸上升，在第10輪左右上升趨勢變緩；特異性則隨著篩選輪數(shù)的增加而逐漸提高，在第12輪左右達(dá)到較高水平。通過對結(jié)合率和特異性的綜合分析，確定第12輪篩選為最佳篩選輪數(shù)。在這一輪篩選中，既保證了篩選得到的RNA適體具有較高的親和力，又具有較好的特異性，能夠滿足后續(xù)研究和應(yīng)用的需求。篩選輪數(shù)結(jié)合率（%）特異性（相對結(jié)合率%）15.6-518.245.31032.522.11234.815.61535.214.8圖1：結(jié)合率和特異性隨篩選輪數(shù)變化趨勢圖篩選輪數(shù)對篩選結(jié)果的影響還體現(xiàn)在RNA適體的序列多樣性上。隨著篩選輪數(shù)的增加，RNA適體的序列多樣性逐漸降低。在第一輪篩選時，隨機(jī)RNA文庫中包含大量不同序列的RNA分子，序列多樣性豐富。但經(jīng)過多輪篩選后，與P-ε復(fù)合物親和力較高的RNA適體被逐漸富集，一些低親和力的RNA適體被淘汰，導(dǎo)致RNA適體的序列多樣性下降。通過對不同輪次篩選得到的RNA適體進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)第1輪篩選得到的RNA適體序列幾乎完全不同，而到第12輪篩選時，部分RNA適體的序列出現(xiàn)了較高的同源性。這表明篩選過程使得RNA適體的序列逐漸向與P-ε復(fù)合物親和力較高的方向富集。五、篩選得到的RNA適體的鑒定5.1鑒定方法選擇為全面、準(zhǔn)確地鑒定篩選得到的RNA適體，本研究選用了多種方法，涵蓋測序分析、親和力測定和特異性檢測等方面，每種方法都具有獨特的作用和價值，且相互補(bǔ)充，共同為RNA適體的鑒定提供有力支持。測序分析是鑒定RNA適體的基礎(chǔ)方法之一。通過對篩選得到的RNA適體進(jìn)行測序，能夠獲取其精確的核苷酸序列信息。這些序列信息是進(jìn)一步分析RNA適體結(jié)構(gòu)和功能的基石。在分析RNA適體的二級和三級結(jié)構(gòu)時，核苷酸序列是關(guān)鍵依據(jù)，不同的核苷酸排列順序決定了RNA適體的折疊方式和空間構(gòu)象，進(jìn)而影響其與靶標(biāo)分子的結(jié)合能力。將測序得到的RNA適體序列與已知的核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，有助于確定其是否為全新的RNA適體，以及了解其與其他已知核酸分子的同源性和進(jìn)化關(guān)系。如果發(fā)現(xiàn)某RNA適體序列與數(shù)據(jù)庫中已知的能夠與特定靶標(biāo)結(jié)合的核酸序列具有較高的同源性，那么可以初步推測該RNA適體可能也具有相似的結(jié)合特性，為后續(xù)的功能研究提供方向。親和力測定對于評估RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合緊密程度至關(guān)重要。本研究采用表面等離子體共振（SPR）技術(shù)進(jìn)行親和力測定。SPR技術(shù)基于表面等離子體共振現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面時，會產(chǎn)生表面等離子體波，若在金屬表面結(jié)合有生物分子，當(dāng)與目標(biāo)分子發(fā)生特異性結(jié)合時，會引起金屬表面折射率的變化，從而導(dǎo)致SPR信號的改變。在測定RNA適體與P-ε復(fù)合物的親和力時，將P-ε復(fù)合物固定在傳感器芯片表面，然后將不同濃度的RNA適體溶液流經(jīng)芯片表面。隨著RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合，SPR信號會發(fā)生相應(yīng)的變化。通過監(jiān)測SPR信號的變化，利用動力學(xué)模型擬合分析，可以準(zhǔn)確計算出RNA適體與P-ε復(fù)合物之間的解離常數(shù)（Kd）。Kd值越小，表明RNA適體與P-ε復(fù)合物的親和力越高，結(jié)合越緊密。選擇SPR技術(shù)的原因在于其具有實時、無標(biāo)記、高靈敏度等優(yōu)點，能夠在不影響RNA適體和P-ε復(fù)合物活性的情況下，準(zhǔn)確測定它們之間的親和力，為評估RNA適體的性能提供可靠的數(shù)據(jù)支持。特異性檢測是鑒定RNA適體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能夠確定RNA適體是否特異性地與P-ε復(fù)合物結(jié)合，而不與其他無關(guān)分子發(fā)生非特異性結(jié)合。本研究采用競爭結(jié)合實驗和酶聯(lián)適體吸附實驗（ELAA）進(jìn)行特異性檢測。在競爭結(jié)合實驗中，將RNA適體與P-ε復(fù)合物預(yù)先混合，然后加入過量的未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物。如果RNA適體能夠被未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物競爭性地取代，說明其特異性較差；反之，如果RNA適體仍然能夠與P-ε復(fù)合物穩(wěn)定結(jié)合，表明其具有較高的特異性。ELAA則是基于酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理，將P-ε復(fù)合物固定在微孔板表面，加入RNA適體孵育后，再加入標(biāo)記有酶的抗體，通過檢測酶催化底物產(chǎn)生的顏色變化來判斷RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合情況。在實驗中，設(shè)置陰性對照（如與P-ε復(fù)合物結(jié)構(gòu)相似但無功能的分子）和陽性對照（已知特異性結(jié)合P-ε復(fù)合物的分子）。若RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合信號顯著高于陰性對照，且與陽性對照相當(dāng)或接近，說明RNA適體具有較高的特異性。選擇這兩種方法進(jìn)行特異性檢測，是因為它們能夠從不同角度驗證RNA適體的特異性，競爭結(jié)合實驗直觀地反映了RNA適體在競爭環(huán)境下與P-ε復(fù)合物的結(jié)合能力，而ELAA則通過定量檢測的方式，更準(zhǔn)確地評估RNA適體與P-ε復(fù)合物結(jié)合的特異性和靈敏度，兩者相互印證，確保了特異性檢測結(jié)果的可靠性。5.2測序分析對篩選得到的RNA適體進(jìn)行測序，是深入了解其分子特性的關(guān)鍵步驟。本研究將第12輪篩選得到的RNA適體進(jìn)行克隆測序，共挑選了30個克隆進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果顯示，這些RNA適體的序列呈現(xiàn)出一定的多樣性，但也存在部分保守序列。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中一些RNA適體具有相似的序列模式，如在隨機(jī)序列區(qū)域存在富含G-C堿基對的片段，這些片段可能參與形成特定的二級結(jié)構(gòu)，如G-四聯(lián)體等，對RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合起到重要作用。將測序得到的RNA適體序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果表明，篩選得到的RNA適體在數(shù)據(jù)庫中未找到完全匹配的序列，這表明它們很可能是全新的RNA適體。與已知的一些能夠與蛋白質(zhì)或核酸結(jié)合的RNA適體序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)部分RNA適體與已知適體在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性。某些RNA適體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度和序列組成與已知的能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)的RNA適體具有相似之處，這暗示這些RNA適體可能通過類似的結(jié)構(gòu)與P-ε復(fù)合物相互作用。但在整體序列和關(guān)鍵結(jié)合位點上，篩選得到的RNA適體仍具有獨特性，這為進(jìn)一步研究其與P-ε復(fù)合物的特異性結(jié)合機(jī)制提供了基礎(chǔ)。對RNA適體序列的保守區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)保守區(qū)域內(nèi)的核苷酸突變會顯著影響RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合能力。通過定點突變技術(shù)，將保守區(qū)域內(nèi)的關(guān)鍵核苷酸進(jìn)行突變，然后利用表面等離子體共振（SPR）技術(shù)測定突變前后RNA適體與P-ε復(fù)合物的親和力。結(jié)果顯示，突變后的RNA適體與P-ε復(fù)合物的解離常數(shù)（Kd）明顯增大，表明其親和力顯著降低。這說明保守區(qū)域在維持RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用，為后續(xù)深入研究RNA適體與P-ε復(fù)合物的作用機(jī)制提供了重要線索。通過對RNA適體序列的分析，還預(yù)測了其可能形成的二級結(jié)構(gòu)。利用Mfold軟件對RNA適體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，大部分RNA適體能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)等。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)和莖區(qū)長度、堿基組成以及假結(jié)結(jié)構(gòu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等都可能影響RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合。一些RNA適體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)區(qū)的核苷酸序列較為靈活，可能與P-ε復(fù)合物的特定部位相互作用，形成特異性結(jié)合。這些二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果為進(jìn)一步研究RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合模式提供了理論依據(jù)。5.3親和力測定采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)測定RNA適體與P-ε復(fù)合物的親和力。將P-ε復(fù)合物固定在CM5芯片表面，通過胺偶聯(lián)法將P-ε復(fù)合物中的氨基與芯片表面的羧基進(jìn)行共價結(jié)合，確保P-ε復(fù)合物穩(wěn)定地固定在芯片上。將不同濃度的RNA適體溶液（濃度范圍為1nmol/L-1000nmol/L）以恒定流速（30μL/min）流經(jīng)芯片表面，實時監(jiān)測RNA適體與P-ε復(fù)合物結(jié)合過程中SPR信號的變化。隨著RNA適體濃度的增加，SPR信號響應(yīng)值逐漸增大，表明RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合量逐漸增加。利用BiacoreT200評估軟件對SPR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用1:1Langmuir結(jié)合模型擬合曲線，計算RNA適體與P-ε復(fù)合物的解離常數(shù)（Kd）。實驗結(jié)果顯示，篩選得到的RNA適體與P-ε復(fù)合物具有較高的親和力，Kd值在10-9-10-10mol/L之間。其中，RNA適體A的Kd值為3.2×10-10mol/L，RNA適體B的Kd值為5.6×10-10mol/L。這些結(jié)果表明，篩選得到的RNA適體能夠與P-ε復(fù)合物緊密結(jié)合，具有良好的親和力。為了驗證SPR測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，還采用了等溫量熱滴定（ITC）技術(shù)進(jìn)行親和力測定。在ITC實驗中，將RNA適體溶液作為滴定劑，逐滴加入到含有P-ε復(fù)合物的樣品池中。隨著RNA適體的加入，RNA適體與P-ε復(fù)合物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，釋放出熱量，引起樣品池溫度的變化。通過測量溫度變化，可得到RNA適體與P-ε復(fù)合物結(jié)合過程中的熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）。實驗結(jié)果顯示，ITC測定得到的RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)與SPR測定得到的解離常數(shù)具有較好的一致性。RNA適體A通過ITC測定得到的結(jié)合常數(shù)Ka為3.1×109L/mol，根據(jù)Kd=1/Ka，計算得到的Kd值為3.2×10-10mol/L，與SPR測定結(jié)果基本一致。這進(jìn)一步驗證了RNA適體與P-ε復(fù)合物親和力測定結(jié)果的可靠性。5.4特異性檢測采用競爭結(jié)合實驗和酶聯(lián)適體吸附實驗（ELAA）對RNA適體的特異性進(jìn)行檢測。在競爭結(jié)合實驗中，將篩選得到的RNA適體與P-ε復(fù)合物預(yù)先混合，然后加入過量的未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物。反應(yīng)體系中，RNA適體的終濃度為100nmol/L，P-ε復(fù)合物的終濃度為50nmol/L，未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物的終濃度為500nmol/L。將混合后的反應(yīng)體系在37℃下孵育1h，使RNA適體與P-ε復(fù)合物充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，通過凝膠阻滯電泳分析RNA適體與P-ε復(fù)合物的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，未標(biāo)記的P-ε復(fù)合物能夠有效地競爭結(jié)合RNA適體，使RNA適體與標(biāo)記的P-ε復(fù)合物的結(jié)合量顯著減少，表明篩選得到的RNA適體能夠特異性地與P-ε復(fù)合物結(jié)合。在ELAA實驗中，將P-ε復(fù)合物固定在微孔板表面，每孔加入100μL濃度為1μg/mL的P-ε復(fù)合物溶液，4℃孵育過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液（SHMCK緩沖液+0.1%明膠+0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5min，以去除未結(jié)合的P-ε復(fù)合物。然后加入200μL封閉液（SHMCK緩沖液+0.1%明膠），37℃孵育1h，封閉微孔板表面的非特異性結(jié)合位點。孵育結(jié)束后，棄去封閉液，再次