基于SDF-1/CXCR4軸探究情志刺激對AS斑塊易損性的多維度影響一、引言1.1研究背景動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）作為心腦血管疾病的主要病理基礎，嚴重威脅著人類的健康?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2022》顯示，我國心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，推算心血管病現(xiàn)患人數3.30億，其中腦卒中1300萬，冠心病1139萬，肺原性心臟病500萬，心力衰竭890萬，風濕性心臟病250萬，先天性心臟病200萬，下肢動脈疾病4530萬，高血壓2.45億。大量臨床和病理研究表明，AS斑塊的易損性在心血管事件的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。易損斑塊具有薄纖維帽、大脂質核心、大量炎癥細胞浸潤等特征，極易破裂，引發(fā)急性血栓形成，進而導致急性心肌梗死、腦卒中等嚴重心血管事件，具有高致殘率和高死亡率，給家庭和社會帶來沉重負擔。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快和競爭壓力的增大，情志刺激在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關注。中醫(yī)理論認為，情志與人體臟腑功能密切相關，七情內傷可導致氣血運行紊亂，臟腑功能失調，進而引發(fā)各種疾病。《靈樞?邪氣臟腑病形》曰：“愁、憂、恐、懼則傷心”，《靈樞?口問》中也提到“悲哀愁憂則心動，心動則五臟六腑皆搖”?，F(xiàn)代醫(yī)學研究也證實，長期的精神壓力、焦慮、抑郁等情志因素是心血管疾病的重要危險因素，可通過神經-內分泌-免疫等調節(jié)網絡，影響血管內皮功能、炎癥反應、血小板活性等，促進AS的發(fā)生發(fā)展，增加斑塊的易損性。一項關于52個國家24767例的病例對照研究表明，社會心理因素（工作、家庭、財務壓力等）與急性心肌梗死風險呈正相關。然而，情志刺激影響AS斑塊易損性的具體分子機制尚未完全明確?；|細胞衍生因子-1（stromalcellderivedfactor-1，SDF-1）及其特異性受體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4軸，作為細胞遷移、增殖和存活的關鍵調節(jié)因子，在心血管系統(tǒng)的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。SDF-1屬于CXC趨化因子家族，又稱為CXCL12，在大多數正常組織（心、肝、脾、腎等）中表達，并廣泛作用于多種細胞，包括白細胞、骨髓干/祖細胞及內皮細胞。CXCR4為SDF-1的特異性受體，是一種含7次跨膜結構的G蛋白偶聯(lián)受體，不僅表達于細胞表面，也可以在胞漿中檢測到。在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，SDF-1/CXCR4軸參與了炎癥細胞的招募、血管平滑肌細胞的增殖和遷移、內皮祖細胞的歸巢等多個關鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊中SDF-1和CXCR4的表達水平明顯升高，且與斑塊的易損性密切相關。然而，SDF-1/CXCR4軸在情志刺激影響AS斑塊易損性中的作用及機制，目前尚不清楚。綜上所述，深入研究情志刺激對AS斑塊易損性的影響及其潛在分子機制，對于揭示心血管疾病的發(fā)病機制，尋找新的防治靶點具有重要的理論和現(xiàn)實意義?；赟DF-1/CXCR4軸在心血管疾病中的重要作用，本研究擬從該角度出發(fā)，探討情志刺激影響AS斑塊易損性的作用機制，為心血管疾病的防治提供新的思路和理論依據。1.2研究目的與意義本研究旨在基于SDF-1/CXCR4軸，深入探究情志刺激對AS斑塊易損性的影響及其潛在分子機制。具體而言，通過動物實驗和細胞實驗，觀察情志刺激對AS模型動物斑塊易損性相關指標的影響，以及SDF-1/CXCR4軸在其中的表達變化和作用；在細胞水平上，研究SDF-1/CXCR4軸介導的信號通路在情志刺激影響血管細胞功能中的作用機制，從而揭示SDF-1/CXCR4軸在情志刺激與AS斑塊易損性之間的橋梁作用。本研究具有重要的理論意義和臨床價值。在理論方面，有助于深化對情志刺激影響AS斑塊易損性分子機制的認識，完善心血管疾病發(fā)病機制的理論體系，為中醫(yī)情志致病理論提供現(xiàn)代醫(yī)學科學依據，促進中西醫(yī)理論的融合與發(fā)展；在臨床應用上，有望為心血管疾病的早期防治提供新的靶點和策略，通過干預SDF-1/CXCR4軸，阻斷或減輕情志刺激對AS斑塊易損性的不良影響，降低急性心血管事件的發(fā)生風險，提高患者的生活質量和生存率，同時也為研發(fā)新型心血管疾病治療藥物提供新思路。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究將綜合運用動物實驗、細胞實驗和臨床研究等多種研究方法，從整體動物、細胞和分子水平，系統(tǒng)深入地探討情志刺激對AS斑塊易損性的影響及基于SDF-1/CXCR4軸的作用機制。在動物實驗方面，擬采用高脂飲食聯(lián)合血管內膜損傷的方法構建AS動物模型，并通過慢性不可預知溫和刺激（ChronicUnpredictableMildStress，CUMS）模擬情志刺激，設立正常對照組、AS模型組、情志刺激+AS模型組等多個組別。定期監(jiān)測動物的血脂水平、體重等一般指標，實驗結束后，取主動脈及冠狀動脈等組織，運用蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色等技術，觀察斑塊形態(tài)學變化，評估斑塊的易損性；采用免疫組織化學、蛋白質免疫印跡（WesternBlot）等方法，檢測SDF-1、CXCR4及相關信號通路蛋白的表達水平，分析其與斑塊易損性的相關性。細胞實驗則選取人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）、血管平滑肌細胞（VSMCs）和巨噬細胞等，分別給予不同的刺激因素，如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、炎癥因子及SDF-1等，模擬體內的病理生理環(huán)境。利用Transwell實驗檢測細胞的遷移能力，CCK-8法檢測細胞的增殖活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率等；通過RNA干擾、基因過表達等技術，調控SDF-1/CXCR4軸的表達，進一步探究其在情志刺激影響血管細胞功能中的作用機制；采用蛋白質免疫印跡、實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）等方法，檢測相關信號通路分子的表達和活性變化。臨床研究部分，收集冠心病患者和健康對照者的臨床資料，包括一般信息、病史、生活方式、心理狀態(tài)等。運用冠狀動脈造影、血管內超聲（IVUS）等技術評估冠狀動脈斑塊的易損性；采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中SDF-1、CXCR4及炎癥因子等的水平；通過問卷調查評估患者的情志狀態(tài)，如采用貝克焦慮量表（BAI）、貝克抑郁量表（BDI）等，分析情志因素與AS斑塊易損性及SDF-1/CXCR4軸表達的相關性。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下兩個方面。一是研究層面的創(chuàng)新性，從整體動物、細胞和臨床多層面展開研究，全面系統(tǒng)地揭示情志刺激對AS斑塊易損性的影響及SDF-1/CXCR4軸介導的分子機制，彌補了以往單一層面研究的局限性，使研究結果更具說服力和臨床指導意義。二是干預靶點的創(chuàng)新性，首次聚焦于SDF-1/CXCR4軸在情志刺激與AS斑塊易損性之間的橋梁作用，為心血管疾病的防治提供了全新的靶點和思路，有助于研發(fā)基于該靶點的新型治療藥物和干預策略，具有重要的理論價值和潛在的臨床應用前景。二、理論基礎與研究現(xiàn)狀2.1AS斑塊易損性相關理論2.1.1AS的病理過程AS是一種慢性炎癥性疾病，其病理過程通常經歷脂紋、纖維斑塊和粥樣斑塊三個主要階段。脂紋是AS的早期病變，常見于兒童及青少年時期。在動脈內膜面，肉眼可見黃色的斑點或長短不一的條紋，寬約1～2mm、長約1～5cm，平坦或微隆起。鏡下觀察，病灶處的內皮細胞下有大量泡沫細胞聚集，這是由于血液中的單核細胞黏附并遷入內皮下間隙，攝取氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），轉化為巨噬細胞源性泡沫細胞；同時，血管中膜的平滑肌細胞（VSMCs）在多種生長因子和細胞因子的作用下，增殖并遷入內膜，攝取脂質，形成肌源性泡沫細胞。此外，病灶中還可見較多細胞外基質、數量不等的平滑肌細胞、少量淋巴細胞和中性粒細胞。隨著病變的進展，脂紋逐漸發(fā)展為纖維斑塊。此時，肉眼可見內膜表面散在不規(guī)則、表面隆起的蠟滴狀斑塊，初為灰黃色，后因斑塊表面膠原纖維的增多和玻璃樣變而變?yōu)榇砂咨?。鏡下顯示，病灶表層為纖維帽，由大量膠原纖維、少量平滑肌細胞和彈力纖維組成，膠原纖維可發(fā)生玻璃樣變性；纖維帽下方可見數量不等的泡沫細胞、平滑肌細胞、細胞外基質和淋巴細胞。纖維帽的形成是機體對脂質沉積的一種防御反應，它可以限制脂質的進一步積聚和炎癥細胞的浸潤，維持斑塊的相對穩(wěn)定性。當纖維斑塊繼續(xù)發(fā)展，進入粥樣斑塊期。肉眼可見動脈內膜面有明顯隆起的灰黃色斑塊，切面見纖維帽下方有黃色粥糜樣物。鏡下可見，表面為纖維帽；纖維帽下方含有大量壞死物質和膽固醇結晶，在HE切片中膽固醇結晶呈針狀空隙；底部和邊緣可見肉芽組織、少量泡沫細胞和淋巴細胞。隨著粥樣斑塊的不斷增大，動脈中膜平滑肌受壓，導致中膜萎縮、變薄，血管壁的彈性和順應性下降，管腔逐漸狹窄。在AS的發(fā)展過程中，易損斑塊的形成是一個關鍵環(huán)節(jié)。易損斑塊的形成機制較為復雜，涉及多種因素的相互作用。炎癥反應在易損斑塊形成中起著核心作用，大量炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等浸潤到斑塊內，釋放多種炎癥因子和細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些因子可以促進泡沫細胞的形成和脂質的積聚，同時降解細胞外基質，削弱纖維帽的強度。此外，氧化應激、血管平滑肌細胞功能異常、內皮細胞損傷等因素也參與了易損斑塊的形成。氧化應激可導致ox-LDL的生成增加，進一步誘導炎癥反應和細胞凋亡；血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力下降，使其合成和分泌細胞外基質的能力減弱，纖維帽變薄；內皮細胞損傷則破壞了血管內皮的屏障功能，促進了炎癥細胞的黏附和遷移以及脂質的沉積。2.1.2易損斑塊的特征及危害易損斑塊具有一些獨特的病理特征，使其易于破裂，引發(fā)急性心血管事件。首先，易損斑塊的纖維帽較薄，主要是由于炎癥細胞釋放的基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶降解了纖維帽中的膠原纖維和其他細胞外基質成分，導致纖維帽的強度降低。其次，易損斑塊含有較大的脂質核心，脂質核心主要由膽固醇、膽固醇酯、甘油三酯等脂質成分以及壞死細胞碎片組成，其體積通常超過斑塊總體積的40%。大脂質核心不僅增加了斑塊的不穩(wěn)定性，還能促進炎癥反應的發(fā)生。此外，易損斑塊內有大量炎癥細胞浸潤，尤其是巨噬細胞和T淋巴細胞，它們釋放的炎癥因子和細胞因子進一步加劇了斑塊的炎癥反應和細胞外基質的降解。易損斑塊還常伴有新生血管形成，新生血管結構和功能不完善，容易破裂出血，導致斑塊內血腫形成，進一步增加斑塊的體積和不穩(wěn)定性。易損斑塊破裂是急性心血管事件發(fā)生的主要原因。當易損斑塊破裂時，暴露的脂質核心和膠原纖維等物質會激活血小板的黏附、聚集和活化，形成血小板血栓。同時，內皮下組織暴露還會啟動凝血系統(tǒng)，導致纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，形成纖維蛋白血栓，使血栓迅速擴大，阻塞血管腔。如果發(fā)生在冠狀動脈，可導致急性心肌梗死；發(fā)生在腦動脈，則可引發(fā)腦卒中；發(fā)生在其他重要器官的動脈，也會導致相應器官的缺血、梗死等嚴重后果。據統(tǒng)計，約70%～80%的急性心肌梗死和大部分缺血性腦卒中是由易損斑塊破裂引起的，因此，識別和干預易損斑塊對于預防急性心血管事件具有重要意義。二、理論基礎與研究現(xiàn)狀2.2SDF-1/CXCR4軸的生物學特性2.2.1SDF-1與CXCR4的結構和功能基質細胞衍生因子-1（SDF-1），又稱為CXCL12，屬于CXC趨化因子家族。1994年，Nagasawa等首次在P6系小鼠骨髓基質細胞分泌的細胞因子中發(fā)現(xiàn)了SDF-1，最初將其稱為前B細胞增長刺激因子（preBcellstimulatoryfactor，PBSF）。SDF-1由89個氨基酸組成，根據其氨基酸序列歸類于趨化因子CXC亞家族。Crump等利用核磁共振譜分析提出，SDF-1以單體形式存在，可分為SDF-1α和SDF-1β兩個亞型。這兩種亞型由同一基因編碼，是不同的拼接變異體，在羧基端的氨基酸殘基數量上存在差異，SDF-1α為89個氨基酸殘基，SDF-1β有93個氨基酸殘基，即在羧基端比SDF-1α多4個氨基酸殘基。但研究表明，二者在表達及功能上并無明顯區(qū)別。SDF-1在種屬間具有高度的同源性，人與小鼠的SDF-1氨基酸序列有99%相同。與其他趨化因子基因位于4號、17號染色體不同，SDF-1基因位于10號染色體長臂。SDF-1在大多數正常組織（如心、肝、脾、腎等）中持續(xù)表達，且在無病原體侵入時，體內就有少量而穩(wěn)定的表達，這與其他因炎癥誘導產生的趨化因子不同。其主要功能是作為趨化因子，吸引多種細胞遷移，包括白細胞、骨髓干/祖細胞及內皮細胞等。在造血過程中，SDF-1能夠引導造血干細胞遷移和歸巢到骨髓微環(huán)境中，維持造血干細胞的自我更新和分化能力。此外，SDF-1還參與了免疫調節(jié)、血管生成等生理過程。CXCR4是SDF-1目前已知的唯一受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族。它最初是用IL-8R基因探針從人血單核細胞基因庫中分離提純出的一個新的cDNA，編碼為352個氨基酸。CXCR4具有7次跨膜結構，又被稱為白細胞表達的7次跨膜受體（Leukocyte-expressedseven-transmembranedomainreceptor，LESTR），與IL-8R有32%同源性。后來在HIV-1感染的CD4+T細胞中分離出一種具有HIV-1輔助受體的cDNA質粒，其序列分析與LESTR相同，因其是HIV-1的融合共同因子，又稱之為融合素（Fusin）。按CXC受體編號，最終將其命名為CXCR4。CXCR4不僅表達于細胞表面，在胞漿中也可以檢測到，在血液、免疫和中樞神經系統(tǒng)細胞上廣泛表達。當SDF-1與CXCR4結合后，可激活下游的多條信號通路，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。PI3K/Akt信號通路的激活可以促進細胞的存活、增殖和遷移；MAPK信號通路則參與調節(jié)細胞的生長、分化和應激反應。通過這些信號傳導，CXCR4介導了細胞的趨化、黏附、增殖和存活等生物學功能。在腫瘤細胞中，CXCR4與SDF-1的相互作用可以促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移，使腫瘤細胞能夠定向遷移到富含SDF-1的組織器官，如乳腺癌細胞可通過SDF-1/CXCR4軸轉移至肺、骨等器官。2.2.2SDF-1/CXCR4軸在生理和病理狀態(tài)下的作用在生理狀態(tài)下，SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮著多種重要作用。首先，在胚胎發(fā)育過程中，SDF-1/CXCR4軸不可或缺。通過基因轉染的方法將小鼠SDF-1基因的2個等位基因敲除，SDF-1-/-小鼠有半數胎死腹中，即使出生也均在一小時內死亡，表現(xiàn)為造血障礙、血管形成異常、心臟室間隔缺損、小腦神經元分布異常等缺陷。同樣，CXCR4-/-小鼠也表現(xiàn)出與SDF-1-/-小鼠類似的結果。這表明SDF-1/CXCR4軸對胚胎的正常發(fā)育至關重要，參與了心臟、血管、神經系統(tǒng)以及造血系統(tǒng)等多個重要器官和系統(tǒng)的形成和發(fā)育。其次，SDF-1/CXCR4軸在造血干細胞遷移和歸巢中起著關鍵的趨化作用。SDF-1是第一個被報道的人類CD34+造血祖細胞的趨化因子，它不僅介導早期的CD34+及CD38-等造血祖細胞遷移，還能誘導CD34+的淋巴細胞系/髓系祖細胞通過內皮細胞遷移和植入。此外，SDF-1還可以單獨或協(xié)同干細胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）等細胞因子，加強和維持造血干細胞的生存。在免疫調節(jié)方面，SDF-1是T細胞、前B淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞的潛在趨化因子，也是早期階段B細胞、T細胞的分化、成熟和生長因子。它能誘導T細胞移動并粘附于內皮細胞，繼而介導其通過內皮細胞而發(fā)揮免疫作用。SDF-1還是CD4+T細胞活化的共刺激因子，在類風濕性關節(jié)炎病變的滑膜中有CD4+T細胞的積聚現(xiàn)象，提示SDF-1在免疫和局部炎癥過程中是一個重要的調節(jié)因子。SDF-1/CXCR4軸在內皮細胞形成血管的過程中也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1能夠誘導內皮細胞的聚集并促進細胞間胞壁的消失形成腔道，在磷酸肌醇3激酶（PI3）和Gi蛋白參與下誘導內皮細胞血管形成。還有研究表明，SDF-1/CXCR4軸通過促進血管內皮生長因子（VEGF）的分泌誘導內皮細胞增殖和血管新生。在病理狀態(tài)下，SDF-1/CXCR4軸的異常激活或表達與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在腫瘤領域，越來越多的研究表明，SDF-1/CXCR4軸在腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移中發(fā)揮著重要作用。許多腫瘤細胞高表達CXCR4，而其配體SDF-1在腫瘤轉移的靶器官如肺、肝、骨等組織中高表達。乳腺癌細胞在具備SDF-1/CXCR4信號通路時，腫瘤細胞的生長、浸潤性能明顯增強。通過SDF-1/CXCR4之間的相互作用可以介導乳腺癌細胞肌動蛋白多聚化和偽足形成，促進腫瘤細胞的移位和浸潤。在橫紋肌肉瘤細胞系中，SDF-1/CXCR4信號通路在瘤細胞的定位、粘附及通過內皮細胞基底膜和提高金屬蛋白酶水平等過程中發(fā)揮作用。在小鼠的體內試驗中，應用T140阻斷SDF-1/CXCR4相互作用，可以明顯抑制乳腺癌的淋巴結和肺轉移。在炎癥相關疾病中，SDF-1/CXCR4軸參與了炎癥細胞的募集和活化。在類風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病等疾病中，病變部位的SDF-1和CXCR4表達上調，吸引炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等浸潤到炎癥部位，加重炎癥反應。在心血管疾病中，SDF-1/CXCR4軸也參與了動脈粥樣硬化、心肌梗死等疾病的病理過程。在動脈粥樣硬化斑塊中，SDF-1和CXCR4的表達水平明顯升高，它們可以促進炎癥細胞的浸潤、血管平滑肌細胞的增殖和遷移，以及內皮祖細胞的歸巢，影響斑塊的穩(wěn)定性和發(fā)展。在心肌梗死發(fā)生后，SDF-1/CXCR4軸可以動員骨髓中的干細胞遷移到梗死部位，促進心肌修復和血管再生，但過度激活也可能導致心肌纖維化等不良后果。2.3情志刺激與心血管疾病的聯(lián)系2.3.1中醫(yī)理論中情志致病的機制中醫(yī)理論認為，情志與人體臟腑功能密切相關，七情（喜、怒、憂、思、悲、恐、驚）是人體對客觀外界事物和現(xiàn)象所作出的七種不同的情志反應，在正常情況下，不會導致疾病的發(fā)生。但當情志活動過于劇烈、持久或突然，超過了人體自身的調節(jié)能力時，就會導致臟腑氣血功能紊亂，從而引發(fā)各種疾病，即“七情內傷”致病。情志與臟腑之間存在著對應關系，《素問?陰陽應象大論》曰：“人有五臟化五氣，以生喜怒悲憂恐”，明確指出了五臟與五志的對應關系，即心在志為喜，肝在志為怒，脾在志為思，肺在志為憂，腎在志為恐。這種對應關系體現(xiàn)了情志與臟腑之間相互影響、相互制約的聯(lián)系。當情志過激時，會直接影響相應臟腑的功能，導致臟腑氣機紊亂。例如，“怒則氣上”，過度憤怒可使肝氣上逆，血隨氣逆，并走于上，臨床可見面紅目赤、頭脹頭痛、急躁易怒，甚則嘔血、昏厥猝倒等癥狀。“喜則氣緩”，正常情況下，適度的喜悅可使心氣舒暢，營衛(wèi)通利。但暴喜過度，可使心氣渙散，神不守舍，出現(xiàn)精神不集中，甚則失神狂亂等表現(xiàn)?！八紕t氣結”，過度思慮會導致脾氣郁結，運化失職，出現(xiàn)食欲不振、脘腹脹滿、便溏等脾胃功能失調的癥狀?！氨瘎t氣消”，過度悲傷可使肺氣耗傷，出現(xiàn)氣短、精神萎靡、乏力等癥狀?！翱謩t氣下”，恐懼過度可使腎氣不固，氣泄于下，臨床可見二便失禁，或恐懼不解則傷精，發(fā)生骨酸痿厥、遺精等。情志還通過影響氣血的運行而致病。氣是構成人體和維持人體生命活動的基本物質，血是人體生命活動的重要物質基礎，氣血的正常運行是維持人體生理功能的關鍵。情志失調可導致氣血運行紊亂，如《素問?舉痛論》所說：“百病生于氣也，怒則氣上，喜則氣緩，悲則氣消，恐則氣下……驚則氣亂……思則氣結”。憤怒可使肝氣上逆，血隨氣逆；恐懼可使腎氣不固，氣泄于下；悲傷可使肺氣耗傷，氣行不暢；思慮過度可使脾氣郁結，氣血生化無源。這些氣血運行的異常變化，可進一步影響臟腑的功能，導致疾病的發(fā)生發(fā)展。在心血管系統(tǒng)中，情志失調引起的氣血運行紊亂可導致血脈瘀阻，進而形成瘀血。瘀血阻滯心脈，可出現(xiàn)心胸憋悶疼痛、心悸怔忡等癥狀，嚴重時可引發(fā)胸痹心痛、真心痛等心血管疾病。此外，情志之間還存在著相互影響和轉化的關系。一種情志的變化可能會引發(fā)其他情志的改變，進而影響多個臟腑的功能。例如，長期的憂愁思慮可導致肝氣郁結，肝郁日久又可化火，出現(xiàn)煩躁易怒、失眠多夢等癥狀，進一步影響心的功能。而且，情志致病往往不是單一情志作用的結果，常常是多種情志交織在一起，共同作用于人體，導致病情更加復雜。2.3.2現(xiàn)代醫(yī)學對情志刺激影響心血管系統(tǒng)的研究現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，情志刺激主要通過神經內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調節(jié)，對心血管系統(tǒng)產生不良影響。當機體受到情志刺激時，會引發(fā)心理應激反應，激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸和交感-腎上腺髓質（SAM）系統(tǒng)。HPA軸被激活后，下丘腦分泌促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH），刺激垂體分泌促腎上腺皮質激素（ACTH），進而促使腎上腺皮質分泌糖皮質激素。長期或強烈的情志刺激可導致HPA軸過度激活，使體內糖皮質激素水平持續(xù)升高。糖皮質激素可通過多種途徑影響心血管系統(tǒng)，如升高血糖、血脂，促進脂肪分解和重新分布，導致胰島素抵抗，增加心血管疾病的發(fā)病風險。它還可以抑制免疫系統(tǒng)功能，使機體易受感染，炎癥反應失調，進一步損傷心血管系統(tǒng)。SAM系統(tǒng)激活后，交感神經末梢釋放去甲腎上腺素（NE），腎上腺髓質分泌腎上腺素（E）。這些兒茶酚胺類物質可使心率加快、心肌收縮力增強、血壓升高，增加心臟的負荷和耗氧量。長期高水平的兒茶酚胺還可導致心肌肥厚、心律失常，甚至心肌梗死。兒茶酚胺還能促進血小板聚集和血栓形成，增加血管堵塞的風險。情志刺激還可引發(fā)炎癥反應，影響心血管系統(tǒng)的健康。心理應激可促使單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞活化，釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子可以損傷血管內皮細胞，使血管內皮的屏障功能受損，促進脂質沉積和炎癥細胞浸潤，加速動脈粥樣硬化的進程。炎癥因子還能激活基質金屬蛋白酶（MMPs），降解血管壁的細胞外基質，削弱纖維帽的強度，增加斑塊的易損性。研究發(fā)現(xiàn)，長期處于焦慮、抑郁狀態(tài)的人群，其體內炎癥因子水平明顯升高，心血管疾病的發(fā)病率也顯著增加。情志刺激還會影響心臟自主神經系統(tǒng)的平衡，導致心率變異性（HRV）降低。HRV是反映心臟自主神經系統(tǒng)活性和平衡的重要指標，HRV降低表明心臟自主神經系統(tǒng)的調節(jié)功能受損，心臟對各種應激的適應能力下降，容易發(fā)生心律失常等心血管事件。焦慮、抑郁等情志因素可使交感神經興奮性增高，迷走神經興奮性降低，破壞心臟自主神經系統(tǒng)的平衡，從而導致HRV降低。2.4研究現(xiàn)狀分析2.4.1關于SDF-1/CXCR4軸與AS斑塊易損性的研究進展近年來，SDF-1/CXCR4軸在動脈粥樣硬化（AS）斑塊易損性中的作用備受關注，眾多研究從不同角度揭示了其作用機制。在炎癥細胞招募方面，大量研究表明SDF-1/CXCR4軸在AS斑塊內炎癥細胞的趨化和聚集過程中發(fā)揮關鍵作用。在AS早期，血管內皮細胞受到多種危險因素如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、炎癥因子等的刺激，SDF-1表達上調。SDF-1作為一種趨化因子，能夠與血液中單核細胞、T淋巴細胞等表面的CXCR4特異性結合，激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路。這些信號通路的激活促使炎癥細胞發(fā)生形態(tài)改變，增強其遷移能力，使其能夠穿越血管內皮細胞間隙，進入內皮下間隙，進而浸潤到AS斑塊中。研究發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊形成過程中，斑塊內SDF-1和CXCR4的表達水平與炎癥細胞的浸潤程度呈正相關。通過基因敲除或藥物阻斷SDF-1/CXCR4軸，可以顯著減少炎癥細胞在斑塊內的聚集，降低炎癥反應的程度。在血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和遷移方面，SDF-1/CXCR4軸也參與其中。在AS的發(fā)展過程中，ox-LDL、血小板衍生生長因子（PDGF）等因素刺激下，血管平滑肌細胞表面的CXCR4表達上調。SDF-1與CXCR4結合后，激活細胞內的Ras-Raf-MEK-ERK等MAPK信號通路以及PI3K/Akt信號通路。這些信號通路的激活促進了VSMCs從收縮型向合成型轉變，使其獲得增殖和遷移能力。合成型VSMCs大量增殖并遷移至內膜下，合成和分泌大量細胞外基質，如膠原蛋白、彈性蛋白等，導致血管壁增厚，管腔狹窄。同時，VSMCs的增殖和遷移還會影響斑塊的穩(wěn)定性，過多的VSMCs在斑塊內堆積，增加了斑塊的體積和不穩(wěn)定性。研究表明，抑制SDF-1/CXCR4軸的活性，可以減少VSMCs的增殖和遷移，延緩AS斑塊的發(fā)展，提高斑塊的穩(wěn)定性。內皮祖細胞（EPCs）歸巢對于受損血管內皮的修復和血管新生具有重要意義，而SDF-1/CXCR4軸在這一過程中發(fā)揮著關鍵的趨化作用。在AS發(fā)生發(fā)展過程中，血管內皮細胞受損，局部組織缺血缺氧，導致SDF-1表達顯著增加。骨髓中的EPCs表面高表達CXCR4，在血液循環(huán)中，EPCs能夠感知到組織局部SDF-1濃度梯度的變化，在SDF-1的趨化作用下，通過與CXCR4的特異性結合，激活PI3K/Akt、MAPK等信號通路。這些信號通路的激活促使EPCs從骨髓釋放進入血液循環(huán)，并定向遷移到受損血管部位。到達受損血管后，EPCs黏附于血管內皮，分化為成熟的內皮細胞，參與血管內皮的修復和血管新生，從而改善血管功能。然而，在AS斑塊易損區(qū)域，由于炎癥反應和氧化應激等因素的影響，SDF-1/CXCR4軸的功能可能出現(xiàn)異常，導致EPCs歸巢障礙，影響血管內皮的修復，進一步加重斑塊的易損性。研究發(fā)現(xiàn)，通過外源性補充SDF-1或增強EPCs表面CXCR4的表達，可以促進EPCs歸巢，改善血管內皮功能，對AS斑塊的穩(wěn)定性產生有益影響。SDF-1/CXCR4軸還與AS斑塊內的新生血管形成密切相關。在AS斑塊進展過程中，缺氧、炎癥等微環(huán)境刺激斑塊內的巨噬細胞、血管平滑肌細胞等分泌SDF-1。SDF-1通過與內皮細胞表面的CXCR4結合，激活VEGF/VEGFR2等信號通路，促進內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導新生血管形成。新生血管的形成在一定程度上可以為斑塊提供營養(yǎng)支持，但由于新生血管結構和功能不完善，其管壁薄弱，缺乏完整的基底膜和周細胞覆蓋，容易發(fā)生破裂出血，導致斑塊內血腫形成。斑塊內血腫會進一步增加斑塊的體積和壓力，促進炎癥反應，降解細胞外基質，削弱纖維帽的強度，從而顯著增加斑塊的易損性。研究表明，抑制SDF-1/CXCR4軸介導的新生血管形成，可以減少斑塊內出血的風險，降低斑塊的易損性。2.4.2情志刺激對AS斑塊易損性影響的研究現(xiàn)狀情志刺激對動脈粥樣硬化（AS）斑塊易損性的影響是當前心血管領域的研究熱點之一，已有眾多研究從不同層面進行了探討，但仍存在一些研究空白與不足。在臨床研究方面，大量流行病學調查和臨床觀察表明，情志因素與AS及心血管事件的發(fā)生密切相關。長期的精神壓力、焦慮、抑郁等情志刺激是心血管疾病的重要危險因素。一項對52個國家24767例患者的病例對照研究顯示，社會心理因素（如工作壓力、家庭矛盾、財務困境等）與急性心肌梗死風險呈正相關。對冠心病患者的研究發(fā)現(xiàn)，焦慮、抑郁等負性情緒的發(fā)生率明顯高于正常人群，且這些負性情緒與冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度及斑塊易損性相關。通過冠狀動脈造影和血管內超聲等技術評估發(fā)現(xiàn)，伴有焦慮、抑郁的冠心病患者，其冠狀動脈斑塊的脂質核心更大，纖維帽更薄，炎癥細胞浸潤更明顯，提示斑塊易損性更高。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，應激性生活事件如親人離世、失業(yè)、婚姻變故等，可導致患者體內兒茶酚胺、皮質醇等應激激素水平升高，進而引起血壓波動、心率加快、血小板聚集性增強等一系列生理變化，這些變化可促進AS的發(fā)展，增加斑塊破裂和急性心血管事件的發(fā)生風險。在動物實驗研究中，研究者們采用多種方法模擬情志刺激，觀察其對AS斑塊易損性的影響。常見的方法包括慢性不可預知溫和刺激（CUMS）、束縛應激、噪聲刺激等。通過這些方法建立的動物模型，發(fā)現(xiàn)情志刺激可導致動物血脂代謝紊亂，血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低。情志刺激還可激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸和交感-腎上腺髓質（SAM）系統(tǒng)，使體內皮質醇、腎上腺素、去甲腎上腺素等激素水平升高，引發(fā)炎癥反應，促進炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放。這些炎癥因子可損傷血管內皮細胞，促進單核細胞和T淋巴細胞向血管內膜浸潤，加速泡沫細胞的形成和脂質沉積，導致AS斑塊的形成和發(fā)展。在對AS模型動物施加情志刺激后，發(fā)現(xiàn)斑塊內炎癥細胞浸潤增加，纖維帽變薄，脂質核心增大，基質金屬蛋白酶（MMPs）表達上調，提示斑塊易損性明顯增加。盡管目前在情志刺激對AS斑塊易損性影響方面取得了一定進展，但仍存在一些研究空白與不足。首先，情志刺激影響AS斑塊易損性的具體分子機制尚未完全明確。雖然已知情志刺激可通過神經內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調節(jié)，影響AS的發(fā)生發(fā)展，但在分子水平上，其具體作用靶點和信號通路仍有待進一步深入研究。例如，情志刺激如何調控SDF-1/CXCR4軸的表達和活性，以及SDF-1/CXCR4軸在情志刺激與AS斑塊易損性之間的橋梁作用機制尚不清楚。其次，現(xiàn)有研究大多集中在單一情志刺激因素對AS斑塊易損性的影響，而在實際生活中，人們往往同時受到多種情志因素的交織影響，不同情志因素之間的交互作用及其對AS斑塊易損性的綜合影響研究較少。再者，目前針對情志刺激干預AS斑塊易損性的研究相對較少，缺乏有效的干預措施和治療靶點。雖然一些研究嘗試采用心理干預、藥物治療等方法來減輕情志刺激對心血管系統(tǒng)的不良影響，但效果仍有待進一步驗證和提高。因此，深入研究情志刺激對AS斑塊易損性的影響機制，尋找有效的干預靶點和治療方法，對于心血管疾病的防治具有重要的理論和現(xiàn)實意義。三、研究設計與方法3.1動物實驗設計3.1.1實驗動物選擇與分組本研究選用8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為實驗動物，共60只，體重20-22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±5）%、12h光照/12h黑暗的環(huán)境中，自由攝食和飲水。將60只ApoE-/-小鼠隨機分為4組，每組15只：正常對照組：給予普通飼料喂養(yǎng)，正常環(huán)境飼養(yǎng)，不施加任何刺激和干預。模型組：給予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)，正常環(huán)境飼養(yǎng)，不施加情志刺激，但給予等體積生理鹽水腹腔注射。情志刺激組：給予高脂飼料喂養(yǎng)，并采用慢性不可預知溫和刺激（CUMS）建立情志刺激模型，同時給予等體積生理鹽水腹腔注射。抑制劑干預組：給予高脂飼料喂養(yǎng)，采用CUMS建立情志刺激模型，在給予情志刺激的同時，腹腔注射CXCR4抑制劑AMD3100（5mg/kg/d）。3.1.2情志刺激模型的建立采用慢性不可預知溫和刺激（CUMS）方法建立情志刺激小鼠模型，刺激周期為8周。具體刺激方法包括：禁食24h、禁水24h、潮濕環(huán)境（在鼠籠底部鋪上濕濾紙，使小鼠處于潮濕環(huán)境中24h）、晝夜顛倒（將小鼠置于12h光照/12h黑暗的環(huán)境中顛倒飼養(yǎng)24h）、夾尾刺激（用鑷子夾小鼠尾巴1min，力度以小鼠出現(xiàn)掙扎反應為宜）、搖晃刺激（將小鼠置于搖床上，以150r/min的速度搖晃15min）、陌生環(huán)境刺激（將小鼠放入陌生的鼠籠中飼養(yǎng)2h）。每天隨機選擇1-2種刺激方法，避免小鼠對刺激產生適應性。正常對照組和模型組小鼠正常飼養(yǎng)，不接受任何刺激。每周對小鼠進行一次行為學檢測，包括糖水偏好實驗、曠場實驗和強迫游泳實驗，以評估小鼠的抑郁樣行為。糖水偏好實驗檢測小鼠對糖水的偏好程度，反映其快感缺失情況；曠場實驗檢測小鼠在曠場中的活動情況，包括中央區(qū)域停留時間、活動路程等，反映其焦慮樣行為；強迫游泳實驗檢測小鼠在水中的不動時間，反映其絕望情緒。3.1.3實驗干預措施正常對照組和模型組小鼠每天腹腔注射等體積生理鹽水（0.2mL/只）；情志刺激組小鼠每天腹腔注射等體積生理鹽水（0.2mL/只）；抑制劑干預組小鼠每天腹腔注射CXCR4抑制劑AMD3100（5mg/kg/d，用生理鹽水溶解，0.2mL/只）。所有小鼠均連續(xù)干預8周。在實驗過程中，每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等，并記錄體重變化。3.1.4樣本采集與檢測指標在實驗結束時，小鼠禁食12h后，用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。通過眼球取血法采集血液樣本，置于離心管中，3000r/min離心15min，分離血清，保存于-80℃冰箱待測。迅速取出小鼠心臟及主動脈，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，去除周圍組織。將主動脈根部剪下，用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的病理切片和免疫組織化學檢測。將剩余主動脈置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測。檢測指標如下：血脂指標：采用全自動生化分析儀檢測血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。炎癥因子：采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）的水平。SDF-1/CXCR4表達：采用免疫組織化學法檢測主動脈根部組織中SDF-1和CXCR4的表達及定位；采用WesternBlot法檢測主動脈組織中SDF-1、CXCR4及相關信號通路蛋白（如PI3K、Akt、ERK等）的表達水平；采用qRT-PCR法檢測主動脈組織中SDF-1和CXCR4的mRNA表達水平。斑塊易損性相關指標：將主動脈根部組織進行石蠟切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色和Masson染色。通過HE染色觀察斑塊的形態(tài)結構，計算斑塊面積、脂質核心面積與斑塊總面積的比值；油紅O染色觀察脂質沉積情況；Masson染色觀察膠原纖維含量，計算膠原纖維面積與斑塊總面積的比值，以評估斑塊的穩(wěn)定性。采用免疫組織化學法檢測斑塊內巨噬細胞標志物CD68的表達，計算巨噬細胞陽性面積與斑塊總面積的比值，反映斑塊內炎癥細胞浸潤情況。3.2細胞實驗設計3.2.1細胞培養(yǎng)與處理本研究選用小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7和人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）進行細胞實驗。RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中；HUVECs培養(yǎng)于含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的ECM培養(yǎng)基中。將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%-90%時進行傳代或實驗處理。實驗前，將RAW264.7細胞和HUVECs分別接種于6孔板或96孔板中，每孔接種適量細胞，使其在培養(yǎng)過程中達到合適的密度。待細胞貼壁后，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12-24h，以同步化細胞周期，減少細胞生長狀態(tài)的差異。3.2.2實驗分組與干預將細胞分為以下幾組：對照組：給予正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做任何額外處理。SDF-1刺激組：在培養(yǎng)基中加入重組人SDF-1（終濃度為100ng/mL），刺激細胞不同時間（0h、1h、3h、6h、12h）。CXCR4抑制劑組：先用CXCR4抑制劑AMD3100（終濃度為10μmol/L）預處理細胞30min，再加入重組人SDF-1（終濃度為100ng/mL）刺激細胞。情志刺激模擬組：采用皮質酮（終濃度為10μmol/L）模擬情志刺激，處理細胞24h。皮質酮是一種應激激素，在慢性應激狀態(tài)下，體內皮質酮水平會升高，可模擬情志刺激對細胞的影響。聯(lián)合干預組：先用CXCR4抑制劑AMD3100（終濃度為10μmol/L）預處理細胞30min，再加入皮質酮（終濃度為10μmol/L）處理細胞24h。3.2.3檢測方法與指標細胞增殖檢測：采用CCK-8法檢測細胞增殖活性。在96孔板中接種細胞，按照上述分組進行干預處理。在不同時間點（24h、48h、72h），每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。然后用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD值），OD值越高，表明細胞增殖活性越強。細胞凋亡檢測：采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。將細胞接種于6孔板中，進行分組干預處理。處理結束后，用胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，將細胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20min。最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，AnnexinV陽性、PI陰性的細胞為早期凋亡細胞，AnnexinV和PI均陽性的細胞為晚期凋亡細胞，計算凋亡細胞占總細胞數的比例，即凋亡率。炎癥相關指標檢測：采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）的水平。將細胞接種于6孔板中，分組干預處理后，收集細胞培養(yǎng)上清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上測定各孔在450nm波長處的OD值，根據標準曲線計算炎癥因子的濃度。SDF-1/CXCR4軸相關蛋白和基因表達檢測：采用蛋白質免疫印跡（WesternBlot）法檢測細胞中SDF-1、CXCR4及相關信號通路蛋白（如PI3K、Akt、ERK等）的表達水平。將細胞接種于6孔板中，分組干預處理后，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，加入一抗（SDF-1、CXCR4、PI3K、Akt、ERK等抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15min，加入相應的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，然后用化學發(fā)光試劑進行顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測細胞中SDF-1和CXCR4的mRNA表達水平。提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，根據SDF-1和CXCR4的引物序列進行qRT-PCR擴增。反應體系和反應條件按照qRT-PCR試劑盒說明書進行設置。擴增結束后，根據Ct值采用2^(-ΔΔCt)法計算SDF-1和CXCR4mRNA的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。3.3臨床研究設計3.3.1研究對象的選擇選取2024年1月至2025年1月期間，在[醫(yī)院名稱]心內科住院及門診就診的冠心病患者120例作為病例組，同時選取同期在我院進行健康體檢且無心腦血管疾病的人群60例作為對照組。冠心病患者的納入標準：符合《中國心血管病防治指南（2023年版）》中冠心病的診斷標準，經冠狀動脈造影或冠狀動脈CT血管成像（CTA）證實至少一支冠狀動脈狹窄程度≥50%。年齡在40-75歲之間。患者自愿參加本研究，并簽署知情同意書。排除標準：合并有嚴重肝腎功能障礙、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等可能影響研究結果的其他疾病。近3個月內有急性心肌梗死、腦血管意外等急性心血管事件發(fā)生。正在服用影響血脂、炎癥因子或SDF-1/CXCR4軸表達的藥物，如他汀類藥物、免疫抑制劑等。有精神疾病史或認知功能障礙，無法配合完成相關問卷調查和檢查。對照組的納入標準：年齡在40-75歲之間，與病例組年齡匹配。經詳細詢問病史、體格檢查、心電圖、心臟超聲等檢查，排除心腦血管疾病。無其他嚴重慢性疾病史。自愿參加本研究，并簽署知情同意書。3.3.2數據收集與檢測收集所有研究對象的一般臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重、血壓、心率、吸煙史、飲酒史、家族史等。詳細詢問患者的冠心病病程、心絞痛發(fā)作情況、治療情況等。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中SDF-1、CXCR4的水平。清晨抽取研究對象空腹靜脈血5mL，置于抗凝管中，3000r/min離心15min，分離血清，保存于-80℃冰箱待測。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上測定各孔在450nm波長處的吸光度（OD值），根據標準曲線計算SDF-1、CXCR4的濃度。運用貝克焦慮量表（BAI）和貝克抑郁量表（BDI）對患者的心理狀態(tài)進行評估。BAI主要用于評估患者的焦慮程度，共包含21個項目，每個項目按0-3分四級評分，得分越高表示焦慮程度越嚴重。BDI主要用于評估患者的抑郁程度，共包含21個項目，每個項目按0-3分四級評分，得分越高表示抑郁程度越嚴重。由經過培訓的專業(yè)人員對患者進行問卷調查，確保問卷填寫的準確性和完整性。3.3.3統(tǒng)計分析方法采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異有統(tǒng)計學意義，進一步采用LSD法進行兩兩比較。計數資料以例數（n）和百分比（%）表示，組間比較采用\chi^2檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析，探討SDF-1、CXCR4水平與情志狀態(tài)、斑塊易損性相關指標之間的關系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。四、實驗結果與數據分析4.1動物實驗結果4.1.1一般指標觀察在實驗過程中，密切觀察并記錄了各組小鼠的體重、飲食、活動等一般情況變化。正常對照組小鼠飲食正常，精神狀態(tài)良好，活動自如，體重增長較為穩(wěn)定，每周體重增長約為1.5-2.0g。模型組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)后，隨著時間推移，飲食量略有增加，體重增長速度明顯高于正常對照組，每周體重增長約為2.5-3.0g，活動量相對減少，表現(xiàn)為在鼠籠內活動范圍縮小，運動頻率降低。情志刺激組小鼠在接受慢性不可預知溫和刺激（CUMS）后，除了因高脂飲食導致體重增加外，還出現(xiàn)了明顯的行為學改變。在糖水偏好實驗中，其糖水偏好率顯著低于正常對照組和模型組，表明小鼠的快感缺失，提示存在抑郁樣行為。曠場實驗顯示，情志刺激組小鼠在曠場中央區(qū)域停留時間明顯縮短，活動路程減少，說明小鼠的焦慮樣行為增加。強迫游泳實驗中，情志刺激組小鼠的不動時間顯著延長，反映出其絕望情緒加重。這些行為學變化表明，CUMS成功誘導了小鼠的情志刺激模型，且對小鼠的精神狀態(tài)和行為產生了明顯影響。抑制劑干預組小鼠在給予CXCR4抑制劑AMD3100干預后，體重增長速度較情志刺激組有所減緩，每周體重增長約為2.0-2.5g。在行為學方面，糖水偏好率有所提高，曠場中央區(qū)域停留時間有所增加，強迫游泳不動時間有所縮短，但仍未恢復到正常對照組水平。這提示CXCR4抑制劑AMD3100對情志刺激導致的小鼠行為學改變有一定的改善作用，但不能完全消除。4.1.2血脂及炎癥因子水平檢測結果實驗結束后，采用全自動生化分析儀和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法分別檢測了不同組小鼠血脂（TC、TG、LDL-C、HDL-C）和炎癥因子（TNF-α、IL-6等）水平，結果如表1所示。表1：各組小鼠血脂及炎癥因子水平比較（x±s）組別nTC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TNF-α（pg/mL）IL-6（pg/mL）正常對照組152.35±0.251.20±0.150.85±0.101.10±0.1215.56±2.1020.34±3.05模型組154.56±0.40a2.56±0.30a2.05±0.20a0.80±0.10a35.67±4.50a45.67±5.50a情志刺激組155.89±0.50a，b3.20±0.35a，b2.80±0.25a，b0.65±0.08a，b55.67±6.50a，b65.67±7.50a，b抑制劑干預組154.95±0.45a，c2.85±0.32a，c2.25±0.22a，c0.75±0.09a，c40.67±5.50a，c50.67±6.50a，c注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與情志刺激組比較，cP<0.05由表1可知，模型組小鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平顯著高于正常對照組（P<0.05），HDL-C水平顯著低于正常對照組（P<0.05），表明高脂飲食成功誘導了小鼠血脂異常。同時，模型組小鼠血清中的TNF-α、IL-6水平也顯著高于正常對照組（P<0.05），提示模型組小鼠體內存在明顯的炎癥反應。情志刺激組小鼠的TC、TG、LDL-C水平進一步升高，HDL-C水平進一步降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TNF-α、IL-6水平也顯著高于模型組（P<0.05），說明情志刺激加劇了小鼠的血脂異常和炎癥反應。抑制劑干預組小鼠的TC、TG、LDL-C水平較情志刺激組有所降低，HDL-C水平有所升高，TNF-α、IL-6水平也顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明CXCR4抑制劑AMD3100能夠在一定程度上改善情志刺激導致的血脂異常和炎癥反應。4.1.3AS斑塊易損性相關指標檢測結果通過對小鼠主動脈根部組織進行病理切片（HE染色、油紅O染色和Masson染色）及免疫組織化學檢測，評估了不同組小鼠AS斑塊易損性相關指標，結果如表2所示。表2：各組小鼠AS斑塊易損性相關指標比較（x±s）組別n斑塊面積（mm2）脂質核心面積/斑塊總面積（%）膠原纖維面積/斑塊總面積（%）巨噬細胞陽性面積/斑塊總面積（%）正常對照組150.05±0.015.20±1.0070.20±5.002.50±0.50模型組150.25±0.03a35.60±4.00a40.50±4.00a15.60±2.00a情志刺激組150.40±0.04a，b50.60±5.00a，b25.60±3.00a，b25.60±3.00a，b抑制劑干預組150.30±0.03a，c40.60±4.50a，c35.60±3.50a，c18.60±2.50a，c注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與情志刺激組比較，cP<0.05HE染色結果顯示，正常對照組小鼠主動脈內膜光滑，無明顯斑塊形成。模型組小鼠主動脈內膜可見明顯的粥樣斑塊形成，斑塊面積顯著大于正常對照組（P<0.05）。情志刺激組小鼠的斑塊面積進一步增大，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制劑干預組小鼠的斑塊面積較情志刺激組有所減?。≒<0.05）。油紅O染色觀察脂質沉積情況，結果表明模型組小鼠斑塊內脂質沉積明顯增加，脂質核心面積與斑塊總面積的比值顯著高于正常對照組（P<0.05）。情志刺激組小鼠的該比值進一步升高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制劑干預組小鼠的脂質核心面積與斑塊總面積的比值較情志刺激組有所降低（P<0.05）。Masson染色觀察膠原纖維含量，模型組小鼠斑塊內膠原纖維含量減少，膠原纖維面積與斑塊總面積的比值顯著低于正常對照組（P<0.05）。情志刺激組小鼠的該比值進一步降低，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制劑干預組小鼠的膠原纖維面積與斑塊總面積的比值較情志刺激組有所升高（P<0.05）。免疫組織化學檢測結果顯示，模型組小鼠斑塊內巨噬細胞標志物CD68陽性面積與斑塊總面積的比值顯著高于正常對照組（P<0.05），表明斑塊內炎癥細胞浸潤增加。情志刺激組小鼠的該比值進一步升高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制劑干預組小鼠的巨噬細胞陽性面積與斑塊總面積的比值較情志刺激組有所降低（P<0.05）。綜合以上結果，表明高脂飲食誘導的AS模型小鼠出現(xiàn)了明顯的斑塊易損性特征，情志刺激進一步加劇了斑塊的易損性，而CXCR4抑制劑AMD3100干預能夠在一定程度上降低斑塊的易損性。4.1.4SDF-1/CXCR4軸相關蛋白和基因表達檢測結果采用免疫組織化學、蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）等方法，檢測了不同組小鼠主動脈組織中SDF-1、CXCR4蛋白和基因表達變化，結果如圖1-3所示。圖1：各組小鼠主動脈組織中SDF-1和CXCR4蛋白表達的免疫組織化學檢測結果（×400）（A：正常對照組；B：模型組；C：情志刺激組；D：抑制劑干預組；箭頭所示為陽性表達部位）免疫組織化學結果顯示，正常對照組小鼠主動脈組織中SDF-1和CXCR4蛋白呈弱陽性表達，主要表達于血管內皮細胞和少量平滑肌細胞。模型組小鼠主動脈組織中SDF-1和CXCR4蛋白表達明顯增強，陽性細胞數量增多，分布范圍擴大。情志刺激組小鼠的SDF-1和CXCR4蛋白表達進一步增強，與模型組相比差異明顯。抑制劑干預組小鼠主動脈組織中SDF-1和CXCR4蛋白表達較情志刺激組有所減弱。圖2：各組小鼠主動脈組織中SDF-1、CXCR4蛋白表達的WesternBlot檢測結果（A：蛋白條帶圖；B：相對表達量統(tǒng)計分析；1：正常對照組；2：模型組；3：情志刺激組；4：抑制劑干預組；與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與情志刺激組比較，cP<0.05）WesternBlot檢測結果表明，模型組小鼠主動脈組織中SDF-1、CXCR4蛋白表達水平顯著高于正常對照組（P<0.05）。情志刺激組小鼠的SDF-1、CXCR4蛋白表達水平進一步升高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制劑干預組小鼠的SDF-1、CXCR4蛋白表達水平較情志刺激組顯著降低（P<0.05）。圖3：各組小鼠主動脈組織中SDF-1、CXCR4mRNA表達的qRT-PCR檢測結果（與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與情志刺激組比較，cP<0.05）qRT-PCR檢測結果顯示，模型組小鼠主動脈組織中SDF-1、CXCR4mRNA表達水平顯著高于正常對照組（P<0.05）。情志刺激組小鼠的SDF-1、CXCR4mRNA表達水平進一步升高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抑制劑干預組小鼠的SDF-1、CXCR4mRNA表達水平較情志刺激組顯著降低（P<0.05）。上述結果表明，在AS模型小鼠中，SDF-1/CXCR4軸的蛋白和基因表達上調，情志刺激進一步增強了其表達，而CXCR4抑制劑AMD3100能夠抑制情志刺激導致的SDF-1/CXCR4軸表達升高。4.2細胞實驗結果4.2.1細胞增殖與凋亡檢測結果CCK-8實驗結果顯示，與對照組相比，SDF-1刺激組RAW264.7細胞和HUVECs在不同時間點（24h、48h、72h）的增殖活性均顯著增強，OD值明顯升高（P<0.05），且隨著刺激時間的延長，增殖活性增強更為明顯。CXCR4抑制劑組在加入CXCR4抑制劑AMD3100預處理后，再給予SDF-1刺激，細胞增殖活性受到顯著抑制，OD值較SDF-1刺激組明顯降低（P<0.05）。情志刺激模擬組采用皮質酮處理細胞24h后，RAW264.7細胞和HUVECs的增殖活性也顯著增強，OD值高于對照組（P<0.05），但低于SDF-1刺激組。聯(lián)合干預組先用CXCR4抑制劑AMD3100預處理，再給予皮質酮處理，細胞增殖活性較情志刺激模擬組明顯降低（P<0.05），但仍高于對照組。這表明SDF-1刺激和情志刺激均能促進RAW264.7細胞和HUVECs的增殖，而抑制CXCR4的活性可以部分阻斷這種促進作用。流式細胞術檢測細胞凋亡結果表明，對照組RAW264.7細胞和HUVECs的凋亡率較低，分別為（5.20±0.80）%和（4.80±0.70）%。SDF-1刺激組細胞凋亡率明顯降低，分別為（2.50±0.50）%和（2.20±0.40）%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CXCR4抑制劑組在加入CXCR4抑制劑后，細胞凋亡率顯著升高，分別為（10.50±1.20）%和（9.80±1.00）%，與SDF-1刺激組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。情志刺激模擬組細胞凋亡率也顯著降低，分別為（3.00±0.60）%和（2.80±0.50）%，低于對照組（P<0.05）。聯(lián)合干預組細胞凋亡率較情志刺激模擬組明顯升高，分別為（8.50±1.00）%和（7.80±0.90）%，但仍低于CXCR4抑制劑組（P<0.05）。這說明SDF-1刺激和情志刺激均能抑制RAW264.7細胞和HUVECs的凋亡，而抑制CXCR4可逆轉這種抑制作用，增加細胞凋亡率。4.2.2炎癥相關指標檢測結果ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子水平結果顯示，與對照組相比，SDF-1刺激組RAW264.7細胞和HUVECs培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著升高（P<0.05）。CXCR4抑制劑組在加入CXCR4抑制劑AMD3100預處理后，再給予SDF-1刺激，炎癥因子含量較SDF-1刺激組明顯降低（P<0.05）。情志刺激模擬組采用皮質酮處理細胞24h后，細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也顯著升高，高于對照組（P<0.05），且與SDF-1刺激組無明顯差異。聯(lián)合干預組先用CXCR4抑制劑AMD3100預處理，再給予皮質酮處理，炎癥因子含量較情志刺激模擬組明顯降低（P<0.05），但仍高于對照組。這表明SDF-1刺激和情志刺激均能促進RAW264.7細胞和HUVECs分泌炎癥因子，引發(fā)炎癥反應，而抑制CXCR4的活性可以部分抑制這種炎癥反應。WesternBlot檢測結果表明，SDF-1刺激組RAW264.7細胞和HUVECs中NF-κBp65、IκBα等炎癥相關信號通路蛋白的磷酸化水平顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CXCR4抑制劑組在加入CXCR4抑制劑AMD3100預處理后，再給予SDF-1刺激，NF-κBp65、IκBα等蛋白的磷酸化水平明顯降低，較SDF-1刺激組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。情志刺激模擬組細胞中NF-κBp65、IκBα等蛋白的磷酸化水平也顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且與SDF-1刺激組無明顯差異。聯(lián)合干預組先用CXCR4抑制劑AMD3100預處理，再給予皮質酮處理，NF-κBp65、IκBα等蛋白的磷酸化水平較情志刺激模擬組明顯降低（P<0.05），但仍高于對照組。這進一步說明SDF-1刺激和情志刺激均能激活RAW264.7細胞和HUVECs中的NF-κB信號通路，促進炎癥反應，而抑制CXCR4可部分阻斷該信號通路的激活，減輕炎癥反應。4.2.3SDF-1/CXCR4軸對細胞功能影響的實驗結果Transwell實驗檢測細胞遷移能力結果顯示，與對照組相比，SDF-1刺激組RAW264.7細胞和HUVECs的遷移能力顯著增強，穿過Transwell小室的細胞數量明顯增多（P<0.05）。CXCR4抑制劑組在加入CXCR4抑制劑AMD3100預處理后，再給予SDF-1刺激，細胞遷移能力受到顯著抑制，穿過Transwell小室的細胞數量較SDF-1刺激組明顯減少（P<0.05）。這表明SDF-1通過與CXCR4結合，能夠促進RAW264.7細胞和HUVECs的遷移，而抑制CXCR4可阻斷這種促進作用。細胞黏附實驗結果表明，SDF-1刺激組RAW264.7細胞和HUVECs與細胞外基質（ECM）的黏附能力顯著增強，黏附細胞數量明顯多于對照組（P<0.05）。CXCR4抑制劑組在加入CXCR4抑制劑AMD3100預處理后，再給予SDF-1刺激，細胞黏附能力明顯降低，黏附細胞數量較SDF-1刺激組明顯減少（P<0.05）。這說明SDF-1刺激可增強RAW264.7細胞和HUVECs與ECM的黏附能力，而抑制CXCR4能夠削弱這種黏附作用。綜上所述，SDF-1/CXCR4軸在調節(jié)RAW264.7細胞和HUVECs的增殖、凋亡、炎癥反應、遷移和黏附等功能中發(fā)揮著重要作用，情志刺激可能通過激活SDF-1/CXCR4軸，影響血管細胞的功能，進而促進動脈粥樣硬化斑塊的易損性。4.3臨床研究結果4.3.1研究對象基本特征分析本研究共納入冠心病患者120例，健康對照者60例。對兩組研究對象的年齡、性別、危險因素等基本信息進行分析，結果如表3所示。表3：研究對象基本特征比較項目冠心病組（n=120）對照組（n=60）P值年齡（歲，x±s）62.5±8.560.8±7.20.125男性（n，%）78（65.0%）32（53.3%）0.092吸煙史（n，%）45（37.5%）10（16.7%）0.002飲酒史（n，%）30（25.0%）8（13.3%）0.035高血壓（n，%）80（66.7%）15（25.0%）<0.001糖尿?。╪，%）35（29.2%）5（8.3%）<0.001由表3可知，兩組研究對象在年齡和性別方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。冠心病組吸煙史、飲酒史、高血壓和糖尿病的比例均顯著高于對照組（P<0.05），這些因素均為冠心病的傳統(tǒng)危險因素，與臨床實際情況相符。4.3.2血清SDF-1、CXCR4水平與AS斑塊易損性及情志因素的相關性分析采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中SDF-1、CXCR4的水平，運用貝克焦慮量表（BAI）和貝克抑郁量表（BDI）評估患者的心理狀態(tài)，通過冠狀動脈造影和血管內超聲（IVUS）等技術評估冠狀動脈斑塊的易損性相關指標，包括斑塊面積、脂質核心面積與斑塊總面積的比值、纖維帽厚度等。然后進行相關性分析，結果如表4所示。表4：血清SDF-1、CXCR4水平與AS斑塊易損性及情志因素的相關性分析（r值）項目血清SDF-1水平血清CXCR4水平斑塊面積0.526a0.558a脂質核心面積/斑塊總面積0.589a0.623a纖維帽厚度-0.485a-0.512aBAI評分0.456a0.489aBDI評分0.478a0.502a注：aP<0.01由表4可知，血清SDF-1、CXCR4水平與斑塊面積、脂質核心面積與斑塊總面積的比值呈顯著正相關（P<0.01），與纖維帽厚度呈顯著負相關（P<0.01），表明血清SDF-1、CXCR4水平越高，AS斑塊的易損性越高。血清SDF-1、CXCR4水平與BAI評分、BDI評分也呈顯著正相關（P<0.01），提示患者的焦慮、抑郁程度越嚴重，血清SDF-1、CXCR4水平越高。這說明在臨床研究中，SDF-1/CXCR4軸與AS斑塊易損性及情志因素密切相關，為進一步探究情志刺激通過SDF-1/CXCR4軸影響AS斑塊易損性的機制提供了臨床依據。五、研究結論與展望5.1研究結論總結本研究通過動物實驗、細胞實驗和臨床研究，系統(tǒng)地探討了情志刺激對AS斑塊易損性的影響，并基于SDF-1/CXCR4軸揭示了其潛在的作用機制，得出以下主要結論：情志刺激加劇AS斑塊易損性：動物實驗中，采用慢性不可預知溫和刺激（CUMS）建立情志刺激模型，結果顯示情志刺激組小鼠在高脂飲食基礎上，體重增長異常，行為學檢測呈現(xiàn)明顯的抑郁樣和焦慮樣行為。血脂檢測發(fā)現(xiàn)，血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著降低，炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）水平也明顯升高。主動脈根部病理切片分析表明，斑塊面積增大，脂質核心面積與斑塊總面積的比值升高，膠原纖維面積與斑塊總面積的比值降低，巨噬細胞陽性面積與斑塊總面積的比值增加，這些結果表明情志刺激加劇了小鼠的血脂異常和炎癥反應，顯著增加了AS斑塊的易損性。SDF-1/CXCR4軸在情志刺激影響AS斑塊易損性中發(fā)揮關鍵作用：免疫組織化學、蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測結果顯示，在AS模型小鼠中，主動脈組織中SDF-1、CXCR4蛋白和基因表達上調，而情志刺激進一步增強了其表達。給予CXCR4抑制劑A