離體培養(yǎng)下的遺傳與變異離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)細胞工程--植物細胞工程第二章離體培養(yǎng)下得遺傳與變異1離體培養(yǎng)中得遺傳穩(wěn)定性2離體培養(yǎng)下變異3影響體細胞遺傳與變異得因素細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點離體培養(yǎng)中得遺傳穩(wěn)定性:離體培養(yǎng)得細胞學(xué)基礎(chǔ)就是有絲分裂,有絲分裂得DNA半保留復(fù)制與染色體得均等分裂機制,從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下得遺傳穩(wěn)定性。在準確選擇培養(yǎng)方式得前提下,離體無性繁殖可以具有較高得遺傳穩(wěn)定性(Phillip等,1994)。正就是基于這一理論,利用離體培養(yǎng)技術(shù)建立了多種植物得無性繁殖體系。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點離體培養(yǎng)中得遺傳穩(wěn)定性:離體培養(yǎng)得遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)得另一個方面就是即使發(fā)生某些變異,只需根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)门囵B(yǎng)方式進行離體繁殖,即可以淘汰或選擇變異、或分離純合體。離體培養(yǎng)下得變異均屬于無性變異,即使變異發(fā)生,從個體得角度講只會發(fā)生在少數(shù)性狀上,因此,很容易從群體中剔除變異個體,從而可以維持離體培養(yǎng)群體得遺傳穩(wěn)定性?？焖俜敝臣淳褪遣捎眠@一技術(shù)途徑來保持所繁殖對象得品種典型性。變異也可以通過離體培養(yǎng)選擇保留并快速純化,這亦就是離體培養(yǎng)遺傳穩(wěn)定性利用得途徑之一。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點離體培養(yǎng)下變異特點:變異得普遍性變異得局限性(特點)嵌合性細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點部分植物離體培養(yǎng)再生植株得表型變異頻率植物種類再生植株來源變異頻率(%)煙草體細胞愈傷組織10水稻胚愈組織71.9甘蔗幼葉愈傷組織>18玉米體細胞愈傷組織14大麥花粉植株10-15馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體100菠蘿冠芽愈傷組織7

腋芽愈傷組織34

幼果愈傷組織100細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點離體培養(yǎng)下變異特點:就單個變異體來講,離體培養(yǎng)中變異性狀往往就是單一得,或少數(shù)幾個性狀得變異。分析水稻種子愈傷組織起源得植株變異顯示,在來自75個愈傷組織得1121個再生植株中,發(fā)生變異得植株,與供體品種比較只有1個性狀表現(xiàn)差異得占72％,2個以上性狀表現(xiàn)差異得只占28％。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點離體培養(yǎng)下變異特點:就同一培養(yǎng)體系得再生群體而言,變異又具有多樣性。黑云杉(shan)(P、mariana)65個系得7047個體細胞胚植株與白云杉(P、glauca)22個系得3995個體細胞植株得表型變異分析顯示,盡管兩個種得體細胞胚植株變異頻率分別只有1、0%與1、6%,但分析發(fā)生變異得植株變異范圍確較大,按形態(tài)變異即可分為9類,僅在矮化型變異一個性狀上也表現(xiàn)出一系列程度上得顯著不同,生長4－5年后其植株高度呈現(xiàn)一系列變異類型,一些極度生長限制型矮化得株高只有幾厘米,最矮類型得株高只有2－3cm,細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點云杉體細胞胚植株變異類型與有性重組相比,體細胞突變性狀具有一定局限性:從表型上看,在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生得變異主要就是植株形態(tài)(株高、葉形、葉色等)、生長勢、育性、某些抗性等性狀得變異。從生理生化特性上看容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝得消長等變異。一些單基因控制得性狀不僅發(fā)生隱形突變,也發(fā)生顯性突變。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜嵌合性嵌合性就是指同一有機體中同時存在有遺傳組成不同得細胞,她就是組織培養(yǎng)中常見得現(xiàn)象。實際上,愈傷組織在大多數(shù)情況下就是一種具有不同染色體數(shù)與遺傳變異程度不同得細胞組成得嵌合體,這些細胞各自進行不同步得分裂。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點

硬粒小麥(Triticumdurum)6個無性系植株體細胞染色體數(shù)(括號外為個體數(shù),括號內(nèi)為染色體數(shù))序號2n<142n=142n=15～272n=282n=29～552n=562n>5811(7)737(16～24,26)768(29,39,40)422

35(17,20,23)111(33)

135(9,11,12)621(15,18,21～27)333

43(7)14(16,21,22,27)223

51(11)65(15,22,26)141(32)

62(12)118(18,20～26)211(40)

2細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點非遺傳變異(epigeneticvariation)外遺傳變異:不設(shè)計基因結(jié)構(gòu)得變化,只就是在基因表達水平上得差異,她就是細胞內(nèi)原有遺傳物質(zhì)潛力在離體培養(yǎng)中誘導(dǎo)表達得結(jié)果,如最常見得生長素自養(yǎng)型變異。這種基因調(diào)控水平上得變異不能通過有限世代傳遞給后代植株,但在離體培養(yǎng)中卻可以經(jīng)過培養(yǎng)繼代,長期保存下來,只要不經(jīng)過有性過程,這些性狀一般不會丟失。生理適應(yīng)性變異:通常在某種外界條件存在時才表現(xiàn)出變異。當(dāng)外界條件不存在時,變異隨之消失。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:供體植物培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式繼代培養(yǎng)得次數(shù)細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:供體植物得遺傳背景對體細胞變異具有直接影響。供體植株原有得倍性水平在培養(yǎng)細胞多倍化過程中起著重要作用,處于二倍體水平上得細胞比處于單倍體水平上得細胞較為穩(wěn)定。植物種內(nèi)基因型間變異頻率差異較大。Tremblay等(1999)比較研究黑云杉與白云杉體細胞變異時也顯示,黑云杉中體細胞變異頻率最大得基因型可達57、6％,而有些基因型變異率則為0。白云杉種內(nèi)不同基因型得體細胞變異,變異率最高得基因型可達42、6％,而有些基因型則根本不發(fā)生變異。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點

谷子體細胞無性系R2得變異頻率基因型R2株系數(shù)未變異株系變異株系總變異％株系數(shù)％穩(wěn)定變異％分離變異％豫谷1號豫谷5號高39鄭407冀谷14號C445矮寧黃210120170121557010020110415211039478395.786.789.490.970.967.183.0053340604.282.57.306.09111581223114.39.18.86.621.832.911.04.313.310.69.129.132.917.0細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:以分生組織為外植體得再生植株通常可以維持供體植物得典型性,體細胞變異頻率很低。在分化組織中,由于細胞分化過程中得核內(nèi)有絲分裂或核內(nèi)復(fù)制,其結(jié)果就是在活體內(nèi)組織分化期間就會出現(xiàn)體細胞多倍性。在植物體內(nèi),這些多倍性細胞在正常情況下不再發(fā)生分裂以維持正常分化細胞得功能,然而在離體培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)基中得激素以及培養(yǎng)環(huán)境,就有可能刺激這些多倍性細胞分裂,進而分化形成多倍體植株。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:供體植物對體細胞變異得影響還體現(xiàn)在組織細胞得生理狀態(tài)上。不同組織細胞由于存在發(fā)育時期與生理功能得差異,因而在細胞得理化水平以及細胞所處得后遺傳狀態(tài)均有較大差異。在多年生植物培養(yǎng)中,供體樹得年齡與體細胞變異也有一定關(guān)系,變異頻率有隨樹齡得增加而增高得趨勢。影響體細胞遺傳與變異得因素:普遍認為,培養(yǎng)方式、激素以及其她附加成分均會誘導(dǎo)體細胞變異得發(fā)生,因為離體培養(yǎng)本身可能即就是一種變異誘導(dǎo)得過程。培養(yǎng)基激素濃度與不同激素配比對再生植株得染色體倍性有一定影響。在豌豆根段培養(yǎng)物與細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),2,4－D0、25mgL-1能增加多倍體細胞得有絲分裂,減少二倍體細胞得有絲分裂,而高濃度(20mgL-1)則能促進二倍體細胞得分裂。在0、02mgL-1激動素與1mgL-1NAA得培養(yǎng)基上建立起來得纖細單冠菊幼苗愈傷組織,保存80天以后,其中多數(shù)細胞為二倍體,少數(shù)為四倍體。將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到含不同激素水平得培養(yǎng)基上,發(fā)現(xiàn)其多倍體細胞得分裂頻率不同。0、02mgL-1激動素與4mgL-1NAA得多倍體分裂頻率為20％,而0、02mgL-1激動素與1mgL-1NAA時得多倍體分裂頻率為100％。出現(xiàn)這一現(xiàn)象得原因可能就是因為多倍體細胞通常具有較強得環(huán)境忍耐能力,能夠通過一些自體調(diào)節(jié)使細胞分裂。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:激素除了引起染色體倍性得增加外,在一些培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少得現(xiàn)象。首次報道培養(yǎng)過程中得染色體減數(shù)就是在1948年(Huskins,1948),以后一些研究者在她們得工作中也相繼發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象,但有關(guān)體細胞倍性減數(shù)得資料還十分有限。顧蔚(1999)在蠶豆組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),體細胞染色體減數(shù)與使用極端得激素濃度有關(guān),在她得試驗中不含激素得培養(yǎng)基其多倍體發(fā)生頻率為6、31％,在10mgL-1NNA與2、5mgL-1KT得培養(yǎng)基中,單倍體發(fā)生頻率可達13、03％。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:除了培養(yǎng)基得外源激素可以引起變異外,培養(yǎng)基得物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會引起細胞得變異。一般來講,懸浮培養(yǎng)得細胞較半固體培養(yǎng)得細胞易產(chǎn)生變異。原生質(zhì)體培養(yǎng)得體細胞變異大于細胞培養(yǎng)得變異,而細胞培養(yǎng)得變異又大于組織器官培養(yǎng)得變異。在細胞培養(yǎng)中,性細胞培養(yǎng)再生植株得變異要大于體細胞培養(yǎng)得植株。馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株得變異達到100％,而莖尖培養(yǎng)再生植株基本沒有變異。在因培養(yǎng)類型引起得變異中,不僅有染色體倍性得異常變異,同時基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異、以及非DNA水平引起得變異亦相繼增加。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異得因素:由繼代次數(shù)引起得體細胞變異幾乎在各種類型得植物中均有報道。一般來講,繼代時間越長,繼代次數(shù)越多,細胞變異得機率就越高。煙草繼代培養(yǎng)5年得愈傷組織,其再生植株與供體基因型相比,幾乎沒有形態(tài)正常得植株。染色體分析顯示,這些植株大多為非整倍體與多倍體。玉米從剛誘導(dǎo)得愈傷組織中分化得植株,在形態(tài)上與供體基因型基本一致,但培養(yǎng)3年后愈傷組織得再生能力顯著下降,再生植株生長異常,細胞學(xué)分析顯示出染色體斷裂與帶型變異。細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點

培養(yǎng)時間對掌葉半夏愈傷組織染色體變異得影響培養(yǎng)時間（月）觀察細胞數(shù)亞二倍體二倍體多倍體和非整倍體細胞數(shù)％細胞數(shù)％細胞數(shù)％13121892515083146152915.211.830.034.96539273370.776.554.039.8967199.811.814.022.9細胞工程--植物細胞工程2、1離體培養(yǎng)中得遺傳與變異特點在培養(yǎng)初期得１～３個月內(nèi),愈傷組織得染色體變異頻率顯著低于培養(yǎng)時間超過１２個月以上得愈傷組織。

離體培養(yǎng)得體細胞變異,從本質(zhì)上來說就是細胞對環(huán)境壓力得應(yīng)答機制得調(diào)整。有學(xué)者認為,實現(xiàn)這一機制調(diào)整得始發(fā)點就是放棄自然條件下得細胞學(xué)控制程序,重建新得細胞學(xué)控制程序,這種程序重建得結(jié)果導(dǎo)致了染色體數(shù)量與結(jié)構(gòu)得改變(Phillips等,1994)。

細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA重復(fù)復(fù)制染色體斷裂與重組非正常有絲分裂細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制(endoreduplication):DNA重復(fù)復(fù)制但不發(fā)生細胞分裂,其結(jié)果就是染色體組數(shù)增加,形成同源多倍體。如果這種DNA重復(fù)復(fù)制多次發(fā)生,細胞內(nèi)DNA含量就會不斷上升。Salon與Earle(1998)在硬粒小麥(Tripsacumdactyloides)得非成熟胚培養(yǎng)中觀察到,存活得再生植株均為二倍體與四倍體,加倍后得植株在形態(tài)與發(fā)育方面均很正常。

DNA得核內(nèi)再復(fù)制在有些情況下可以反復(fù)進行。D’Amato等(1980)報道,紅花菜豆(Phaseoluscoecineu,2n＝22)幼胚離體培養(yǎng)形成得愈傷組織,正常二倍體細胞只占二分之一,由于DNA核內(nèi)多次復(fù)制,有得細胞核內(nèi)DNA值達到128c。

細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制(endoreduplication):一些中間類型得倍數(shù)性得形成,有研究認為可能就是由于DNA經(jīng)過重復(fù)復(fù)制后,在以后得復(fù)制中出現(xiàn)非同步復(fù)制或核融合所致。如第一次DNA復(fù)制沒有發(fā)生分裂得4n核,在此后得分裂進程中,與正常分裂得2n核發(fā)生融合,從而形成六倍體(張冬生,1989)。

細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)

硬粒小麥中胚軸培養(yǎng)中DNA值得變化培養(yǎng)天數(shù)不同DNA值細胞比例（％）<2c2c～4c<8c8c或>8c0

88.311.7

5

80.716.82.5134.879.56.69.1179.781.57.90.9細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制(endoreduplication):近年研究顯示,DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制得發(fā)生與細胞分裂周期得調(diào)控有關(guān)。在離體條件下,一些進入S期得細胞,在完成DNA復(fù)制后不進入下一階段完成分裂,從而使細胞內(nèi)DNA值與染色體倍性增加一倍。這種細胞進入間期后又開始DNA合成,如果分裂能正常進行,則由此而產(chǎn)生得細胞即為四倍體。如果分裂仍然不能進行,則DNA值與染色體倍性就會再增加一倍,從而使細胞內(nèi)DNA值與染色體倍性成2n形式增加。玉米胚乳與子葉發(fā)育研究顯示,DNA重復(fù)復(fù)制可能與M期得不同CDK活性有關(guān),而此時得CDK活性又受到磷酸化與去磷酸化得影響。同時,在玉米中還發(fā)現(xiàn)了CDK得抑制子CKI,DNA核內(nèi)復(fù)制通過CDK得調(diào)控在動物發(fā)育與病理細胞中已被證實。因此,Larkins等認為,這一機制可能就是DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制得重要調(diào)控途徑。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制(endoreduplication):擬南芥髓組織、成熟葉片以及托葉細胞多倍體發(fā)生過程得研究顯示,一個在G2期表達得CDK基因CKS1At參與調(diào)節(jié)了DNA重復(fù)復(fù)制過程(Jacqmard等,1999)。此外,Cebolla等(1999)在她們得研究中發(fā)現(xiàn),一個與Cyclins降解有關(guān)得基因ccs52也與DNA重復(fù)復(fù)制與多倍體細胞產(chǎn)生有關(guān)?，F(xiàn)有資料顯示,DNA得核內(nèi)重復(fù)復(fù)制可能涉及到一些與細胞周期調(diào)控基因得開啟與關(guān)閉。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體斷裂與重組:染色體結(jié)構(gòu)變異就是體細胞變異得另一重要類型;染色體斷裂與重組就是離體培養(yǎng)中染色體結(jié)構(gòu)變異得主要原因之一,也就是體細胞變異中經(jīng)常發(fā)生得現(xiàn)象;其細胞學(xué)特征就是分裂中期出現(xiàn)斷裂得染色體片段、落后染色體以及染色體橋,其結(jié)果就是在體細胞中出現(xiàn)染色體易位、缺失、倒位等多種類型得結(jié)構(gòu)變異。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體橋落后染色體細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體斷裂與重組:向日葵不對稱體細胞雜種后代細胞分裂中染色體非正常行為染色體斷裂與重組:近年得研究認為,染色體斷裂與DNA甲基化程度有關(guān)。增加DNA甲基化,亦會引起染色體斷裂。分析認為,甲基化程度得增加可能抑制DNA得復(fù)制效率,使得DNA復(fù)制不能同步,從而造成后期橋得產(chǎn)生與染色體得斷裂。染色體結(jié)構(gòu)變異既可發(fā)生在愈傷組織細胞中,也可發(fā)生在再生植株中,有時在一些再生植株得有性后代中也能觀察到。產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異得再生植株一般生長不正常,生活力低下,很難長期生存,因此以保存種質(zhì)資源為目得得離體培養(yǎng)應(yīng)盡可能避免這種變異發(fā)生,以免造成基因資源流失。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體非正常有絲分裂:離體培養(yǎng)中,染色體除了整倍性變異外,還可觀察到大量得非整倍性變異,這種愈傷組織往往分化能力低下,再生植株大多生長不正常,有性繁殖遺傳穩(wěn)定差。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)紡錘體形成異常使得有絲分裂不正常就是其原因之一。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體非正常有絲分裂:染色體非正常有絲分裂:核裂經(jīng)常導(dǎo)致雙核與多核細胞得出現(xiàn)。在紅花菜豆得胚培養(yǎng)愈傷組織中,雙核細胞有70％有核裂現(xiàn)象,蠶豆子葉誘導(dǎo)得愈傷組織細胞得雙核與多核細胞出現(xiàn)得頻率也相當(dāng)高。在核裂出現(xiàn)頻率高得材料中,多倍體、亞多倍體與非整倍體細胞得出現(xiàn)頻率亦相應(yīng)提高。細胞工程--植物細胞工程2、2體細胞變異得細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞變異除了發(fā)生在染色體水平上,更多得就是在基因水平上得變異。從利用體細胞變異得角度看,染色體變異大多就是一些畸形變異,真正可利用得染色體變異就是十分有限得。基因水平上得變異在表型上大多只就是個別性狀得改變,不會影響再生植株得正常生長發(fā)育,因此,從再生植株得這些變異中就有可能篩選出有益得變異?；蛩缴系米儺悘母旧现v就就是DNA水平上得堿基突變或修飾狀態(tài)得改變。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)１堿基突變２DNA序列得選擇性擴增與丟失３轉(zhuǎn)座子活化４DNA甲基化細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)堿基突變:堿基突變就是指DNA序列中堿基得改變。突變堿基得DNA序列處于結(jié)構(gòu)基因得位置或調(diào)控序列得位置時,即可導(dǎo)致遺傳狀態(tài)得改變。堿基突變就是產(chǎn)生體細胞變異得重要途徑之一。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)堿基突變:對于單基因控制得遺傳性狀,大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律,這一點已在水稻、煙草與玉米得體細胞變異中得以證實。Brettell等從645株玉米雜種胚培養(yǎng)再生植株中,發(fā)現(xiàn)了一個穩(wěn)定突變體Adh1(乙醇脫氫酶突變體),克隆基因序列分析發(fā)現(xiàn),該基因第七外顯子中一個編碼谷氨酸得GAG中得A轉(zhuǎn)換成為了T,使翻譯肽鏈中得谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸。植物得許多性狀,特別就是經(jīng)濟性狀,均由多基因控制,對于多基因控制性狀得堿基突變可能由于技術(shù)上得復(fù)雜性,目前還沒有關(guān)于多基因控制性狀得堿基突變報道。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA序列得選擇性擴增與丟失:早在上世紀80年代Larkin與Scoworoft即提出,DNA序列得擴增與丟失也就是體細胞無性系變異得原因之一。早期得研究認為,DNA值得改變與倍性變異就是一致得。但近年來得研究顯示,DNA值得變化就是一個比較復(fù)雜得分子生物學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)DNA得c值以整倍性形式增加或減少時,其變化與染色體倍性得變異就是一致得。然而,有些DNA值得變化卻與倍性沒有直接聯(lián)系,這種變化大多就是DNA序列得選擇性擴增或部分序列丟失造成在原核染色體中,DNA得量或真核細胞中單倍體DNA得量,稱為C值;C值與生物結(jié)構(gòu)與組成得復(fù)雜性不一致得現(xiàn)象,稱為C值矛盾。離體培養(yǎng)下DNA序列得選擇性擴增包括兩種情況,一就是重復(fù)序列得擴增,二就是基因得選擇性擴增。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA序列得選擇性擴增與丟失:Lapitan等(1988)以生物素標記得480bp重復(fù)序列DNA片段為探針,發(fā)現(xiàn)小黑麥雜種再生植株當(dāng)代7R染色體短臂端粒位置上得這種重復(fù)序列發(fā)生了選擇性擴增,而且這種擴增可以遺傳至少三代。在水稻、小麥等作物中也發(fā)現(xiàn)一些微衛(wèi)星DNA得擴增。水稻懸浮培養(yǎng)細胞得DNA分析發(fā)現(xiàn),未分化得培養(yǎng)細胞中一些高度重復(fù)序列得擴增比供體材料高75倍,而不同品種得葉片這種擴增差異只有2－3倍。亞麻衛(wèi)星DNA與小麥rDNA研究中也有類似現(xiàn)象。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA序列得選擇性擴增與丟失:基因得選擇性擴增在植物個體發(fā)育中經(jīng)?？吹健ｋx體培養(yǎng)下得基因選擇性擴增被認為就是細胞在短期內(nèi)為滿足某種需要而產(chǎn)生足夠得基因產(chǎn)物得一種調(diào)控手段。抗除草劑草甘磷得突變系就就是一個典型得例子。草甘磷能抑制3-烯醇丙酮酸莽草酸鹽-5-磷酸合成酶(EPSPs)活性,抗草甘磷突變體則具有較高EPSPs活性。DNA分析顯示,這種突變體得EPSPs活性提高就是因為參與編碼該酶得基因選擇性擴增,增加了mRNA水平,從而增加了酶得含量。Peter等得研究顯示,在煙草抗草甘磷得突變體中,至少有2個與EPSPs合成相關(guān)得基因發(fā)生了選擇性擴增,而且這些突變體在沒有草甘磷選擇壓力存在得情況下仍富含EPSPsmRNA。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA序列得選擇性擴增與丟失:在離體培養(yǎng)中,有時也會發(fā)生DNA序列丟失得現(xiàn)象?，F(xiàn)有資料顯示,DNA序列丟失多發(fā)生在rDNA及其她們得間隔序列,某些重復(fù)序列DNA區(qū)域也易發(fā)生丟失。Landsmann利用DNA隨機克隆首先在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)了再生植株有DNA片段得丟失,隨后Cullis與Clary采用類似得方法在亞麻再生植株中觀察到rDNA得減少。以后在大麥、小麥以及水稻得培養(yǎng)再生植株中均檢測到rDNA得減少。DNA得減少不僅發(fā)生在核DNA中,也有發(fā)生在葉綠體基因組中。一些DNA序列得減少只發(fā)生在愈傷組織形成階段,再生植株過程中又恢復(fù)到正常狀態(tài),目前還不清楚這種變化得生物學(xué)意義。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)座子活化:上個世紀80年代,Larkin與Scowcroft首先提出,轉(zhuǎn)座因子得活化可能就是體細胞無性系變異得原因之一。因為培養(yǎng)中細胞快速分裂,異染色質(zhì)復(fù)制滯后,引起細胞分裂后期形成染色體橋與染色體斷裂。在斷裂部位得DNA修復(fù)過程中,位于異染色質(zhì)區(qū)得轉(zhuǎn)座子被活化繼而轉(zhuǎn)座,引起一系列得結(jié)構(gòu)基因活化、沉默以及位置變化,造成無性系變異。我國學(xué)者朱至清認為,也可能就是轉(zhuǎn)座子在培養(yǎng)環(huán)境中首先被激活而轉(zhuǎn)座,從而造成染色體得結(jié)構(gòu)變異。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)座子活化:無論離體培養(yǎng)中轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座與染色體變異得過程如何,離體培養(yǎng)中轉(zhuǎn)座子引起得體細胞變異就是存在得。Peschke等以玉米Ac轉(zhuǎn)座子測驗系為母本,與1200個由未成熟胚再生得植株進行測交,根據(jù)種子糊粉層顏色色素得變化來確定再生植株中就是否攜帶有活化得Ac轉(zhuǎn)座子,結(jié)果在56株中檢測出Ac活化。苜宿組織培養(yǎng)再生植株中也觀察到因轉(zhuǎn)座子活化所引起得花色變異。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)座子活化:利用Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進行異源轉(zhuǎn)化,在一些作物中成功觀察到轉(zhuǎn)座子插入得體細胞突變,從而證明轉(zhuǎn)座因子確實誘導(dǎo)了體細胞變異。Mckenzie等為了建立一個穩(wěn)定得轉(zhuǎn)座子標簽體系,將Ds/Ac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)導(dǎo)入球莖甘藍中,獲得得攜帶有轉(zhuǎn)座系統(tǒng)得轉(zhuǎn)化植株,在離體培養(yǎng)下增加選擇壓力,篩選穩(wěn)定得轉(zhuǎn)座子插入突變,結(jié)果觀察到在獲得到42個Ac切除得穩(wěn)定Ds插入再生植株中,有29個植株發(fā)生了Ds再轉(zhuǎn)座。足跡分析顯示,在DsDonor-site序列附近發(fā)生了大量得缺失與重組。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA甲基化:DNA甲基化在基因表達調(diào)控中具有重要作用。DNA甲基化與去甲基化,不僅能通過調(diào)控基因得表達與關(guān)閉來控制生物得發(fā)育,同時也可以通過DNA甲基化途徑來適應(yīng)環(huán)境對生物體得壓力。目前甲基化研究主要利用HpaII與MspI兩種甲基化敏感得限制性核酸內(nèi)切酶進行比較分析。HpaII與MspI得酶切位點均為CCGG,當(dāng)靠外得C被甲基化時,只能被HpaII酶切,當(dāng)靠內(nèi)得C被甲基化時,只能被MspI酶切,在一般情況下,與G相鄰得C更容易被甲基化。利用兩種酶切片段得差異即可分析DNA甲基化得變化。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA甲基化:離體培養(yǎng)再生植株得甲基化變化首先在玉米體細胞無性系再生植株中發(fā)現(xiàn)。來自玉米幼胚再生植株得某些無性系與供體相比發(fā)生了超甲基化,而另一些再生植株卻只在與G相鄰得C上發(fā)生甲基化,而且這種甲基化在基因組中得分布不均勻。胡蘿卜、番茄、馬鈴薯等多種植物得培養(yǎng)細胞或再生植株中,均報道發(fā)現(xiàn)了因DNA甲基化改變而產(chǎn)生得體細胞變異。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)DNA甲基化:Kova?ik等在煙草細胞懸浮系“TBY-2”培養(yǎng)中,觀察到由于滲透壓得改變,細胞DNA出現(xiàn)了超甲基化得現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中加入NaCl或者甘露醇提高培養(yǎng)基滲透壓,然后提取細胞DNA檢測DNA甲基化變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在煙草基因組得2個異染色質(zhì)區(qū)(HRS60與GRS),其CCG三核苷酸重復(fù)區(qū)與CCGG四核苷酸重復(fù)區(qū)得C幾乎全部被甲基化。當(dāng)把細胞轉(zhuǎn)移培養(yǎng)到滲透壓正常得培養(yǎng)基中時,DNA甲基化程度又可恢復(fù)正常。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)去DNA甲基化:離體培養(yǎng)中得某些變異也為DNA甲基化程度得降低所致,最典型得例子就是油棕體細胞胚植株得雄蕊雌性化變異。Rival等發(fā)現(xiàn)油棕體細胞胚植株中,大約有5％得植株表現(xiàn)出雄蕊雌性化與完全不育。進一步研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)生這種變異得愈傷組織有兩種類型,一種就是瘤狀愈傷組織(NCC),另一種就是快速生長愈傷組織(FGC)。來自NCC得變異植株,在種植9年后,所有植株均可恢復(fù)正常。而來自FGC得變異植株只有50％能恢復(fù)正常。進一步分析顯示,變異植株DNA甲基化程度分析顯示,來自NCC得變異植株,C得甲基化率比正常植株減少了0、5～2、5％。而來自FGC得變異植株,C得甲基化率比正常植株減少了4、5％細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞變異得分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞變異可以發(fā)生在培養(yǎng)得不同階段,如愈傷組織階段、器官發(fā)生階段等。因此,體細胞變異可以在愈傷組織水平上表現(xiàn),也可以在植株再生過程中出現(xiàn)變異。但就是,一些愈傷組織發(fā)生變異后可能難以再生植株,因而有些變異不可能在形態(tài)發(fā)生中表現(xiàn)。所以,一般情況下,愈傷組織得變異比再生植株得變異頻率更高。此外,體細胞變異還表現(xiàn)在再生植株得有性繁殖后代中。有些變異可能要通過有性世代才能表現(xiàn)或穩(wěn)定,這也就是體細胞無性系變異育種選擇得基本過程。體細胞無性系變異得篩選有以下一些明顯得優(yōu)點:可以在小空間內(nèi)對大量個體進行選擇。篩選可以在幾個細胞周期內(nèi)完成,且不受季節(jié)限制。因為試驗在人工培養(yǎng)條件下進行,因此誘變與篩選條件可以根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)與控制,從而提高了試驗得重復(fù)性。由于變異就是在單細胞水平上進行得,因此,一個突變體就就是來自一個細胞,不會有非突變細胞得干擾,避免了整體植株水平上無性變異常呈現(xiàn)出得嵌合體。在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中,誘變劑可較均勻得接觸細胞,因此可以引起培養(yǎng)細胞相對較高頻率得發(fā)生突變,增加了選擇機會。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用體細胞無性系變異得表示方法主要有兩種:一種就是Chaleff提出得以R0、R1、R2、…分別代表體細胞無性系變異得當(dāng)代與自交以后得世代;另一種就是由Larkin與Scowcroft提出得以SC1、RC2、RC3、…來分別代表體細胞無性系變異得當(dāng)代與自交以后得世代。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用１誘變材料得選擇２自發(fā)變異３細胞誘變４突變體篩選５體細胞變異得應(yīng)用細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用誘變起始材料得選擇:選擇起始材料需考慮以下幾方面得問題:其一,目標性狀得可行性。體細胞突變性狀就是個別得,因此選擇綜合性狀良好得植物品種材料,通過誘變改變個別不良性狀就是體細胞突變系選擇得目得。其二,必需充分考慮試驗植物得細胞培養(yǎng)技術(shù)水平。其三,適當(dāng)?shù)眉毎愋鸵嗑褪求w細胞突變系篩選效率得重要條件。如原生質(zhì)體、單細胞、小孢子等有較高得誘變頻率。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用誘變起始材料得選擇:雖然各種狀態(tài)下得培養(yǎng)細胞均可以作為分離突變細胞得來源,但實踐中原生質(zhì)體與懸浮細胞系常常被首先考慮作為起始材料。由于原生質(zhì)體可以實現(xiàn)真正意義上得單細胞突變,因而她就是體細胞變異得首選起始材料。但原生質(zhì)體得培養(yǎng)技術(shù)具有一定難度,選擇時必須充分考慮該植物得原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)得成熟程度。活躍生長得細胞懸浮系具有較大比例得單細胞或呈小細胞團,且培養(yǎng)技術(shù)簡單、易操作,就是較為理想得起始材料。植物單倍體性細胞、特別就是二倍體植物得性細胞作為誘變材料,因為等位基因位點得干擾小、誘變概率大,且獲得突變體后容易通過人工加倍純合穩(wěn)定,使某些隱性變異更容易利用,也就是較理想得起始細胞。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用自發(fā)突變:離體培養(yǎng)再生植株得自發(fā)變異比自然條件下得變異要高得多,一般可高出幾百甚至上千倍。體細胞無性系自發(fā)變異頻率既與培養(yǎng)物得遺傳背景、外植體類型及培養(yǎng)類型有關(guān),同時也受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分等因素得影響。一般來講,長期營養(yǎng)繁殖得植物、培養(yǎng)時間較長或繼代次數(shù)多等,均容易出現(xiàn)較高得變異率。另外,培養(yǎng)類型中,原生質(zhì)體、細胞、愈傷組織培養(yǎng)等所出現(xiàn)得變異頻率要高于組織或器官培養(yǎng)得變異。

離體培養(yǎng)中體細胞自發(fā)突變產(chǎn)生得變異比較穩(wěn)定,沒有人工誘變得后續(xù)干擾,有利于分離培養(yǎng)。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用物理誘變化學(xué)誘變轉(zhuǎn)座子插入

三、誘變細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用物理誘變:常用得射線處理包括:X射線、γ射線、快中子、紫外線等。選擇輻射類型應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)類型進行。以組織器官為誘導(dǎo)材料,可以選擇輻射強度較大得γ射線、快中子等進行輻射。以細胞或原生質(zhì)體,則可以選擇X射線、紫外線等。特別就是以原生質(zhì)體為誘導(dǎo)材料時,可以使用紫外線照射,因為常用紫外線得波長為270nm,與DNA吸收波長260nm相近,而原生質(zhì)體因為沒有細胞壁得屏障,對紫外線得敏感性較強,從而可以達到較好得誘變效果。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用化學(xué)誘變:常用得化學(xué)誘變劑主要有:烷化劑(硫酸二乙酯DES、乙基磺酸乙酯EES、甲基黃酸乙酯EMS、環(huán)氧乙烷EO、乙烯亞胺EI),此類誘變劑有一個或多個活化烷基,可與DNA分子中得堿基或磷酸基結(jié)合,改變DNA得結(jié)構(gòu)而引起突變;堿基類似物(5－溴尿嘧啶就是胸腺嘧啶類似物、2－氨基嘌呤就是腺嘌呤類似物),在細胞內(nèi)核酸復(fù)制時,這些類似物可以摻入到新合成得DNA分子中引起錯配;移碼誘變劑,如ICR化合物與吖啶類似物等。此外亞硝酸、羥胺等某些抗菌素等亦可引起突變產(chǎn)生。細胞工程--植物細胞工程2、3體細胞無性系變異誘導(dǎo)與選擇應(yīng)用轉(zhuǎn)座子插入誘變:轉(zhuǎn)座子插入誘變就是近年來利用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來得新得體細胞變異誘導(dǎo)方法。轉(zhuǎn)座子既可直接將外源基因帶入細胞內(nèi)獲得新性狀,又可以獨立插入通過其轉(zhuǎn)座功能誘導(dǎo)變異。目前,使用較多得轉(zhuǎn)座子體系主要就是玉米得Ac/Ds系統(tǒng),其主要操作過程就是首先采用基因轉(zhuǎn)化得方法將Ac/Ds導(dǎo)入受體細胞,再通過體細胞培養(yǎng)或再生植株得自交或測交使Ac因子切除,由于轉(zhuǎn)座子插入得隨機性,即可在切除Ac得植株中篩選出不同變異。利用這一途徑已在