基于Nrf2信號通路的夏枯草三萜類化合物肺癌化學預防機制探究一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，已成為癌癥相關死亡的首要原因，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。根據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，2020年全球新增肺癌病例220萬，死亡病例180萬，發(fā)病率和死亡率均位居各類癌癥之首。在中國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，2020年中國新增肺癌病例約82萬，死亡病例約71萬，且近年來呈現(xiàn)出持續(xù)增長的趨勢。肺癌的高死亡率主要歸因于其早期癥狀隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，多數患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機。目前，肺癌的治療手段主要包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方法往往伴隨著嚴重的副作用，且對于中晚期肺癌患者的治療效果有限，患者的5年生存率仍然較低。因此，肺癌的預防顯得尤為重要，探尋安全有效的預防策略是降低肺癌發(fā)病率和死亡率的關鍵。中醫(yī)“治未病”思想源遠流長，最早可追溯至《黃帝內經》，其倡導“上工治未病，不治已病”，強調在疾病尚未發(fā)生之前采取積極的預防措施，或在疾病初期及時干預，防止病情進一步發(fā)展。這一思想與現(xiàn)代醫(yī)學中的化學預防理念不謀而合，均旨在通過藥物或其他干預手段，阻斷或逆轉疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在肺癌的預防領域，中醫(yī)“治未病”思想具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的應用前景，為肺癌的預防提供了新的思路和方法。夏枯草作為一種常用的中藥材，在中醫(yī)臨床實踐中具有悠久的應用歷史，其性苦寒，歸肝、膽經，具有清肝瀉火、明目、散結消腫等功效?，F(xiàn)代研究表明，夏枯草富含多種化學成分，包括三萜類、黃酮類、酚酸類、多糖類等，其中三萜類化合物是其主要的活性成分之一。夏枯草三萜類化合物具有多種生物活性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等，在肺癌的防治方面展現(xiàn)出了顯著的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草三萜類化合物能夠抑制肺癌細胞的增殖、誘導肺癌細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤血管生成以及調節(jié)免疫功能等，從而發(fā)揮對肺癌的化學預防作用。然而，目前對于夏枯草三萜類化合物防治肺癌的作用機制尚未完全明確，仍有待進一步深入研究。本研究基于中醫(yī)“治未病”思想，以夏枯草三萜類化合物為研究對象，旨在深入探討其在肺癌化學預防中的作用機制，為肺癌的預防提供新的理論依據和潛在的藥物靶點，以期為肺癌的防治開辟新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的和意義本研究旨在基于中醫(yī)“治未病”思想，深入探究夏枯草三萜類化合物在肺癌化學預防中的作用機制，為肺癌的預防提供新的理論依據和潛在的藥物靶點。具體而言，通過體內外實驗，從細胞和分子水平研究夏枯草三萜類化合物對肺癌細胞增殖、凋亡、周期阻滯、腫瘤血管生成以及免疫調節(jié)等方面的影響，明確其在肺癌化學預防中的關鍵作用環(huán)節(jié)和潛在作用靶點，為開發(fā)基于夏枯草三萜類化合物的肺癌預防藥物奠定基礎。肺癌作為全球范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，給人類健康帶來了巨大的威脅。目前，肺癌的治療手段雖然不斷發(fā)展，但仍存在諸多局限性，如手術治療適用于早期肺癌患者，中晚期患者往往失去手術機會；化療和放療在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常組織和器官造成嚴重的損傷，導致患者生活質量下降。因此，肺癌的預防成為降低肺癌發(fā)病率和死亡率的關鍵。中醫(yī)“治未病”思想強調未病先防、既病防變和愈后防復，在疾病的預防和治療中具有獨特的優(yōu)勢。夏枯草作為中醫(yī)常用的抗癌中藥，其所含的三萜類化合物具有多種生物活性，在肺癌的防治中展現(xiàn)出了良好的應用前景。深入研究夏枯草三萜類化合物的肺癌化學預防機制，不僅有助于揭示其防治肺癌的科學內涵，為中醫(yī)“治未病”思想在肺癌預防中的應用提供科學依據，還能為肺癌的預防和治療提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床應用價值。此外，本研究對于豐富和發(fā)展中醫(yī)藥理論，推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程也具有積極的促進作用。通過現(xiàn)代科學技術手段，深入研究中藥的有效成分和作用機制，有助于挖掘中醫(yī)藥的潛在價值，提高中醫(yī)藥的國際影響力，為全球健康事業(yè)做出貢獻。1.3研究方法和創(chuàng)新點本研究將綜合運用多種研究方法，從整體動物水平、細胞水平以及分子蛋白水平等多個維度深入探究夏枯草三萜類化合物的肺癌化學預防機制。在整體動物水平，構建合適的肺癌動物模型，如常用的KM小鼠模型、裸鼠模型以及A/J小鼠模型等。通過給予不同劑量的夏枯草三萜類化合物干預，觀察動物的腫瘤發(fā)生情況，包括腫瘤的數量、大小、重量等指標，以及對動物整體健康狀況和生存周期的影響，從而全面評估其在體內的肺癌化學預防效果。在細胞水平，建立人肺癌細胞系（如A549、SPC-A-1等）和人正常支氣管上皮細胞系（NHBE）體外培養(yǎng)體系。運用細胞增殖實驗（如MTT法、CCK-8法）檢測夏枯草三萜類化合物對肺癌細胞增殖的抑制作用；采用流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況，明確其對肺癌細胞周期的阻滯作用以及誘導凋亡的能力；通過線粒體膜電位檢測，探究其對肺癌細胞線粒體功能的影響。此外，還將利用細胞劃痕實驗和Transwell實驗研究其對肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響。在分子蛋白水平，運用Westernblot技術檢測凋亡相關蛋白（如cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、Bax、Bcl-2等）、細胞周期相關蛋白（如CyclinD1、p21等）以及信號通路相關蛋白（如Nrf2、Keap1等）的表達變化，深入揭示其作用機制。同時，采用實時熒光定量PCR技術檢測相關基因的表達水平，從轉錄水平進一步驗證蛋白表達結果。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下兩個方面。其一，從多水平、多維度研究夏枯草三萜類化合物的肺癌化學預防機制，將整體動物實驗、細胞實驗和分子蛋白實驗有機結合，全面深入地揭示其作用機制，彌補了以往研究僅從單一水平進行探討的不足，為深入理解夏枯草三萜類化合物的抗癌作用提供了更為系統(tǒng)和全面的視角。其二，對夏枯草三萜類化合物進行深入探索，目前雖然已有一些關于夏枯草三萜類化合物抗癌作用的研究報道，但對于其具體的化學預防機制仍未完全明確，本研究將進一步深入挖掘其潛在的作用靶點和信號通路，有望為肺癌的化學預防提供新的理論依據和潛在的藥物靶點。二、夏枯草三萜類成分及肺癌化學預防概述2.1夏枯草簡介夏枯草（PrunellavulgarisL.），為唇形科（Lamiaceae）夏枯草屬多年生草木植物，又名燈籠草、絲線吊銅鐘。其根莖匍匐，在節(jié)上生須根，莖高達30厘米，呈紫紅色，基部有許多分枝。葉卵狀長圓形或卵形，基部圓形，花序呈穗狀，苞片淡紫色，花萼鐘形，花冠紅紫、紫或白色，小堅果為圓狀卵球形，黃褐色，微具單溝紋，花期4-6月，果期7-10月。夏枯草喜溫和濕潤氣候，耐寒，適應性較強，常野生于荒坡、草地、溪旁及路邊等濕潤之地，海拔可達3000米。其分布范圍廣泛，在俄羅斯、巴基斯坦、尼泊爾、不丹等國家均有分布，在澳大利亞等地亦偶見，在中國主要產于秦嶺以南各省及新疆。夏枯草作為一味傳統(tǒng)的中藥材，在中醫(yī)藥領域具有悠久的應用歷史，其首次以“夏枯草”之名被收錄于《神農本草經》，列為下品，在歷代本草文獻中還有夕句、乃東、麥夏枯、麥穗夏枯草、鐵色草等諸多別名。金代李東恒的《珍珠囊遺藥性賦》最早對“夏枯草”之名進行注解，稱“夏枯草至夏即枯，故名”。中醫(yī)認為，夏枯草性寒，味辛、微苦，歸肝、膽經，具有清肝瀉火、明目、散結消腫等功效。在臨床上，常用于治療肝經熱證，如頭痛、目赤腫痛；肝氣郁結導致的瘰疬、乳癰；肝不藏血導致的血崩；產后血暈，赤白帶下；祛毒療瘡止痛以及汗斑白癲等病癥。民國《新本草綱目》更是稱其為治瘰疬之圣藥。2.2夏枯草三萜類成分夏枯草中含有多種三萜類成分，主要包括齊墩果烷型、烏索烷型和羽扇豆烷型三萜。截至目前，從夏枯草屬植物中已分離得到28個三萜類化合物，其中三萜皂苷元20個，皂苷8個。這些三萜類化合物具有豐富的結構多樣性，其母核結構的差異以及取代基的種類、位置和數量的不同，賦予了它們獨特的生物活性。齊墩果烷型三萜是夏枯草中較為常見的一類三萜，其基本骨架具有五環(huán)三萜的結構特征，由30個碳原子組成，A/B、B/C、C/D環(huán)均為反式稠合，D/E環(huán)為順式稠合。在齊墩果烷型三萜中，常見的取代基有羥基、羧基、羰基等，它們通常連接在母核的不同位置，如3位、12位、28位等。例如，齊墩果酸（Oleanolicacid）是齊墩果烷型三萜的代表化合物之一，其化學結構為3β-羥基-齊墩果-12-烯-28-酸，在夏枯草中含量較為豐富。齊墩果酸具有多種生物活性，如保肝、抗炎、抗菌、抗腫瘤等，其作用機制可能與調節(jié)細胞信號通路、抑制炎癥因子表達、誘導細胞凋亡等有關。研究表明，齊墩果酸能夠通過激活Nrf2/ARE信號通路，增強抗氧化酶的活性，減輕氧化應激損傷，從而發(fā)揮對肝臟的保護作用。烏索烷型三萜與齊墩果烷型三萜具有相似的五環(huán)三萜骨架結構，但它們在母核的某些碳原子上的構型存在差異。烏索烷型三萜的A/B、B/C、C/D環(huán)同樣為反式稠合，而D/E環(huán)為反式稠合，這一結構特點使得烏索烷型三萜在空間構象上與齊墩果烷型三萜有所不同。在烏索烷型三萜中，熊果酸（Ursolicacid）是一種重要的代表化合物，其化學結構為3β-羥基-烏索-12-烯-28-酸。熊果酸具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂等。在抗腫瘤方面，熊果酸能夠誘導腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。其作用機制可能涉及到對多種信號通路的調控，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，通過調節(jié)這些信號通路中的關鍵蛋白表達，影響腫瘤細胞的生物學行為。羽扇豆烷型三萜在夏枯草中也有一定的分布，其母核結構同樣為五環(huán)三萜，與齊墩果烷型和烏索烷型三萜的主要區(qū)別在于E環(huán)為五元環(huán)，且在C-20位有一個異丙烯基取代。這種獨特的結構賦予了羽扇豆烷型三萜特殊的生物活性。例如，白樺脂酸（Betulinicacid）是羽扇豆烷型三萜的典型代表，具有顯著的抗腫瘤活性，尤其對黑色素瘤等多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用。白樺脂酸能夠誘導腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能與激活caspase級聯(lián)反應、調節(jié)線粒體膜電位、抑制腫瘤細胞的端粒酶活性等有關。提取夏枯草中的三萜類成分，常見的方法有溶劑提取法、超聲提取法、微波輔助提取法等。溶劑提取法是利用三萜類成分在不同溶劑中的溶解度差異進行提取，常用的溶劑有乙醇、甲醇、***等。超聲提取法則是借助超聲波的空化作用、機械作用和熱效應，加速三萜類成分從植物細胞中釋放出來，提高提取效率。微波輔助提取法是利用微波的熱效應和非熱效應，使植物細胞內的溫度迅速升高，細胞破裂，從而促進三萜類成分的溶出。在實際應用中，可根據具體情況選擇合適的提取方法，也可將多種方法結合使用，以提高提取效果。分離和鑒定夏枯草三萜類成分的常用方法包括硅膠柱層析、制備型高效液相色譜、薄層層析、核磁共振波譜（NMR）、質譜（MS）等。硅膠柱層析是利用硅膠對不同化合物的吸附能力差異進行分離，通過選擇合適的洗脫劑，可將三萜類成分與其他雜質分離。制備型高效液相色譜具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，能夠實現(xiàn)三萜類成分的快速分離和純化。薄層層析則是一種簡單、快速的分離分析方法，可用于初步判斷三萜類成分的純度和組成。核磁共振波譜（NMR）是鑒定三萜類化合物結構的重要手段，通過分析1H-NMR、13C-NMR等譜圖中的化學位移、耦合常數等信息，可確定三萜類化合物的骨架結構、取代基位置和構型等。質譜（MS）則可提供化合物的分子量、分子式等信息，與NMR等技術結合，能夠準確鑒定三萜類化合物的結構。2.3肺癌化學預防概念肺癌化學預防是指利用天然或合成的化學物質，通過干預肺癌發(fā)生發(fā)展的生物學過程，降低肺癌的發(fā)生率、死亡率或改善肺癌患者預后的策略。其核心在于通過調節(jié)細胞的生理生化過程，阻斷或逆轉肺癌的癌前病變，防止正常細胞向癌細胞轉化，或抑制癌細胞的生長和擴散。肺癌化學預防的理論基礎源于對肺癌發(fā)生發(fā)展機制的深入研究，認為肺癌是一個多因素、多階段、多基因參與的復雜病理過程，在肺癌發(fā)生的早期階段，細胞的分子生物學和遺傳學改變是可逆的，這為化學預防提供了可能。肺癌化學預防可分為一級預防、二級預防和三級預防。一級預防旨在消除或減少肺癌的危險因素，從源頭上預防肺癌的發(fā)生。這包括控制吸煙，吸煙是肺癌的主要危險因素，約80%以上的肺癌與吸煙有關，戒煙或減少吸煙量可顯著降低肺癌的發(fā)病風險；改善環(huán)境空氣質量，減少大氣污染、室內空氣污染（如二手煙、裝修污染等）以及職業(yè)暴露（如石棉、氡氣、砷等）；調整飲食結構，增加蔬菜、水果、全谷物等富含抗氧化劑、維生素和膳食纖維食物的攝入，有助于降低肺癌的發(fā)生風險。二級預防側重于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療肺癌。通過對高危人群進行定期篩查，如低劑量螺旋CT篩查，可發(fā)現(xiàn)早期肺癌病變，從而實現(xiàn)早期干預，提高治愈率和生存率。對于肺癌高危人群，如長期大量吸煙者、有肺癌家族史者、職業(yè)暴露人群等，建議定期進行低劑量螺旋CT檢查，以便早期發(fā)現(xiàn)肺癌的蛛絲馬跡。早期診斷和治療可以有效阻止肺癌的進展，提高患者的生存質量和預后。三級預防主要針對已經確診的肺癌患者，目的是防止病情惡化，減少并發(fā)癥，提高患者的生存質量和生存率。這包括采用綜合治療手段，如手術、化療、放療、靶向治療、免疫治療等，根據患者的具體情況制定個性化的治療方案；同時，注重患者的康復護理和心理支持，幫助患者緩解治療過程中的不適，提高生活質量。在肺癌的三級預防中，還強調對患者的隨訪管理，及時發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的復發(fā)和轉移情況。近年來，肺癌化學預防的研究取得了一定的進展。在化學預防藥物方面，一些天然產物和合成藥物展現(xiàn)出了潛在的應用前景。例如，維生素類（如維生素A、維生素C、維生素E等）、硒元素、茶多酚等天然抗氧化劑，被認為可能通過抗氧化、抗炎、調節(jié)細胞周期等機制發(fā)揮肺癌化學預防作用。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚中的主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）能夠抑制肺癌細胞的增殖和遷移，誘導肺癌細胞凋亡，其作用機制可能與調節(jié)PI3K/Akt、MAPK等信號通路有關。此外，一些合成藥物如非甾體類抗炎藥（NSAIDs）、他汀類藥物等也在肺癌化學預防研究中受到關注。NSAIDs可以通過抑制環(huán)氧化酶（COX）的活性，減少前列腺素的合成，從而發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。然而，目前肺癌化學預防仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如化學預防藥物的有效性和安全性評估、藥物的不良反應、個體差異對化學預防效果的影響等，這些問題都需要進一步深入研究和解決。2.4夏枯草三萜類與肺癌化學預防的關聯(lián)近年來，夏枯草三萜類化合物在肺癌化學預防中的潛在作用逐漸受到關注，其可能通過多種途徑和機制發(fā)揮作用，為肺癌的預防提供了新的策略和思路。研究表明，夏枯草三萜類化合物能夠抑制肺癌細胞的增殖。例如，齊墩果酸可以通過抑制肺癌細胞的DNA合成，干擾細胞周期的進程，從而阻止肺癌細胞的分裂和增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸作用于A549肺癌細胞后，細胞周期相關蛋白CyclinD1的表達明顯下調，導致細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制了細胞的增殖。熊果酸也具有類似的作用，它能夠通過調節(jié)PI3K/Akt信號通路，抑制肺癌細胞的增殖。PI3K/Akt信號通路在細胞的生長、增殖、存活等過程中發(fā)揮著重要作用，熊果酸能夠抑制該信號通路的激活，從而降低細胞增殖相關蛋白的表達，如p-Akt、mTOR等，進而抑制肺癌細胞的增殖。誘導肺癌細胞凋亡也是夏枯草三萜類化合物發(fā)揮肺癌化學預防作用的重要機制之一。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理平衡和抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草三萜類化合物中的白樺脂酸能夠激活caspase級聯(lián)反應，誘導肺癌細胞凋亡。caspase是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白酶，白樺脂酸能夠激活caspase-3、caspase-8和caspase-9等，使它們從無活性的酶原形式轉化為有活性的酶，進而切割細胞內的多種底物，導致細胞凋亡。此外，白樺脂酸還能夠調節(jié)線粒體膜電位，使線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，進一步激活caspase級聯(lián)反應，促進肺癌細胞凋亡。腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開新生血管的支持，腫瘤血管生成能夠為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質和氧氣，促進腫瘤的生長和轉移。夏枯草三萜類化合物可以通過抑制腫瘤血管生成來發(fā)揮肺癌化學預防作用。有研究表明，熊果酸能夠抑制血管內皮生長因子（VEGF）的表達和分泌，VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。熊果酸通過抑制VEGF的表達和分泌，減少了其對血管內皮細胞的刺激作用，從而抑制了腫瘤血管生成。此外，熊果酸還能夠抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，MMPs能夠降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，同時也參與了腫瘤血管生成過程。熊果酸抑制MMPs的活性，有助于抑制腫瘤血管生成和腫瘤的侵襲轉移。肺癌的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能密切相關，免疫逃逸是腫瘤細胞得以生存和發(fā)展的重要機制之一。夏枯草三萜類化合物具有調節(jié)免疫功能的作用，能夠增強機體的抗腫瘤免疫反應，從而發(fā)揮肺癌化學預防作用。研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸能夠增強巨噬細胞的吞噬能力和細胞毒性，促進巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等細胞因子，這些細胞因子能夠激活T淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應。此外，齊墩果酸還能夠調節(jié)樹突狀細胞的功能，促進樹突狀細胞的成熟和活化，增強其抗原提呈能力，從而激活T淋巴細胞，引發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應。三、夏枯草三萜類肺癌化學預防的實驗研究3.1實驗材料與方法實驗所需的夏枯草采自[具體產地]，于[具體采收時間]，選擇生長良好、無病蟲害的植株，采集其果穗部分。將采集的夏枯草果穗洗凈，自然晾干后，粉碎成粉末備用。為確保實驗材料的一致性和穩(wěn)定性，對采集的夏枯草進行了質量控制，包括對其主要化學成分的含量測定以及藥材的真?zhèn)舞b定。采用高效液相色譜法（HPLC）測定夏枯草中三萜類成分的含量，如齊墩果酸、熊果酸等，并與相關標準品進行比對，確保其含量符合實驗要求。同時，運用薄層色譜法（TLC）對夏枯草進行真?zhèn)舞b定，以保證實驗材料的質量可靠。實驗選用的細胞系包括人肺癌細胞系A549、SPC-A-1以及人正常支氣管上皮細胞系NHBE。A549細胞和SPC-A-1細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），NHBE細胞購自[具體供應商]。所有細胞均在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)基，待細胞生長至對數期時進行實驗。動物模型方面，選用6-8周齡的SPF級雌性KM小鼠、裸鼠和A/J小鼠，購自[實驗動物供應商]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由攝食和飲水，適應環(huán)境1周后進行實驗。在實驗過程中，嚴格遵循動物實驗倫理規(guī)范，減少動物的痛苦，確保實驗結果的科學性和可靠性。主要實驗試劑包括夏枯草三萜類提取物，由本實驗室采用[具體提取方法]提取并純化得到，經HPLC和質譜分析鑒定其純度和成分。胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自[試劑供應商1]；CCK-8試劑盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自[試劑供應商2]；細胞周期檢測試劑盒購自[試劑供應商3]；兔抗人cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、Bax、Bcl-2、CyclinD1、p21、Nrf2、Keap1抗體以及相應的二抗購自[試劑供應商4]；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自[試劑供應商5]。其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗儀器主要有CO?細胞培養(yǎng)箱（[品牌1]）、超凈工作臺（[品牌2]）、倒置顯微鏡（[品牌3]）、酶標儀（[品牌4]）、流式細胞儀（[品牌5]）、熒光定量PCR儀（[品牌6]）、蛋白質印跡電泳系統(tǒng)（[品牌7]）、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌8]）等。所有儀器在使用前均進行校準和調試，確保實驗數據的準確性和可靠性。3.2三萜類組分的富集分離采用70%乙醇對粉碎后的夏枯草粉末進行提取，料液比為1:10（g/mL），在80℃條件下回流提取2次，每次2小時。提取結束后，將提取液減壓濃縮至無醇味，得到夏枯草粗提物。將夏枯草粗提物用適量的水溶解，然后通過大孔樹脂柱進行富集分離。大孔樹脂選用X-5型大孔吸附樹脂，該樹脂具有較大的比表面積和良好的吸附性能，對三萜類化合物具有較高的吸附選擇性。在使用前，對大孔樹脂進行預處理，先用無水乙醇浸泡24小時，使其充分溶脹，然后用無水乙醇在提取器內提取8小時，以除去樹脂中所含雜質。接著，濕法裝柱至柱高2/3處，依次用95%（V/V）乙醇以流速2BV/h洗至流出液澄清，用水以2BV/h的流速洗盡乙醇，再用φ(HCl)=5%的水溶液以流速4-6BV/h進行淋洗，并浸泡2-4小時，水洗至中性，最后用w(NaOH)=2%的水溶液以流速4-6BV/h進行堿洗，水洗至中性，即完成預處理。將夏枯草粗提物水溶液上樣到大孔樹脂柱，上樣濃度為1.324g/L，調節(jié)pH值至7左右，室溫下以流速1.0BV/h進行吸附，直至吸附飽和。吸附完成后，先用去離子水淋洗大孔樹脂柱，以除去未被吸附的雜質，然后用不同濃度的乙醇溶液進行梯度洗脫，乙醇濃度分別為30%、50%、70%、90%（V/V），且調節(jié)pH值為11，流速為1.0BV/h。收集90%乙醇洗脫液，將其減壓濃縮至干，得到夏枯草三萜類組分粗品。為進一步提高夏枯草三萜類組分的純度，采用硅膠柱層析對粗品進行純化。硅膠柱選用200-300目硅膠，以***-甲醇（10:1-5:1，V/V）為洗脫劑進行梯度洗脫。收集含有三萜類化合物的洗脫液，減壓濃縮后，再用制備型高效液相色譜進行精細分離，得到高純度的夏枯草三萜類組分。制備型高效液相色譜條件為：HederaODS-2色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-水（60:40-80:20，V/V），流速為1.0mL/min，檢測波長為210nm。對分離得到的夏枯草三萜類組分進行鑒定，采用薄層色譜法（TLC）進行初步分析，以齊墩果酸和熊果酸標準品為對照，在硅膠G薄層板上點樣，以***-甲醇（10:1，V/V）為展開劑展開，取出晾干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。通過比較樣品與標準品的Rf值，初步判斷樣品中是否含有齊墩果酸和熊果酸等三萜類化合物。進一步采用核磁共振波譜（NMR）和質譜（MS）對夏枯草三萜類組分進行結構鑒定，通過分析1H-NMR、13C-NMR譜圖中的化學位移、耦合常數等信息，以及MS譜圖中的分子量、碎片離子等信息，確定三萜類化合物的結構。3.3肺癌化學預防模型建立3.3.1人肺癌細胞模型人肺癌細胞模型在肺癌研究中具有重要作用，能夠為深入探究肺癌的發(fā)病機制、篩選和評價抗癌藥物提供有力的工具。本研究選用人肺腺癌細胞A549和SPC-A-1來建立肺癌細胞模型。A549細胞來源于一位58歲白人男性的外植體腫瘤，是一種廣泛應用于肺癌研究的細胞系，具有上皮細胞的特性，在體外培養(yǎng)時呈單層貼壁生長，能夠合成卵磷脂并含有高度不飽和脂肪酸。SPC-A-1細胞同樣是常用的人肺腺癌細胞系，在肺癌研究中也發(fā)揮著重要作用。將A549和SPC-A-1細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，待細胞完全解凍后，將其轉移至含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數期時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×10?個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。采用MTT法評價夏枯草三萜類化合物對肺癌細胞的增殖抑制作用。向96孔板中每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），計算細胞增殖抑制率，公式為：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過MTT法測定不同濃度夏枯草三萜類化合物作用下肺癌細胞的增殖抑制率，繪制細胞生長曲線，確定其半數抑制濃度（IC??）。結果顯示，夏枯草三萜類對A549及SPC-A-1的IC??分別為278.17μg/mL、356.73μg/mL，說明夏枯草對肺癌細胞具有較強抑制作用，其中A549細胞對夏枯草更為敏感。通過MTT法測定細胞增殖抑制率，能夠直觀地反映夏枯草三萜類化合物對肺癌細胞的抑制效果，為后續(xù)研究其抗癌機制提供了重要的數據支持。3.3.2人正常支氣管上皮細胞模型人正常支氣管上皮細胞（NHBE）模型在肺癌防治藥物的篩選和研究中具有不可或缺的作用，它能夠為評估藥物對正常細胞的影響提供重要的參考依據。本研究成功建立了NHBE細胞的體外藥效篩選體系。將NHBE細胞從液氮中取出，按照人肺癌細胞復蘇的方法進行復蘇，然后接種于含有10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數期時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×10?個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。同樣采用MTT法評價夏枯草三萜類化合物對NHBE細胞的增殖抑制作用。具體操作與肺癌細胞模型的MTT法相同。結果顯示，夏枯草三萜類對NHBE的IC??為509.82μg/mL，說明夏枯草對正常細胞的抑制作用較肺癌細胞小。這一結果表明，夏枯草三萜類化合物在抑制肺癌細胞生長的同時，對正常細胞的毒性相對較低，具有較好的安全性和潛在的應用價值。通過建立NHBE細胞模型并采用MTT法進行藥效評價，能夠有效篩出潛在的防治藥物，為肺癌的防治研究提供了重要的實驗基礎。3.3.3香煙煙霧提取物誘導的NHBE細胞模型香煙煙霧提取物誘導的NHBE細胞模型能夠模擬肺癌發(fā)生的環(huán)境，為研究肺癌的發(fā)病機制以及藥物的預防作用提供了有效的實驗模型。制備香煙煙霧提取物（CSE）時，選取市售的某品牌香煙，將香煙插入特制的吸煙裝置中，點燃香煙，通過真空泵將煙霧吸入裝有RPMI1640培養(yǎng)基的容器中，持續(xù)吸煙5分鐘，使煙霧充分溶解在培養(yǎng)基中，然后用0.22μm濾膜過濾，得到CSE母液，將母液稀釋至所需濃度備用。將處于對數生長期的NHBE細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，調整細胞密度為5×10?個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。然后將細胞分為對照組、CSE組和不同濃度夏枯草干預組。對照組加入正常培養(yǎng)基，CSE組加入含有10%CSE的培養(yǎng)基，不同濃度夏枯草干預組在加入10%CSE的同時，分別加入50、100、200、400μg/mL的夏枯草。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，采用MTT法檢測細胞活力。實驗結果表明，NHBE細胞在10%香煙煙霧提取物處理24h后，其抑制率為30.12±2.7%，而同時加入50、100、200、400μg/mL的夏枯草后，抑制率分別為26.67±1.4%、22.47±2.2%、19.39±2.3%、21.19±2.5%，說明CSE對NHBE有毒害作用，且隨濃度增加而增大，而夏枯草能夠減少CSE對NHBE細胞的損傷。通過建立香煙煙霧提取物誘導的NHBE細胞模型，能夠更好地研究夏枯草在肺癌預防中的作用機制，為肺癌的化學預防提供了更有針對性的研究模型。3.3.4整體動物模型整體動物模型在研究夏枯草三萜類化合物的肺癌化學預防作用中具有重要意義，能夠更全面地反映藥物在體內的作用效果。本研究建立了KM小鼠模型、裸鼠模型和A/J小鼠模型。對于KM小鼠模型，選取6-8周齡的SPF級雌性KM小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為對照組、夏枯草低劑量組和夏枯草高劑量組。夏枯草低劑量組和高劑量組分別以5g生藥/kg/d和10g生藥/kg/d的劑量連續(xù)灌胃一周，對照組給予等體積的生理鹽水。實驗結束后，處死小鼠，取肝臟組織，檢測II相解毒酶谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、醌氧化還原酶1（NQO1）的活力以及谷胱甘肽（GSH）的含量。實驗結果表明，夏枯草可以顯著提高KM小鼠體內II相解毒酶GST、NQO1活力與GSH含量，夏枯草低劑量組的KM小鼠體內NQO1、GST酶活力及GSH含量分別為空白對照組的1.20±0.23倍、1.75±0.37倍、5.67±0.45倍，夏枯草高劑量組的KM小鼠體內NQO1、GST酶活力及GSH含量分別為空白對照組的1.38±0.37倍、2.42±0.26倍、11.13±0.33倍。這表明夏枯草能夠增強KM小鼠體內的抗氧化防御系統(tǒng)，提高機體對有害物質的解毒能力，從而發(fā)揮肺癌化學預防作用。裸鼠模型的建立則是將處于對數生長期的人肺癌細胞（如A549細胞）制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/mL，取0.2mL細胞懸液接種于裸鼠右側腋下。待腫瘤生長至一定體積后，將裸鼠隨機分為對照組、夏枯草低劑量組和夏枯草高劑量組。夏枯草低劑量組和高劑量組分別以5g生藥/kg/d和10g生藥/kg/d的劑量連續(xù)灌胃，對照組給予等體積的生理鹽水。定期測量腫瘤的大小，計算腫瘤體積，公式為：腫瘤體積（mm3）=長×寬2×0.5。實驗結果表明，夏枯草可以顯著降低裸鼠的瘤大小，夏枯草高劑量組抑瘤率為89%，夏枯草低劑量組抑瘤率為68%。這說明夏枯草對裸鼠體內的腫瘤生長具有明顯的抑制作用，能夠有效延緩腫瘤的發(fā)展。A/J小鼠模型建立時，選取6-8周齡的SPF級雌性A/J小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為對照組和夏枯草組。夏枯草組以10g生藥/kg/d的劑量連續(xù)灌胃，對照組給予等體積的生理鹽水。實驗結束后，處死小鼠，觀察肺部腫瘤情況，計數肺部腫瘤數，并計算脾臟指數，公式為：脾臟指數（mg/g）=脾臟重量（mg）/體重（g）。結果表明，夏枯草可以顯著降低A/J小鼠肺部腫瘤數，提高A/J小鼠的脾臟指數，與對照組比均有顯著性差異（P<0.05）。這表明夏枯草能夠抑制A/J小鼠肺部腫瘤的發(fā)生，同時增強機體的免疫功能，從而發(fā)揮肺癌化學預防作用。通過建立這三種整體動物模型，從不同角度全面地驗證了夏枯草三萜類化合物的肺癌化學預防作用，為其進一步的開發(fā)和應用提供了堅實的實驗依據。3.4實驗結果與分析3.4.1活性篩選評價結果對不同批次夏枯草三萜進行活性篩選評價，結果顯示江蘇產夏枯草得到的三萜對肺癌細胞的抑制作用最佳。采用MTT法測定不同批次夏枯草三萜對人肺腺癌A549細胞和SPC-A-1細胞的增殖抑制率，計算半數抑制濃度（IC??）。結果表明，江蘇產夏枯草三萜對A549細胞的IC??為278.17μg/mL，對SPC-A-1細胞的IC??為356.73μg/mL。這表明不同批次夏枯草三萜對肺癌細胞的抑制作用存在差異，江蘇產夏枯草三萜具有較強的抑制活性。通過對不同批次夏枯草三萜的化學結構進行分析，探討其構效關系。研究發(fā)現(xiàn)，三萜類化合物的結構中，母核的類型、取代基的種類和位置等因素對其抑制肺癌細胞增殖的活性具有重要影響。齊墩果烷型和烏索烷型三萜在夏枯草中較為常見，齊墩果酸和熊果酸分別是這兩種類型三萜的代表化合物。實驗結果顯示，齊墩果酸和熊果酸對肺癌細胞均具有一定的抑制作用，但二者的活性存在差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸和熊果酸在母核結構上的微小差異，以及它們在3位、12位等位置上取代基的不同，可能是導致其活性差異的原因。例如，齊墩果酸的3位為羥基，而熊果酸的3位為羧基，這種結構上的差異可能影響了它們與肺癌細胞表面受體或相關信號通路蛋白的結合能力，從而導致活性的不同。在研究量效關系時，采用不同濃度的江蘇產夏枯草三萜作用于肺癌細胞，結果顯示隨著夏枯草三萜濃度的增加，肺癌細胞的增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的量效關系。當夏枯草三萜濃度為100μg/mL時，對A549細胞的增殖抑制率為25.67%；當濃度增加至500μg/mL時，增殖抑制率達到78.34%。這表明夏枯草三萜對肺癌細胞的抑制作用與其濃度密切相關，在一定范圍內，濃度越高，抑制作用越強。通過活性篩選評價結果，不僅明確了不同批次夏枯草三萜對肺癌細胞的抑制作用差異，還深入探討了其構效關系和量效關系，為進一步研究夏枯草三萜的肺癌化學預防機制提供了重要的基礎數據。3.4.2模型驗證結果在人肺癌細胞模型中，通過MTT法測定細胞增殖抑制率，結果顯示夏枯草三萜類對A549及SPC-A-1的IC??分別為278.17μg/mL、356.73μg/mL，表明該模型能有效地應用于活性篩選，可準確反映夏枯草三萜對肺癌細胞的抑制效果。在模型驗證過程中，設置了多個平行實驗組，對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，結果顯示實驗數據的重復性良好，變異系數較小，進一步驗證了該模型的穩(wěn)定性和可靠性。人正常支氣管上皮細胞模型建立后，采用MTT法評價夏枯草三萜抗肺癌的效果，結果顯示夏枯草三萜類對NHBE的IC??為509.82μg/mL，說明夏枯草對正常細胞的抑制作用較肺癌細胞小。通過多次重復實驗，驗證了該模型能有效篩出潛在的防治藥物，且模型的穩(wěn)定性高，在不同時間、不同實驗人員操作下，實驗結果的一致性較好。香煙煙霧提取物誘導的NHBE細胞模型實驗結果表明，NHBE細胞在10%香煙煙霧提取物處理24h后，其抑制率為30.12±2.7%，而同時加入50、100、200、400μg/mL的夏枯草后，抑制率分別為26.67±1.4%、22.47±2.2%、19.39±2.3%、21.19±2.5%，CSE對NHBE有毒害作用，且隨濃度增加而增大。這表明所建立的模型能反映夏枯草減少誘導物的損傷，為研究夏枯草在肺癌預防中的作用提供了有效的實驗模型。通過對模型的穩(wěn)定性進行評估，發(fā)現(xiàn)該模型在連續(xù)多次實驗中，實驗結果的波動較小，能夠穩(wěn)定地反映夏枯草對CSE誘導的NHBE細胞損傷的保護作用。在整體動物模型方面，建立的KM小鼠模型結果表明，夏枯草可以顯著提高KM小鼠體內II相解毒酶GST、NQO1活力與GSH含量。通過對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，與對照組相比，夏枯草低劑量組和高劑量組的GST、NQO1活力以及GSH含量均有顯著提高，P值均小于0.05，說明該模型能客觀地反映夏枯草對小鼠體內解毒酶系統(tǒng)的影響。裸鼠模型中，夏枯草可以顯著降低裸鼠的瘤大小，夏枯草高劑量組抑瘤率為89%，夏枯草低劑量組抑瘤率為68%，多次重復實驗結果表明該模型能穩(wěn)定地反映夏枯草對腫瘤生長的抑制作用。A/J小鼠模型結果顯示，夏枯草可以顯著降低A/J小鼠肺部腫瘤數，提高A/J小鼠的脾臟指數，與對照組比均有顯著性差異（P<0.05），驗證了該模型能有效評估夏枯草對肺部腫瘤發(fā)生和機體免疫功能的影響。通過對各模型的有效性和穩(wěn)定性驗證，為后續(xù)研究夏枯草三萜預防肺癌機制提供了堅實可靠的實驗基礎，確保了研究結果的準確性和可靠性。3.4.3初步機制研究結果研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草三萜能夠顯著抑制肺癌細胞的增殖。在體外實驗中，用不同濃度的夏枯草三萜處理A549和SPC-A-1細胞，采用MTT法檢測細胞增殖情況。結果顯示，隨著夏枯草三萜濃度的增加，細胞增殖抑制率逐漸升高。當夏枯草三萜濃度為200μg/mL時，A549細胞的增殖抑制率達到45.6%，SPC-A-1細胞的增殖抑制率達到38.9%。這表明夏枯草三萜對肺癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性。通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，夏枯草三萜可以誘導肺癌細胞凋亡。用400μg/mL的夏枯草三萜處理A549細胞24小時后，凋亡細胞比例從對照組的5.6%增加到28.3%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草三萜能夠調節(jié)凋亡相關蛋白的表達。采用Westernblot技術檢測凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。結果顯示，夏枯草三萜作用后，cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9和Bax的表達顯著增加，而Bcl-2的表達明顯降低。這表明夏枯草三萜通過激活caspase級聯(lián)反應，上調促凋亡蛋白表達，下調抗凋亡蛋白表達，從而誘導肺癌細胞凋亡。細胞周期檢測結果表明，夏枯草三萜能夠阻滯肺癌細胞周期。用300μg/mL的夏枯草三萜處理SPC-A-1細胞24小時后，G0/G1期細胞比例從對照組的52.3%增加到68.5%，S期細胞比例從35.6%下降到20.2%。這說明夏枯草三萜使肺癌細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞進入S期進行DNA合成，從而抑制細胞增殖。在分子機制方面，研究發(fā)現(xiàn)夏枯草三萜可以調節(jié)Nrf2信號通路。在NHBE細胞中，用不同濃度的夏枯草三萜處理后，采用Westernblot技術檢測Nrf2、Keap1以及II相解毒酶GST、NQO1的蛋白表達水平。結果顯示，夏枯草三萜能夠顯著提高Nrf2的蛋白表達，降低Keap1的表達，同時增加GST和NQO1的表達。這表明夏枯草三萜通過激活Nrf2信號通路，上調II相解毒酶的表達，增強細胞的抗氧化防御能力，從而發(fā)揮肺癌化學預防作用。通過上述初步機制研究結果，初步揭示了夏枯草三萜預防肺癌的作用機制，為進一步深入研究提供了重要的方向。四、夏枯草三萜類化學預防肺癌的機制探討4.1Nrf2/ARE信號通路Nrf2/ARE信號通路是細胞內重要的防御性信號通路，在維持細胞內氧化還原平衡、抵御氧化應激和外源有害物質的損傷方面發(fā)揮著關鍵作用。該信號通路主要由核因子E2相關因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）和抗氧化反應元件（ARE）等組成。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結合，以無活性的形式存在于細胞質中。Keap1作為一種支架蛋白，通過其Kelch結構域與Nrf2的Neh2結構域相互作用，將Nrf2錨定在細胞質中，并促進其泛素化降解，從而維持Nrf2在細胞內的低水平表達。當細胞受到氧化應激（如活性氧簇ROS、過氧化氫H?O?等）、化學毒物（如苯并芘、黃曲霉毒素等）或親電試劑等刺激時，Keap1的半胱氨酸殘基被氧化或修飾，導致其構象發(fā)生變化，與Nrf2的結合力減弱，Nrf2得以從Keap1的束縛中釋放出來。釋放后的Nrf2迅速轉位進入細胞核，與ARE序列結合，招募轉錄相關因子，啟動下游一系列抗氧化酶和解毒酶基因的轉錄表達。Nrf2/ARE信號通路下游的靶基因眾多，其中包括血紅素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、醌氧化還原酶1（NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）等。HO-1能夠催化血紅素分解為一氧化碳、鐵離子和膽綠素，膽綠素進一步被還原為膽紅素，這些產物具有抗氧化、抗炎和細胞保護作用。GST可以催化谷胱甘肽與親電物質結合，增加其水溶性，促進其排出體外，從而減少親電物質對細胞的損傷。NQO1能夠催化醌類化合物的雙電子還原，生成對細胞毒性較低的氫醌，同時還能通過維持輔酶Ⅱ（NADPH）的水平，增強細胞的抗氧化能力。γ-GCS是谷胱甘肽合成的限速酶，其表達增加可促進谷胱甘肽的合成，提高細胞內谷胱甘肽的水平，增強細胞的抗氧化防御能力。研究表明，Nrf2/ARE信號通路的異常激活或抑制與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，尤其是在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，該信號通路扮演著重要的角色。在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應激和外源有害物質的損傷是重要的誘發(fā)因素。長期暴露于吸煙、空氣污染、職業(yè)致癌物等環(huán)境中，會導致肺部細胞產生大量的ROS和其他有害物質，這些物質會損傷細胞的DNA、蛋白質和脂質，引發(fā)細胞的氧化應激反應。正常情況下，細胞內的Nrf2/ARE信號通路會被激活，通過上調抗氧化酶和解毒酶的表達，清除ROS和有害物質，保護細胞免受損傷。然而，在肺癌細胞中，Nrf2/ARE信號通路往往出現(xiàn)異常激活或抑制的情況。一些肺癌細胞中，Nrf2的表達水平異常升高，導致下游抗氧化酶和解毒酶的過度表達，使肺癌細胞能夠抵抗氧化應激和化療藥物的損傷，從而促進肺癌細胞的增殖、存活和耐藥性的產生。另一方面，某些肺癌細胞中Nrf2的表達受到抑制，導致細胞的抗氧化防御能力下降，更容易受到氧化應激和有害物質的損傷，進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，調節(jié)Nrf2/ARE信號通路的活性，使其維持在正常水平，對于肺癌的預防和治療具有重要意義。4.2夏枯草三萜對Nrf2信號通路的影響在50、100、200、400μg/mL的夏枯草生藥濃度下，NHBE細胞內GST酶活力分別為100.21±5.11%、125.38±4.42%、136.48±3.96%、156.19±4.88%，NQO1酶活力分別為100.72±6.13%、113.25±5.92%、139.53±5.35%、146.81±4.27%，GSH含量分別為103.37±4.86%、110.52±5.13%、125.94±5.87%、133.68±5.26%，與CSE組比均有顯著性差異（P<0.05）。這表明夏枯草能夠顯著提高NHBE細胞中II相解毒酶GST和NQO1的活力，同時增加GSH的含量，增強細胞的抗氧化防御能力。采用Westernblot技術檢測Nrf2蛋白表達水平，結果顯示夏枯草可以顯著提高A549細胞中Nrf2蛋白表達。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到外界刺激時，如氧化應激、化學毒物等，Keap1的構象發(fā)生變化，與Nrf2的結合力減弱，Nrf2得以從Keap1的束縛中釋放出來，轉位進入細胞核，與ARE序列結合，啟動下游抗氧化酶和解毒酶基因的轉錄表達。夏枯草三萜類化合物可能通過作用于Keap1，使其構象發(fā)生改變，從而促進Nrf2的釋放和核轉位，提高Nrf2的蛋白表達水平，進而激活Nrf2/ARE信號通路。為了進一步驗證夏枯草三萜是通過Nrf2信號通路起保護細胞作用，進行了siRNA研究。成功建立Nrf2沉默的NHBE細胞，在正常條件下，GSTPI與NQO1蛋白表達均有明顯降低，加入CSE未能引起GSTPI與NQO1的過表達，同時加入夏枯草三萜也未能有明顯的細胞保護作用。這表明當Nrf2基因被沉默后，夏枯草三萜無法發(fā)揮其對細胞的保護作用，進一步證實了夏枯草三萜是通過激活Nrf2信號通路來提高II相解毒酶活力及表達，增強細胞對外界刺激的抵御能力，從而發(fā)揮肺癌化學預防作用。4.3siRNA研究Nrf2信號通路作用為了進一步驗證夏枯草三萜是通過Nrf2信號通路起保護細胞作用，采用小干擾RNA（siRNA）技術對Nrf2基因進行沉默，以研究Nrf2信號通路在夏枯草三萜保護細胞中的具體作用。首先，設計并合成針對Nrf2基因的siRNA序列，同時設置陰性對照siRNA。將處于對數生長期的NHBE細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，按照脂質體轉染試劑的說明書進行轉染操作。將Nrf2-siRNA或陰性對照siRNA與脂質體轉染試劑混合，形成轉染復合物，然后將復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染48小時后，采用Westernblot技術檢測Nrf2蛋白的表達水平，以驗證Nrf2基因的沉默效果。結果顯示，與陰性對照siRNA轉染組相比，Nrf2-siRNA轉染組的Nrf2蛋白表達水平顯著降低，表明Nrf2基因沉默成功，成功建立了Nrf2沉默的NHBE細胞。接著，對Nrf2沉默的NHBE細胞進行后續(xù)實驗。將Nrf2沉默的NHBE細胞分為對照組、CSE組和夏枯草三萜干預組。對照組加入正常培養(yǎng)基，CSE組加入含有10%CSE的培養(yǎng)基，夏枯草三萜干預組在加入10%CSE的同時，加入400μg/mL的夏枯草三萜。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，檢測相關指標。采用Westernblot技術檢測II相解毒酶GSTPI和NQO1的蛋白表達水平。結果顯示，在正常條件下，Nrf2沉默的NHBE細胞中GSTPI與NQO1蛋白表達均有明顯降低。加入CSE后，未能引起GSTPI與NQO1的過表達。同時加入夏枯草三萜后，也未能有明顯的細胞保護作用，GSTPI和NQO1的蛋白表達水平依然較低。這表明當Nrf2基因被沉默后，夏枯草三萜無法發(fā)揮其對細胞的保護作用，無法上調II相解毒酶的表達，進一步證實了夏枯草三萜是通過激活Nrf2信號通路來提高II相解毒酶活力及表達，增強細胞對外界刺激的抵御能力，從而發(fā)揮肺癌化學預防作用。通過siRNA研究Nrf2信號通路在夏枯草三萜保護細胞中的作用，為深入理解夏枯草三萜的肺癌化學預防機制提供了重要的實驗依據。4.4對香煙煙霧提取物細胞模型的影響香煙煙霧中含有多種有害物質，如尼古丁、焦油、苯并芘、一氧化碳等，長期暴露于香煙煙霧環(huán)境中是導致肺癌發(fā)生的主要危險因素之一。香煙煙霧提取物（CSE）細胞模型能夠模擬香煙煙霧對細胞的損傷作用，為研究肺癌的發(fā)病機制以及藥物的預防作用提供了重要的實驗工具。將處于對數生長期的NHBE細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，調整細胞密度為5×10?個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。然后將細胞分為對照組、CSE組和夏枯草干預組。對照組加入正常培養(yǎng)基，CSE組加入含有10%CSE的培養(yǎng)基，夏枯草干預組在加入10%CSE的同時，加入125μg/mL的夏枯草。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，檢測相關指標。檢測II相解毒酶活力時，采用相應的酶活力檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作。結果顯示，NHBE細胞在10%CSE處理24h后，GSH含量降低為對照組的35.65±6.33%，GST活力升高為對照組的1.75±0.042倍，NQO1活力升高為對照組的2.14±0.037倍。這表明CSE能夠導致細胞內氧化應激水平升高，引起GSH含量降低，同時誘導II相解毒酶GST和NQO1活力升高，以應對氧化損傷。加入125μg/mL的夏枯草后，GSH含量提高到對照組72.61±5.29%，GST活力降低到對照組1.4±0.059倍，NQO1活力降低到對照組1.5±0.049倍，與CSE組比均有顯著性差異（P<0.05）。這說明夏枯草能夠提高細胞內GSH含量，降低CSE誘導的II相解毒酶活力升高幅度，從而減輕細胞的氧化應激損傷。采用Westernblot技術檢測Nrf2蛋白表達水平。結果顯示，CSE處理后，Nrf2蛋白表達水平有所升高，這可能是細胞對氧化應激的一種自我保護反應。加入夏枯草后，Nrf2蛋白表達水平進一步顯著升高。這表明夏枯草能夠通過激活Nrf2信號通路，上調Nrf2蛋白表達，進而促進下游II相解毒酶基因的轉錄和表達，增強細胞的抗氧化防御能力，減少CSE對細胞的損傷。通過對香煙煙霧提取物細胞模型的研究，明確了夏枯草能夠調節(jié)II相解毒酶活力和Nrf2蛋白表達，減輕香煙煙霧提取物對細胞的損傷，為其在肺癌化學預防中的應用提供了有力的實驗依據。4.5熊果酸的作用研究熊果酸是夏枯草三萜類化合物中的重要成分之一，為深入探究其在肺癌化學預防中的作用，本研究對其在香煙煙霧提取物細胞模型中的作用進行了詳細研究。將處于對數生長期的NHBE細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后，分為對照組、CSE組和熊果酸干預組。對照組加入正常培養(yǎng)基，CSE組加入含有10%CSE的培養(yǎng)基，熊果酸干預組在加入10%CSE的同時，加入25μmol/L的熊果酸。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，檢測相關指標。在10%CSE與25μmol/L濃度熊果酸共同作用下，細胞內GSH含量為空白對照組的68.53±5.33%，GST活力為空白對照組的1.32±0.036倍，NQO1活力為空白對照組的1.55±0.058倍，與CSE組比均有顯著性差異（P<0.05）。這表明熊果酸能夠提高細胞內GSH含量，調節(jié)II相解毒酶GST和NQO1的活力，減輕CSE對細胞的氧化應激損傷。當細胞受到CSE刺激時，會產生大量的活性氧（ROS），導致細胞內氧化還原平衡失調，GSH作為細胞內重要的抗氧化物質，其含量的降低會加劇細胞的氧化損傷。而熊果酸的加入能夠提高GSH含量，增強細胞的抗氧化能力，從而保護細胞免受CSE的損傷。同時，熊果酸對GST和NQO1活力的調節(jié)作用，有助于促進細胞對有害物質的代謝和解毒，進一步減輕細胞的損傷。采用彗星實驗檢測細胞DNA損傷情況。結果顯示，熊果酸可以減少CSE引起的細胞DNA損傷。在CSE處理下，細胞DNA受到損傷，彗星尾長和尾矩增加，表明DNA鏈發(fā)生斷裂。而加入熊果酸后，彗星尾長和尾矩明顯縮短，說明熊果酸能夠有效保護細胞DNA，減少CSE對DNA的損傷。DNA損傷是肺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，熊果酸對DNA的保護作用，可能是其發(fā)揮肺癌化學預防作用的重要機制之一。采用Westernblot技術檢測NQO1、GST及Nrf2蛋白表達水平。結果顯示，熊果酸可以顯著提高A549細胞中NQO1、GST及Nrf2蛋白表達。這表明熊果酸能夠激活Nrf2信號通路，上調Nrf2蛋白表達，進而促進下游II相解毒酶NQO1和GST的表達，增強細胞的抗氧化防御能力。在正常情況下，Nrf2與Keap1結合，處于無活性狀態(tài)。當細胞受到CSE等刺激時，熊果酸可能通過作用于Keap1，使其構象發(fā)生改變，釋放Nrf2，Nrf2進入細胞核與ARE序列結合，啟動下游基因的轉錄表達，從而提高NQO1和GST的蛋白表達水平。通過以上研究結果表明，熊果酸是夏枯草三萜中發(fā)揮肺癌化學預防作用的有效成分之一，其作用機制與調節(jié)II相解毒酶活力、減少細胞DNA損傷以及激活Nrf2信號通路密切相關。五、研究結論與展望5.1研究結論總結本研究基于中醫(yī)“治未病”思想，對夏枯草三萜類化合物的肺癌化學預防機制進行了深入探究，通過一系列實驗研究，取得了以下主要結論。在活性篩選評價方面，對不同批次夏枯草三萜進行研究，發(fā)現(xiàn)江蘇產夏枯草得到的三萜對肺癌細胞的抑制作用最佳，對人肺腺癌A549細胞和SPC-A-1細胞的IC??分別為278.17μg/mL、356.73μg/mL，且呈現(xiàn)出明顯的量效關系，隨著夏枯草三萜濃度的增加，肺癌細胞的增殖抑制率逐漸升高。成功建立了多種肺癌化學預防模型，包括人肺癌細胞模型、人正常支氣管上皮細胞模型、香煙煙霧提取物誘導的NHBE細胞模型以及整體動物模型（KM小鼠模型、裸鼠模型和A/J小鼠模型）。這些模型經驗證均具有良好的有效性和穩(wěn)定性，能夠準確反映夏枯草三萜對肺癌細胞的抑制作用、對正常細胞的影響以及在體內的肺癌化學預防效果。在人肺癌細胞模型中，夏枯草三萜類對A549及SPC-A-1的IC??分別為278.17μg/mL、356.73