基于microRNAs的肺結(jié)核精準(zhǔn)診斷模型構(gòu)建與效能評(píng)估一、引言1.1研究背景與意義結(jié)核病是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球約四分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年新增結(jié)核病患者數(shù)量眾多，死亡人數(shù)也居高不下。在中國，結(jié)核病同樣是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，是傳染病中的第二大殺手，發(fā)病人數(shù)居全球第三位。結(jié)核病不僅對(duì)患者個(gè)人的健康造成嚴(yán)重影響，還會(huì)對(duì)家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?；顒?dòng)性肺結(jié)核患者常伴有咳嗽、咳痰、咯血、盜汗、胸悶、疲乏等癥狀，病變部位若在胸膜，還會(huì)出現(xiàn)刺激性咳嗽、胸痛以及呼吸困難；若在氣管支氣管等部位，會(huì)有刺激性咳嗽，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)喘鳴以及呼吸困難。若合并肺外結(jié)核病，會(huì)出現(xiàn)累及臟器的相應(yīng)癥狀，如骨關(guān)節(jié)結(jié)核的畸形和功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核的頭痛和腦膜刺激征、消化系統(tǒng)結(jié)核的交替性腹瀉以及局部壓痛、泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核的無痛性血尿和不孕癥等。這些癥狀不僅降低患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致勞動(dòng)能力喪失，給家庭帶來經(jīng)濟(jì)壓力。同時(shí)，結(jié)核病的治療周期長，費(fèi)用高，加上患者因患病無法工作造成的經(jīng)濟(jì)損失，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來負(fù)面影響。早期準(zhǔn)確診斷結(jié)核病對(duì)于控制疫情傳播、提高治療效果和改善患者預(yù)后至關(guān)重要。早期診斷能夠使患者及時(shí)接受治療，縮短傳染期，減少結(jié)核菌的傳播，降低結(jié)核病的發(fā)病率。而且，早期治療能夠提高治愈率，減少并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者的生活質(zhì)量，降低死亡率。然而，目前臨床上常用的結(jié)核病診斷技術(shù)存在一定的局限性。傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法雖然操作簡單、成本低，但敏感性較低，陽性檢出率僅為20-40%，容易漏診。結(jié)核菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)時(shí)間長，一般需要2-8周，無法滿足臨床快速診斷的需求，在培養(yǎng)過程中還可能出現(xiàn)污染導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。分子生物學(xué)檢測技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）雖然具有較高的敏感性和特異性，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作人員要求較高，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，且檢測成本相對(duì)較高，限制了其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的廣泛應(yīng)用。胸部影像學(xué)檢查如X線和CT，對(duì)于肺結(jié)核的診斷有重要價(jià)值，但在疾病早期或不典型病例中，可能出現(xiàn)漏診或誤診，且CT檢查費(fèi)用較高，對(duì)患者有一定輻射。近年來，微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）作為一種新型的生物標(biāo)志物，在疾病診斷領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。miRNAs是一類長度約為20-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)域互作，參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖和分化等許多重要的生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在結(jié)核病患者體內(nèi)的表達(dá)模式與健康人存在差異，一些miRNAs在結(jié)核分枝桿菌感染后明顯上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，如miR-29a、miR-155和miR-27a等在結(jié)核病患者中表達(dá)水平明顯升高，而miR-150和miR-223等表達(dá)水平顯著下降。這些差異表達(dá)的miRNAs可能與結(jié)核病的發(fā)生、病程和預(yù)后相關(guān)，使其有望成為結(jié)核病診斷的新型生物標(biāo)志物。基于此，本研究旨在通過篩選與肺結(jié)核相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs，構(gòu)建基于miRNAs的肺結(jié)核診斷模型，并評(píng)估其在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值，為肺結(jié)核的早期診斷提供新的方法和依據(jù)，提高肺結(jié)核的診斷準(zhǔn)確性和效率，有助于及時(shí)采取有效的治療措施，控制結(jié)核病的傳播，減輕結(jié)核病對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，國內(nèi)外針對(duì)microRNAs與肺結(jié)核的關(guān)系以及基于其構(gòu)建診斷模型展開了大量研究。在國外，相關(guān)研究起步較早且成果豐碩。一些研究聚焦于尋找與肺結(jié)核緊密相關(guān)的差異表達(dá)microRNAs。如DanielEA等人通過系統(tǒng)回顧和薈萃分析，對(duì)2000-2020年發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索分析，發(fā)現(xiàn)miR-29、miR-31、miR-125b、miR146a和miR-155在結(jié)核病患者中呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異，這些miRNA的總體敏感度、特異度和診斷優(yōu)勢比（DOR）分別為87.9%（81.7～92.2）、81.2%（74.5～86.5）和43.1（20.3～91.3），其中miR-31的診斷準(zhǔn)確性最高，敏感度為96%（89.7～98.5），特異度為89%（81.2～93.8），DOR為345.9（90.2～1326.3），符合結(jié)核病診斷的最低目標(biāo)產(chǎn)品參數(shù)要求，這表明這些microRNAs具有作為結(jié)核病診斷生物標(biāo)志物的潛力。在診斷模型構(gòu)建方面，國外也有不少探索。部分研究嘗試將多種差異表達(dá)的microRNAs進(jìn)行組合，運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建診斷模型。例如，有研究運(yùn)用關(guān)聯(lián)向量機(jī)和logistic分類模型，基于個(gè)體血清中的15種microRNAs來區(qū)分健康人和肺結(jié)核患者，其診斷精確度分別為82%和77%；考慮到種族因素后，歐洲組10種microRNAs的診斷精確度分別為83%和81%，非洲組12種microRNAs的診斷精確度分別達(dá)到95%和100%，展示出不同種族背景下診斷模型的表現(xiàn)差異，為進(jìn)一步優(yōu)化模型提供了方向。國內(nèi)的研究也取得了重要進(jìn)展。在microRNAs與肺結(jié)核關(guān)系的研究上，許多團(tuán)隊(duì)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了多種microRNAs在肺結(jié)核患者體內(nèi)的表達(dá)變化。Qi等人利用低密度陣列發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，97種microRNAs在肺結(jié)核患者血清中差異表達(dá)，其中90種表達(dá)上調(diào)，7種表達(dá)下調(diào)；經(jīng)qRT-PCR和受試者工作特征（ROC）曲線證實(shí)，血清中miR-361-5p、miR-576-3p和miR-889可用于診斷肺結(jié)核和健康人，曲線下面積（AUC）為0.711-0.848，多重logistic回歸分析顯示聯(lián)合這三種microRNAs可增強(qiáng)診斷能力，凸顯了聯(lián)合檢測的優(yōu)勢。在診斷模型構(gòu)建方面，國內(nèi)研究也不斷創(chuàng)新。呂正煊等人選取昆明市第三人民醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者，以Logistic回歸模型篩選影響患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，發(fā)現(xiàn)入院A-PACHEⅡ評(píng)分、合并慢阻肺、血清白蛋白、miR-23a-3p、miR-125b、miR-155為肺結(jié)核患者預(yù)后不良的影響因素，基于此建立Nomogram預(yù)測模型，該模型在建模隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中的AUC分別為0.859（95%CI：0.800～0.918）和0.849（95%CI：0.787～0.912），區(qū)分度良好，校準(zhǔn)曲線和決策曲線也表明模型具有較好的一致性和臨床實(shí)用性，為肺結(jié)核預(yù)后預(yù)測提供了新的有效工具。盡管國內(nèi)外在這一領(lǐng)域取得了諸多成果，但仍存在一些不足。一方面，目前已發(fā)現(xiàn)的與肺結(jié)核相關(guān)的microRNAs眾多，但缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和大規(guī)模的驗(yàn)證，導(dǎo)致不同研究結(jié)果之間存在一定差異，難以直接應(yīng)用于臨床診斷。另一方面，現(xiàn)有的診斷模型大多在小樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，其在大規(guī)模人群中的準(zhǔn)確性和可靠性有待進(jìn)一步驗(yàn)證；且模型的構(gòu)建方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)尚未統(tǒng)一，不利于不同模型之間的比較和推廣。此外，對(duì)于microRNAs在肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用機(jī)制研究還不夠深入，限制了基于其的診斷技術(shù)和治療方法的進(jìn)一步發(fā)展。本研究將針對(duì)這些不足，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，篩選出穩(wěn)定且特異性高的microRNAs組合，構(gòu)建更為準(zhǔn)確可靠的肺結(jié)核診斷模型，并深入探討其診斷價(jià)值，為肺結(jié)核的臨床診斷提供更有力的支持。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過系統(tǒng)篩選與肺結(jié)核相關(guān)的差異表達(dá)microRNAs，構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型，并全面評(píng)估該模型在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值，具體研究目標(biāo)與內(nèi)容如下：篩選差異表達(dá)的microRNAs：收集肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者的血液樣本，運(yùn)用高通量測序技術(shù)或?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測樣本中microRNAs的表達(dá)水平。通過數(shù)據(jù)分析，篩選出在肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者之間存在顯著差異表達(dá)的microRNAs。在此過程中，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保樣本的質(zhì)量和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，以減少誤差對(duì)篩選結(jié)果的影響。構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型：將篩選出的差異表達(dá)microRNAs作為變量，運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法如支持向量機(jī)（SVM）、邏輯回歸、隨機(jī)森林等，構(gòu)建肺結(jié)核診斷模型。在構(gòu)建過程中，需要對(duì)算法進(jìn)行優(yōu)化，調(diào)整參數(shù)，以提高模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。同時(shí)，為了避免過擬合，還需采用交叉驗(yàn)證等方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估和改進(jìn)，確保模型能夠準(zhǔn)確地區(qū)分肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者。驗(yàn)證診斷模型的準(zhǔn)確性和可靠性：使用獨(dú)立的樣本對(duì)構(gòu)建的診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估模型的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等指標(biāo)，以確定模型的準(zhǔn)確性和可靠性?？梢酝ㄟ^受試者工作特征（ROC）曲線分析，計(jì)算曲線下面積（AUC）來直觀地評(píng)價(jià)模型的診斷效能，AUC越接近1，表明模型的診斷性能越好。此外，還需對(duì)模型進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，確保在不同的樣本和實(shí)驗(yàn)條件下，模型都能保持較好的診斷性能。評(píng)估診斷模型在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值：將構(gòu)建的診斷模型與傳統(tǒng)的肺結(jié)核診斷方法如涂片抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、胸部影像學(xué)檢查等進(jìn)行比較，分析其在診斷準(zhǔn)確性、檢測時(shí)間、成本效益等方面的優(yōu)勢和不足。同時(shí)，探討該模型在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用可行性，為肺結(jié)核的早期診斷提供新的方法和依據(jù)，提高肺結(jié)核的診斷效率和準(zhǔn)確性，為患者的及時(shí)治療提供有力支持。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法，以實(shí)現(xiàn)構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型并評(píng)估其診斷價(jià)值的目標(biāo)。具體研究方法如下：樣本收集：收集[X]例經(jīng)臨床確診的肺結(jié)核患者的血液樣本，同時(shí)選取[X]例年齡、性別匹配的健康對(duì)照者的血液樣本。詳細(xì)記錄患者的臨床資料，包括癥狀、體征、病史、影像學(xué)檢查結(jié)果、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等，確保樣本信息完整準(zhǔn)確。樣本收集過程嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，獲得所有參與者的知情同意。RNA提取與檢測：采用TRIzol試劑或其他高效的RNA提取試劑盒，從血液樣本中提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度和完整性，確保提取的RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)提取的RNA中的microRNAs進(jìn)行定量檢測。設(shè)計(jì)特異性的引物，以U6等內(nèi)參基因作為對(duì)照，通過相對(duì)定量法（如2-ΔΔCt法）計(jì)算microRNAs的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件如SPSS、R語言等，對(duì)檢測得到的microRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)、方差分析等方法，比較肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者之間microRNAs表達(dá)水平的差異，篩選出差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）的microRNAs。通過相關(guān)性分析，研究差異表達(dá)microRNAs與肺結(jié)核臨床特征（如病情嚴(yán)重程度、病程、治療效果等）之間的關(guān)系。模型構(gòu)建：將篩選出的差異表達(dá)microRNAs作為特征變量，運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建肺結(jié)核診斷模型。選擇支持向量機(jī)（SVM）、邏輯回歸、隨機(jī)森林等常用的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，通過調(diào)整算法參數(shù)，如SVM的核函數(shù)類型和參數(shù)、邏輯回歸的正則化參數(shù)、隨機(jī)森林的決策樹數(shù)量等，優(yōu)化模型性能。采用交叉驗(yàn)證（如十折交叉驗(yàn)證）的方法，對(duì)模型進(jìn)行訓(xùn)練和評(píng)估，以避免過擬合，提高模型的泛化能力。模型驗(yàn)證：使用獨(dú)立的樣本對(duì)構(gòu)建好的診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證樣本輸入模型，計(jì)算模型的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等指標(biāo)，評(píng)估模型的準(zhǔn)確性和可靠性。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析，計(jì)算曲線下面積（AUC），直觀地評(píng)價(jià)模型的診斷效能。對(duì)模型進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，在不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)相同或相似的樣本進(jìn)行檢測，觀察模型的穩(wěn)定性和一致性。本研究的技術(shù)路線如下：首先進(jìn)行樣本收集，對(duì)肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者采集血液樣本并記錄臨床資料；然后進(jìn)行RNA提取與檢測，獲取樣本中microRNAs的表達(dá)數(shù)據(jù)；接著對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)的microRNAs；之后利用這些差異表達(dá)的microRNAs構(gòu)建診斷模型，并對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化；最后使用獨(dú)立樣本對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估模型的診斷價(jià)值，若模型性能不理想，則返回優(yōu)化步驟，進(jìn)一步改進(jìn)模型，直至達(dá)到滿意的診斷效果，技術(shù)路線圖見圖1-1。[此處插入技術(shù)路線圖]通過以上研究方法和技術(shù)路線，本研究將系統(tǒng)地構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型，并全面評(píng)估其在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值，為肺結(jié)核的早期診斷提供可靠的新方法。二、microRNAs與肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)基礎(chǔ)2.1microRNAs的生物學(xué)特性microRNAs（miRNAs）是一類長度約為20-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中，在物種進(jìn)化過程中具有高度的保守性。其結(jié)構(gòu)特征明顯，成熟的miRNA5′端帶有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3′端為羥基，這一獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA的降解片段區(qū)分開來。多數(shù)miRNA還展現(xiàn)出組織特異性和時(shí)序性，在不同組織和發(fā)育階段呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，對(duì)組織和細(xì)胞的功能特異性起到?jīng)Q定性作用，這表明miRNA在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等眾多重要生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miRNAs的生成過程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和酶的參與。在細(xì)胞核內(nèi)，基因組DNA首先在RNA聚合酶II（polII）的作用下轉(zhuǎn)錄生成較長的具有帽子結(jié)構(gòu)（7MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（AAAAA）的初級(jí)miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA），其長度可達(dá)1000nt。隨后，pri-miRNA在雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha組成的復(fù)合物作用下，被切割成長度大約為70-100堿基、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA）。接著，在RAN-GTP和exportin5的協(xié)助下，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA會(huì)被第二個(gè)雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Dicer識(shí)別并切割，最終產(chǎn)生長度約為22個(gè)核苷酸大小的成熟miRNAs。這些成熟的單鏈miRNAs會(huì)與類似RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合，從而參與到RNA干擾反應(yīng)（RNAi）中。miRNAs主要通過與靶基因的信使核糖核酸（mRNA）相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，其作用機(jī)制主要有兩種方式。在動(dòng)物中，miRNA與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合，通過抑制mRNA的翻譯過程，減少蛋白質(zhì)的合成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。例如，當(dāng)miR-122與靶mRNA的3'UTR結(jié)合后，會(huì)阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的翻譯，使相應(yīng)基因的表達(dá)水平下降。而在植物中，miRNA通常與靶mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框完全互補(bǔ)或幾乎完全互補(bǔ)結(jié)合，這種結(jié)合會(huì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）對(duì)靶mRNA進(jìn)行降解，從而直接減少靶mRNA的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。例如，在擬南芥中，miR-171與靶mRNA完全互補(bǔ)結(jié)合后，RISC會(huì)迅速降解靶mRNA，有效抑制相關(guān)基因的表達(dá)。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而多個(gè)miRNAs也可以共同調(diào)節(jié)同一個(gè)基因，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNAs能夠精準(zhǔn)地調(diào)控基因表達(dá)，確保細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過程有序進(jìn)行。在基因表達(dá)調(diào)控的大舞臺(tái)上，miRNAs猶如一群精密的“調(diào)控者”，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生物學(xué)過程中扮演著不可或缺的角色。在個(gè)體發(fā)育過程中，miRNAs參與調(diào)控胚胎的早期發(fā)育、器官形成等關(guān)鍵階段。例如，在斑馬魚的胚胎發(fā)育過程中，miR-430參與了大腦的發(fā)育調(diào)控，它通過對(duì)特定靶基因的表達(dá)調(diào)控，影響神經(jīng)細(xì)胞的分化和遷移，確保大腦正常發(fā)育。在細(xì)胞增殖和分化方面，miRNAs也發(fā)揮著重要作用。以造血干細(xì)胞分化為例，miR-181能夠精準(zhǔn)調(diào)控造血干細(xì)胞向B細(xì)胞的分化過程，通過抑制或促進(jìn)相關(guān)靶基因的表達(dá)，決定細(xì)胞的分化方向。在細(xì)胞凋亡過程中，miRNAs同樣起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，如miR-15和miR-16能夠通過靶向調(diào)節(jié)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，miRNAs還與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病中，miRNAs的表達(dá)譜往往會(huì)發(fā)生顯著變化，通過對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控，影響疾病的進(jìn)程。例如，在腫瘤發(fā)生過程中，一些miRNAs如miR-21會(huì)異常高表達(dá)，通過抑制腫瘤抑制基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；而另一些miRNAs如let-7則會(huì)表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其對(duì)癌基因的抑制作用減弱，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。綜上所述，miRNAs獨(dú)特的生物學(xué)特性使其在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要地位，其復(fù)雜的生成過程和多樣化的作用機(jī)制為細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程提供了精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，與生物體的正常生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.2肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制與診斷現(xiàn)狀肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的肺部慢性傳染病，結(jié)核分枝桿菌屬于放線菌目分枝桿菌科分枝桿菌屬，是一種需氧、無芽孢、無鞭毛的桿菌，因其細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)，一般染色不易著色，經(jīng)齊-尼氏抗酸染色呈紅色，故又稱抗酸桿菌。結(jié)核分枝桿菌主要通過空氣飛沫傳播。當(dāng)肺結(jié)核患者咳嗽、打噴嚏、大聲說話或唱歌時(shí)，會(huì)將含有結(jié)核分枝桿菌的微滴排到空氣中，這些微滴可長時(shí)間懸浮在空氣中。健康人吸入這些帶有結(jié)核分枝桿菌的微滴后，結(jié)核分枝桿菌便會(huì)進(jìn)入呼吸道。進(jìn)入呼吸道的結(jié)核分枝桿菌首先會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它能夠識(shí)別和吞噬外來病原體。然而，結(jié)核分枝桿菌具有特殊的生存策略，它可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁富含脂質(zhì)，這些脂質(zhì)能夠抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)的殺菌物質(zhì)，使得結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)得以存活。在巨噬細(xì)胞內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌會(huì)抑制巨噬細(xì)胞的殺菌功能，同時(shí)利用巨噬細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖。隨著結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的不斷繁殖，巨噬細(xì)胞會(huì)逐漸被破壞，釋放出更多的結(jié)核分枝桿菌，這些釋放出來的結(jié)核分枝桿菌又會(huì)感染周圍的巨噬細(xì)胞，從而引發(fā)局部的免疫反應(yīng)。在免疫反應(yīng)過程中，T淋巴細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，樹突狀細(xì)胞會(huì)攝取和處理結(jié)核分枝桿菌抗原，并將其呈遞給T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞被激活后，會(huì)分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞能夠識(shí)別并攻擊被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，如γ-干擾素等。γ-干擾素可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺菌能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬和殺滅。同時(shí)，γ-干擾素還可以吸引其他免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，聚集到感染部位，共同參與免疫反應(yīng)。在免疫反應(yīng)的作用下，肺部會(huì)形成結(jié)核結(jié)節(jié)和肉芽腫。結(jié)核結(jié)節(jié)是由巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、朗漢斯巨細(xì)胞等聚集而成的結(jié)節(jié)狀病灶，中心常伴有干酪樣壞死。肉芽腫則是由大量的免疫細(xì)胞和纖維組織圍繞結(jié)核分枝桿菌形成的炎癥性病變。結(jié)核結(jié)節(jié)和肉芽腫的形成是機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的一種防御反應(yīng)，它們可以限制結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)散，保護(hù)周圍組織免受感染。然而，在某些情況下，結(jié)核分枝桿菌可能會(huì)突破免疫防線，導(dǎo)致病情惡化。如果機(jī)體免疫力低下，如患有艾滋病、糖尿病、惡性腫瘤等疾病，或者長期使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物，結(jié)核分枝桿菌就可能在體內(nèi)大量繁殖，引起結(jié)核病的復(fù)發(fā)或播散。目前，臨床上常用的肺結(jié)核診斷方法主要包括涂片鏡檢、培養(yǎng)法、影像學(xué)檢查、分子生物學(xué)檢測和免疫學(xué)檢測等，每種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。涂片鏡檢是肺結(jié)核診斷中最常用的方法之一，通過采集患者的痰液、支氣管肺泡灌洗液等標(biāo)本，經(jīng)涂片、抗酸染色后，在顯微鏡下觀察是否存在抗酸桿菌。該方法操作簡便、成本低廉，能在短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，對(duì)于快速診斷肺結(jié)核具有重要意義，但其敏感性較低，一般只有20-40%，當(dāng)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌數(shù)量較少時(shí)，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且涂片鏡檢無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，也不能判斷細(xì)菌的死活，對(duì)結(jié)核病的診斷存在一定局限性。培養(yǎng)法是診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，將標(biāo)本接種于特定的培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)，觀察是否有結(jié)核分枝桿菌生長。培養(yǎng)法能夠確定結(jié)核分枝桿菌的種類和藥敏性，為臨床治療提供重要依據(jù)，其敏感度和特異度均較高，但培養(yǎng)時(shí)間較長，一般需要2-8周才能得到肉眼可見的菌落，這使得患者無法及時(shí)得到診斷和治療，在培養(yǎng)過程中，標(biāo)本的保存、運(yùn)送條件以及培養(yǎng)基的質(zhì)量等因素都可能影響培養(yǎng)結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，且培養(yǎng)法操作復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件，成本也相對(duì)較高，限制了其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的廣泛應(yīng)用。影像學(xué)檢查如胸部X線和CT在肺結(jié)核診斷中發(fā)揮著重要作用。胸部X線可以直觀地觀察肺部的大致形態(tài)、結(jié)構(gòu)和病變情況，對(duì)于發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核的典型病變?nèi)缃Y(jié)核結(jié)節(jié)、空洞、滲出性病變等具有較高的敏感性，是肺結(jié)核篩查和初步診斷的重要手段，但對(duì)于一些早期或不典型的肺結(jié)核病變，胸部X線可能難以發(fā)現(xiàn)，容易造成漏診。CT檢查具有更高的分辨率，能夠更清晰地顯示肺部病變的細(xì)節(jié)，包括病變的部位、范圍、形態(tài)、密度等，對(duì)于肺結(jié)核的診斷和鑒別診斷具有重要價(jià)值，尤其是對(duì)于一些隱匿性肺結(jié)核、支氣管內(nèi)膜結(jié)核以及與其他肺部疾病的鑒別診斷，CT檢查具有明顯優(yōu)勢，然而，CT檢查費(fèi)用較高，對(duì)患者有一定的輻射，不適合作為大規(guī)模篩查的方法。分子生物學(xué)檢測技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是近年來發(fā)展迅速的肺結(jié)核診斷方法。該技術(shù)通過擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌的特定基因片段，快速檢測標(biāo)本中是否存在結(jié)核分枝桿菌，具有較高的敏感性和特異性，能夠在短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，為肺結(jié)核的早期診斷提供了有力支持，但PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作人員要求較高，容易受到標(biāo)本污染、引物設(shè)計(jì)等因素的影響，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，檢測成本相對(duì)較高，也限制了其在一些地區(qū)的廣泛應(yīng)用。免疫學(xué)檢測主要包括結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）和γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）。TST是通過皮內(nèi)注射結(jié)核菌素，觀察注射部位的皮膚反應(yīng)來判斷機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌，該方法操作簡單、成本低，可用于大規(guī)模篩查，但其特異度和敏感度均較低，容易受到卡介苗接種、非結(jié)核分枝桿菌感染等因素的影響，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。IGRAs則是通過檢測機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的γ-干擾素釋放水平來判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌，具有較高的特異性，基本不受卡介苗接種和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的影響，在肺外結(jié)核患者中有較高的檢出率，但I(xiàn)GRAs不能區(qū)分活動(dòng)性感染和潛伏感染，檢測費(fèi)用較高，也不適合用于結(jié)核病患者治療的療效監(jiān)測。綜上所述，目前的肺結(jié)核診斷方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中存在一定的局限性。因此，尋找新的、更準(zhǔn)確、快速、簡便的診斷方法對(duì)于肺結(jié)核的早期診斷和治療具有重要意義。2.3microRNAs在肺結(jié)核中的表達(dá)特征2.3.1肺結(jié)核患者與健康人群microRNAs表達(dá)差異大量研究表明，肺結(jié)核患者與健康人群體內(nèi)的microRNAs表達(dá)譜存在顯著差異。滕新棟等人通過高通量測序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)5例痰涂片或痰培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者以及5名健康人的血漿進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血漿中存在多種差異表達(dá)的microRNAs，其中15種表達(dá)上調(diào)，6種表達(dá)下調(diào)，這些差異表達(dá)的microRNAs可能參與了肺結(jié)核的發(fā)病過程。Qi等人利用低密度陣列檢測發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，97種microRNAs在肺結(jié)核患者血清中差異表達(dá)，其中90種表達(dá)上調(diào)，7種表達(dá)下調(diào)，經(jīng)qRT-PCR和受試者工作特征（ROC）曲線證實(shí)，血清中miR-361-5p、miR-576-3p和miR-889可用于診斷肺結(jié)核和健康人，曲線下面積（AUC）為0.711-0.848，多重logistic回歸分析顯示聯(lián)合這三種microRNAs可增強(qiáng)診斷能力。在眾多差異表達(dá)的microRNAs中，miR-29家族在肺結(jié)核患者中的表達(dá)變化備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a、miR-29b和miR-29c在肺結(jié)核患者的血清、血漿或組織中表達(dá)顯著上調(diào)。miR-29a可通過靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因如COL1A1、COL3A1和ELN等的表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，進(jìn)而影響結(jié)核分枝桿菌感染后的免疫反應(yīng)和組織修復(fù)過程。miR-155在肺結(jié)核患者中也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，它可以通過調(diào)控多個(gè)靶基因參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。miR-155能夠靶向抑制SHIP1基因的表達(dá)，從而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，在結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這些差異表達(dá)的microRNAs在肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展過程中可能通過多種途徑發(fā)揮作用。一方面，它們可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，影響巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，從而影響機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御能力。另一方面，它們可能參與調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染相關(guān)的信號(hào)通路，影響細(xì)菌的存活、繁殖和擴(kuò)散。這些差異表達(dá)的microRNAs為肺結(jié)核的診斷提供了潛在的生物標(biāo)志物，通過檢測它們在血液、痰液等樣本中的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)核的早期診斷和病情監(jiān)測。2.3.2不同類型肺結(jié)核患者的microRNAs表達(dá)特點(diǎn)不同類型的肺結(jié)核患者，如菌陰肺結(jié)核、耐藥肺結(jié)核患者，其體內(nèi)的microRNAs表達(dá)特征也存在差異，這些差異與疾病類型緊密相關(guān)，對(duì)深入理解肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制和精準(zhǔn)診斷具有重要意義。菌陰肺結(jié)核是指多次痰涂片及痰培養(yǎng)結(jié)核菌均為陰性的肺結(jié)核，由于其病原菌檢測困難，診斷相對(duì)復(fù)雜。有研究對(duì)菌陰肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者的血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌陰肺結(jié)核患者血清中miR-146a、miR-155和miR-223的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照者。miR-146a可通過靶向調(diào)節(jié)TRAF6和IRAK1等基因，參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，影響機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，在菌陰肺結(jié)核患者中高表達(dá)，可能提示其在菌陰肺結(jié)核發(fā)病過程中免疫調(diào)節(jié)異常。耐藥肺結(jié)核，尤其是耐多藥肺結(jié)核（MDR-TB）和廣泛耐藥肺結(jié)核（XDR-TB），因其治療難度大、療程長、預(yù)后差，成為全球結(jié)核病防控的重點(diǎn)和難點(diǎn)。高麗等人通過miRNAs芯片篩選和RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌（MTB）敏感株感染的肺結(jié)核患者相比，MTB耐藥株感染的肺結(jié)核患者血漿中miR-26a、miR-24、miR-222、miR-191、miR-155、miR-126、miR-122和let-7b等8種miRNA表達(dá)上調(diào)，miR-767-3p、miR-1283、miR-1281等3種miRNA表達(dá)下調(diào)，這些差異表達(dá)的miRNAs可能與結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制相關(guān)。miR-155可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響結(jié)核分枝桿菌對(duì)藥物的敏感性，其在耐藥肺結(jié)核患者中的高表達(dá)，或許與耐藥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這些不同類型肺結(jié)核患者特有的microRNAs表達(dá)特征，為肺結(jié)核的分型診斷提供了新的思路和方法。通過檢測這些特異性的microRNAs表達(dá)譜，可以輔助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷肺結(jié)核的類型，從而制定更有針對(duì)性的治療方案。對(duì)于菌陰肺結(jié)核患者，檢測其血清中高表達(dá)的miR-146a、miR-155和miR-223等，有助于在病原菌檢測陰性的情況下，提高診斷的準(zhǔn)確性。對(duì)于耐藥肺結(jié)核患者，分析血漿中差異表達(dá)的miRNAs，能夠?yàn)槟退幮缘呐袛嗵峁┮罁?jù)，指導(dǎo)臨床合理選擇抗結(jié)核藥物，避免盲目用藥，提高治療效果。2.3.3microRNAs表達(dá)與肺結(jié)核病情進(jìn)展的關(guān)系隨著肺結(jié)核病情的發(fā)展，患者體內(nèi)的microRNAs表達(dá)水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，深入研究這種變化規(guī)律，對(duì)于揭示肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制和病情監(jiān)測具有重要的潛在價(jià)值。在肺結(jié)核病情發(fā)展的早期階段，一些microRNAs的表達(dá)變化可能與機(jī)體的免疫應(yīng)答啟動(dòng)相關(guān)。研究表明，miR-155在肺結(jié)核發(fā)病初期表達(dá)迅速上調(diào)，這是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后，激活了Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)miR-155的表達(dá)。miR-155通過靶向抑制SHIP1基因，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化和炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的釋放，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。隨著病情的進(jìn)展，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)持續(xù)繁殖，引發(fā)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損傷時(shí)，其他microRNAs的表達(dá)也會(huì)發(fā)生改變。miR-29家族在肺結(jié)核進(jìn)展期表達(dá)顯著上調(diào)，miR-29a可通過靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因COL1A1、COL3A1和ELN等的表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，導(dǎo)致肺部組織的纖維化和結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)一步加重病情。在肺結(jié)核治療過程中，microRNAs的表達(dá)水平也會(huì)隨著治療效果而發(fā)生變化。若治療有效，患者體內(nèi)一些異常表達(dá)的microRNAs會(huì)逐漸恢復(fù)到接近正常水平。一項(xiàng)針對(duì)肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后血清miR-155表達(dá)水平變化的研究發(fā)現(xiàn)，治療后患者血清miR-155表達(dá)水平顯著下降，且其下降程度與病情改善程度相關(guān)。這表明miR-155的表達(dá)水平可以作為評(píng)估肺結(jié)核治療效果的潛在指標(biāo)。通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測miR-155等與病情進(jìn)展相關(guān)的microRNAs表達(dá)水平，醫(yī)生能夠及時(shí)了解患者對(duì)治療的反應(yīng)，判斷治療方案的有效性，從而調(diào)整治療策略。如果在治療過程中發(fā)現(xiàn)miR-155等microRNAs表達(dá)水平未出現(xiàn)預(yù)期的下降，可能提示治療效果不佳，需要進(jìn)一步評(píng)估原因，調(diào)整用藥或采取其他治療措施。三、基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本采集本研究采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，旨在全面、系統(tǒng)地篩選與肺結(jié)核相關(guān)的差異表達(dá)microRNAs，并構(gòu)建高效準(zhǔn)確的診斷模型。樣本來源主要為[醫(yī)院名稱1]和[醫(yī)院名稱2]呼吸內(nèi)科及感染科收治的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵循肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：痰涂片抗酸染色陽性或痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性，結(jié)合胸部影像學(xué)（如X線、CT）典型表現(xiàn)以及臨床癥狀（如咳嗽、咳痰≥2周，或痰中帶血、咯血，伴有盜汗、疲乏、午后低熱、食欲不振、體重減輕等全身癥狀）確診為肺結(jié)核的患者。同時(shí)，選取同期在上述醫(yī)院進(jìn)行健康體檢、無任何結(jié)核相關(guān)癥狀和體征，且胸部影像學(xué)檢查正常、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）陰性或γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）陰性的人群作為健康對(duì)照者。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：合并其他肺部疾病，如肺癌、肺炎、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等，避免這些疾病對(duì)microRNAs表達(dá)譜的干擾；患有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、糖尿病等可能影響機(jī)體免疫狀態(tài)的全身性疾??；近期（3個(gè)月內(nèi)）使用過免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物；妊娠或哺乳期婦女。最終，共納入肺結(jié)核患者[X]例，其中男性[X]例，女性[X]例，年齡范圍為[X]歲至[X]歲，平均年齡（[X]±[X]）歲。健康對(duì)照者[X]例，男性[X]例，女性[X]例，年齡范圍為[X]歲至[X]歲，平均年齡（[X]±[X]）歲。兩組在年齡、性別方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無顯著差異（P>0.05），具有可比性，詳細(xì)信息見表3-1。[此處插入樣本基本信息表]在樣本采集過程中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。清晨空腹采集每位參與者的外周靜脈血5mL，置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空采血管中，輕輕顛倒混勻，避免血液凝固。采集后的血液樣本在2小時(shí)內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。部分樣本用于分離血漿，采用低速離心機(jī)在4℃條件下，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，小心吸取上層血漿，分裝至無RNA酶的離心管中，每管100μL，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用，以防止血漿中的microRNAs降解。另一部分樣本用于提取總RNA，采用TRIzol試劑法，按照試劑說明書的步驟進(jìn)行操作。迅速取出適量血液樣本，加入TRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，然后依次進(jìn)行氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌等步驟，最終得到總RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.2之間，以保證RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，隨后將總RNA儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。3.2microRNAs的篩選與鑒定3.2.1RNA提取與質(zhì)量檢測在本研究中，采用TRIzol試劑法從血漿樣本中提取總RNA，這是一種基于酚-氯仿抽提原理的經(jīng)典方法，能夠有效提取高質(zhì)量的RNA。具體操作如下：將儲(chǔ)存于-80℃冰箱的血漿樣本取出，在冰上解凍。取200μL血漿轉(zhuǎn)移至無RNA酶的1.5mL離心管中，加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打混勻，確保細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5分鐘，使RNA充分釋放。隨后，按照0.2mL氯仿/1mLTRIzol的比例加入氯仿，蓋緊管蓋，用手劇烈振蕩15秒，使溶液充分混合，室溫放置3分鐘。將離心管置于4℃，12000rpm條件下離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分層，上層為無色透明的水相，RNA主要存在于水相中；中間為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相（約500μL）轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶離心管中，注意避免吸取到中間的蛋白層和下層的有機(jī)相，以免污染RNA。接著，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。在4℃，12000rpm條件下離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇，渦旋振蕩或顛倒混勻，洗滌RNA沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)。在4℃，7500rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，短暫離心后，用10μL小槍頭盡量吸掉殘留的液體。將離心管置于室溫靜置5-10分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，但要注意RNA不要完全干透，以防難以溶解。最后，加入適量無RNA酶水溶解RNA，室溫靜置10分鐘，使RNA充分溶解。提取的總RNA需進(jìn)行質(zhì)量檢測，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。首先，使用Nanodrop紫外分光光度計(jì)測定RNA樣本在260nm和280nm處的吸光值，計(jì)算OD260/OD280比值。純的RNA比值應(yīng)在1.8-2.2之間，若比值低于1.8，可能提示RNA受到蛋白質(zhì)污染；若比值高于2.2，可能存在RNA降解或試劑殘留等問題。同時(shí)，檢測OD260/230比值，純的RNA該比值應(yīng)在2.0-2.5之間，若比值較低，表明RNA可能受到有機(jī)物如糖、肽、苯酚等的污染。其次，采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的完整性進(jìn)行鑒定。配制1%的瓊脂糖凝膠，加入適量核酸染料，充分混勻。取1-2μLRNA樣本與上樣緩沖液混合后，上樣至凝膠孔中，同時(shí)加入RNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。完整的RNA在凝膠上應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，若條帶模糊或出現(xiàn)降解帶，則說明RNA完整性不佳。通過嚴(yán)格的RNA提取和質(zhì)量檢測過程，保證了用于后續(xù)microRNAs芯片分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的RNA質(zhì)量。3.2.2microRNAs芯片分析與差異篩選為全面檢測樣本中microRNAs的表達(dá)譜，本研究采用AgilentmiRNA芯片進(jìn)行分析，該芯片具有高靈敏度、高特異性和高通量的特點(diǎn)，能夠同時(shí)檢測大量的microRNAs。在進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)前，需對(duì)提取的總RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。使用AgilentmiRNACompleteLabelingandHybKit試劑盒，按照說明書操作。將500ng總RNA與Cyanine3-pCp在特定條件下反應(yīng)，使Cy3熒光染料標(biāo)記到RNA分子上。標(biāo)記完成后，將標(biāo)記好的RNA與AgilentmiRNA芯片進(jìn)行雜交。芯片雜交在AgilentSureHyb雜交爐中進(jìn)行，溫度設(shè)置為55℃，雜交時(shí)間為20小時(shí)，以確保RNA與芯片上的探針充分結(jié)合。雜交結(jié)束后，使用AgilentGeneExpressionWashBufferKit對(duì)芯片進(jìn)行洗滌，去除未結(jié)合的RNA和雜質(zhì)。然后，將芯片放入AgilentG2565CAMicroarrayScanner掃描儀中進(jìn)行掃描，獲取芯片上的熒光信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。運(yùn)用FeatureExtraction軟件對(duì)掃描得到的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將熒光信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為數(shù)值數(shù)據(jù)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除實(shí)驗(yàn)過程中的系統(tǒng)誤差。采用limma軟件包進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者之間表達(dá)差異顯著的microRNAs。設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異倍數(shù)（fold-change）≥2.0或≤0.5，且校正后的P值（adjustedP-value）<0.05。經(jīng)過嚴(yán)格的芯片分析和差異篩選，最終獲得了一系列在肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者中差異表達(dá)的microRNAs。這些差異表達(dá)的microRNAs可能與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為后續(xù)構(gòu)建肺結(jié)核診斷模型提供了重要的候選生物標(biāo)志物。通過對(duì)這些差異表達(dá)microRNAs的進(jìn)一步研究，有望揭示肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制，為肺結(jié)核的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。3.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證為確保芯片篩選出的差異表達(dá)microRNAs結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。首先，使用TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制反應(yīng)體系，包括5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、Random6mers1μL、OligodTPrimer1μL、總RNA1μg，加RNase-freeddH2O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照37℃15分鐘，85℃5秒的程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。針對(duì)芯片篩選出的差異表達(dá)microRNAs，設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度一般為18-25個(gè)堿基，Tm值在58-62℃之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。同時(shí)，以U6作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)水平。引物序列由[引物合成公司名稱]合成。采用TaKaRaSYBRPremixExTaqII試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。在冰上配制20μL反應(yīng)體系，包括SYBRPremixExTaqII10μL、上下游引物（10μM）各0.8μL、cDNA模板2μL，加ddH2O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至96孔板中，短暫離心。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒。在每個(gè)循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號(hào)，繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的microRNAs相對(duì)于內(nèi)參基因U6的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算每個(gè)樣本中目的基因與內(nèi)參基因Ct值的差值（ΔCt），即ΔCt=Ct目的基因-CtU6。然后計(jì)算肺結(jié)核患者組和健康對(duì)照組ΔCt的差值（ΔΔCt），即ΔΔCt=ΔCt肺結(jié)核患者組-ΔCt健康對(duì)照組。最后，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組樣本的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)大部分芯片篩選出的差異表達(dá)microRNAs在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)趨勢與芯片結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了芯片篩選結(jié)果的可靠性。這些經(jīng)過驗(yàn)證的差異表達(dá)microRNAs將作為關(guān)鍵的生物標(biāo)志物，用于后續(xù)基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型的構(gòu)建。3.3診斷模型的建立3.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理與特征選擇在構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型過程中，數(shù)據(jù)預(yù)處理和特征選擇是至關(guān)重要的步驟，直接影響模型的性能和診斷準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)預(yù)處理的目的是消除數(shù)據(jù)中的噪聲和異常值，使數(shù)據(jù)符合模型的輸入要求，提高模型的訓(xùn)練效果和穩(wěn)定性。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理采用Z-score標(biāo)準(zhǔn)化方法，通過計(jì)算每個(gè)樣本數(shù)據(jù)與均值的差值，并除以標(biāo)準(zhǔn)差，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為均值為0，標(biāo)準(zhǔn)差為1的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布數(shù)據(jù)。假設(shè)樣本數(shù)據(jù)為x_{ij}，其中i表示樣本編號(hào)，j表示特征編號(hào)，均值為\mu_j，標(biāo)準(zhǔn)差為\sigma_j，則標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)z_{ij}計(jì)算公式為：z_{ij}=\frac{x_{ij}-\mu_j}{\sigma_j}歸一化處理則采用Min-Max歸一化方法，將數(shù)據(jù)映射到[0,1]區(qū)間內(nèi)。其計(jì)算公式為：y_{ij}=\frac{x_{ij}-min(x_j)}{max(x_j)-min(x_j)}其中，min(x_j)和max(x_j)分別表示第j個(gè)特征的最小值和最大值，y_{ij}為歸一化后的數(shù)據(jù)。通過標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理，不僅消除了不同特征之間量綱和數(shù)量級(jí)的差異，還使數(shù)據(jù)更易于模型學(xué)習(xí)和處理。特征選擇是從原始特征中挑選出與肺結(jié)核診斷相關(guān)性強(qiáng)的microRNAs作為特征變量，以減少特征維度，提高模型的訓(xùn)練效率和泛化能力，避免過擬合現(xiàn)象。本研究采用了多種方法進(jìn)行特征選擇。首先，基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算每個(gè)microRNA在肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者之間表達(dá)水平差異的顯著性。使用t檢驗(yàn)來判斷兩組數(shù)據(jù)均值是否存在顯著差異，若P值小于設(shè)定的顯著性水平（如0.05），則認(rèn)為該microRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將其初步篩選出來。其次，運(yùn)用相關(guān)性分析方法，計(jì)算每個(gè)microRNA與肺結(jié)核診斷標(biāo)簽（患者或健康對(duì)照）之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。皮爾遜相關(guān)系數(shù)的取值范圍為[-1,1]，絕對(duì)值越接近1，表示相關(guān)性越強(qiáng)。篩選出相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于一定閾值（如0.5）的microRNA，這些microRNA與肺結(jié)核診斷具有較強(qiáng)的線性相關(guān)性。最后，采用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的特征選擇方法，如遞歸特征消除（RFE）算法。RFE算法通過遞歸地刪除對(duì)模型性能貢獻(xiàn)最小的特征，逐步篩選出最優(yōu)的特征子集。以支持向量機(jī)（SVM）作為基礎(chǔ)模型，利用RFE算法對(duì)特征進(jìn)行排序和篩選，保留對(duì)模型分類準(zhǔn)確率提升最顯著的特征。通過綜合運(yùn)用這些特征選擇方法，最終確定了[具體數(shù)量]個(gè)與肺結(jié)核診斷相關(guān)性強(qiáng)的microRNAs作為構(gòu)建診斷模型的特征變量。這些特征變量將為后續(xù)模型構(gòu)建提供關(guān)鍵信息，有助于提高模型的診斷效能。3.3.2模型構(gòu)建方法選擇在構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型時(shí)，選擇合適的建模方法至關(guān)重要。不同的建模方法具有各自獨(dú)特的原理和優(yōu)缺點(diǎn)，需要綜合考慮數(shù)據(jù)特點(diǎn)、模型性能以及實(shí)際應(yīng)用需求等因素，以確定最適合的方法。Logistic回歸是一種經(jīng)典的線性分類模型，其原理基于邏輯函數(shù)，通過對(duì)自變量進(jìn)行線性組合，將結(jié)果映射到0-1之間的概率值，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的分類。假設(shè)自變量為x_1,x_2,\cdots,x_n，對(duì)應(yīng)的系數(shù)為\beta_0,\beta_1,\cdots,\beta_n，則Logistic回歸模型的表達(dá)式為：P(Y=1|X)=\frac{1}{1+e^{-(\beta_0+\beta_1x_1+\cdots+\beta_nx_n)}}其中，P(Y=1|X)表示在給定自變量X的情況下，樣本屬于正類（如肺結(jié)核患者）的概率。Logistic回歸模型的優(yōu)點(diǎn)是原理簡單，易于理解和解釋，計(jì)算效率高，對(duì)數(shù)據(jù)的要求相對(duì)較低，在樣本量較小的情況下也能表現(xiàn)出較好的性能，并且可以通過系數(shù)估計(jì)直觀地了解每個(gè)特征對(duì)分類結(jié)果的影響方向和程度。然而，它也存在一些局限性，由于其假設(shè)自變量與因變量之間存在線性關(guān)系，當(dāng)數(shù)據(jù)存在復(fù)雜的非線性關(guān)系時(shí)，模型的擬合效果可能不佳，導(dǎo)致分類準(zhǔn)確率下降，且對(duì)異常值較為敏感，容易受到極端數(shù)據(jù)的影響。支持向量機(jī)（SVM）是一種基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的分類方法，其基本思想是尋找一個(gè)最優(yōu)分類超平面，使得不同類別的樣本之間的間隔最大化。在低維空間中，如果數(shù)據(jù)線性可分，SVM可以直接找到一個(gè)線性超平面將兩類樣本分開；對(duì)于線性不可分的數(shù)據(jù)，SVM通過引入核函數(shù)將數(shù)據(jù)映射到高維空間，使其在高維空間中變得線性可分。常用的核函數(shù)有線性核、多項(xiàng)式核、徑向基核（RBF）等。以徑向基核函數(shù)為例，其表達(dá)式為：K(x_i,x_j)=e^{-\gamma||x_i-x_j||^2}其中，x_i和x_j是兩個(gè)樣本向量，\gamma是核函數(shù)的參數(shù)。SVM的優(yōu)點(diǎn)在于能夠有效處理非線性分類問題，對(duì)高維數(shù)據(jù)具有較好的適應(yīng)性，在小樣本情況下也能表現(xiàn)出良好的泛化能力，并且具有較強(qiáng)的魯棒性，對(duì)噪聲和離群點(diǎn)有一定的容忍度。但SVM的缺點(diǎn)是計(jì)算復(fù)雜度較高，尤其是在處理大規(guī)模數(shù)據(jù)時(shí)，計(jì)算量會(huì)顯著增加，模型的訓(xùn)練時(shí)間較長，且對(duì)核函數(shù)和參數(shù)的選擇較為敏感，不同的選擇可能會(huì)導(dǎo)致模型性能的較大差異，需要通過交叉驗(yàn)證等方法進(jìn)行調(diào)優(yōu)。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種模擬人類大腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的計(jì)算模型，由大量的節(jié)點(diǎn)（神經(jīng)元）和連接這些節(jié)點(diǎn)的權(quán)重組成。一個(gè)典型的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)包括輸入層、隱藏層和輸出層。輸入層接收外部數(shù)據(jù)，隱藏層對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取和變換，輸出層根據(jù)隱藏層的輸出進(jìn)行分類或預(yù)測。在訓(xùn)練過程中，通過調(diào)整權(quán)重來最小化預(yù)測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果之間的誤差。反向傳播算法是常用的訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法，它通過計(jì)算誤差的梯度，并將其反向傳播到網(wǎng)絡(luò)的各個(gè)層，以更新權(quán)重。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有很強(qiáng)的非線性建模能力，能夠?qū)W習(xí)復(fù)雜的數(shù)據(jù)模式和規(guī)律，對(duì)數(shù)據(jù)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以處理各種類型的數(shù)據(jù)。然而，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)也存在一些問題，它的結(jié)構(gòu)和參數(shù)復(fù)雜，訓(xùn)練過程需要大量的計(jì)算資源和時(shí)間，模型的可解釋性較差，難以直觀地理解模型的決策過程和結(jié)果，容易出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，需要采取一些正則化方法來避免。綜合考慮以上多種建模方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)，以及本研究的數(shù)據(jù)特點(diǎn)和實(shí)際應(yīng)用需求，選擇支持向量機(jī)（SVM）作為構(gòu)建肺結(jié)核診斷模型的方法。本研究的數(shù)據(jù)維度較高，且可能存在復(fù)雜的非線性關(guān)系，SVM在處理高維非線性數(shù)據(jù)方面具有明顯優(yōu)勢。通過合理選擇核函數(shù)和參數(shù)調(diào)優(yōu)，可以有效提高模型的分類性能，使其能夠準(zhǔn)確地識(shí)別肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者。3.3.3模型構(gòu)建過程本研究選用支持向量機(jī)（SVM）算法構(gòu)建基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型。在構(gòu)建過程中，以篩選出的與肺結(jié)核診斷相關(guān)性強(qiáng)的[具體數(shù)量]個(gè)microRNAs作為特征變量，這些特征變量組成特征矩陣X，其中每一行代表一個(gè)樣本，每一列代表一個(gè)microRNA的表達(dá)量。樣本的類別標(biāo)簽（肺結(jié)核患者或健康對(duì)照者）組成向量Y，肺結(jié)核患者標(biāo)記為1，健康對(duì)照者標(biāo)記為0。在使用SVM算法之前，需要對(duì)其關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行設(shè)定和優(yōu)化。核函數(shù)的選擇對(duì)SVM的性能影響較大，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對(duì)比，選用徑向基核函數(shù)（RBF），其公式為K(x_i,x_j)=e^{-\gamma||x_i-x_j||^2}，其中x_i和x_j是兩個(gè)樣本向量，\gamma是核函數(shù)的參數(shù)。參數(shù)\gamma決定了核函數(shù)的寬度，對(duì)模型的泛化能力和擬合能力有重要影響。為了確定最優(yōu)的\gamma值，采用網(wǎng)格搜索法結(jié)合五折交叉驗(yàn)證進(jìn)行參數(shù)調(diào)優(yōu)。網(wǎng)格搜索法是一種窮舉搜索方法，它在預(yù)先設(shè)定的參數(shù)范圍內(nèi)，對(duì)每個(gè)參數(shù)組合進(jìn)行模型訓(xùn)練和評(píng)估，選擇在交叉驗(yàn)證中表現(xiàn)最佳的參數(shù)組合作為最優(yōu)參數(shù)。在本研究中，設(shè)定\gamma的搜索范圍為[0.01,0.1,1,10,100]，通過五折交叉驗(yàn)證，將數(shù)據(jù)集隨機(jī)劃分為五等份，每次選取其中一份作為驗(yàn)證集，其余四份作為訓(xùn)練集，對(duì)每個(gè)\gamma值進(jìn)行模型訓(xùn)練和驗(yàn)證，計(jì)算模型在驗(yàn)證集上的準(zhǔn)確率、敏感度、特異度等指標(biāo)，最終確定最優(yōu)的\gamma值為[具體值]。確定參數(shù)后，使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)集對(duì)SVM模型進(jìn)行訓(xùn)練。訓(xùn)練過程就是尋找一個(gè)最優(yōu)的分類超平面，使得不同類別的樣本之間的間隔最大化。在訓(xùn)練完成后，得到的SVM模型可以表示為：f(x)=\text{sgn}\left(\sum_{i=1}^{n}\alpha_iy_iK(x_i,x)+b\right)其中，x是待分類的樣本向量，\alpha_i是拉格朗日乘子，y_i是樣本i的類別標(biāo)簽，K(x_i,x)是核函數(shù)，b是分類超平面的偏置。\text{sgn}是符號(hào)函數(shù)，當(dāng)\sum_{i=1}^{n}\alpha_iy_iK(x_i,x)+b\geq0時(shí)，f(x)=1，表示樣本x被分類為肺結(jié)核患者；當(dāng)\sum_{i=1}^{n}\alpha_iy_iK(x_i,x)+b\lt0時(shí)，f(x)=-1，表示樣本x被分類為健康對(duì)照者。通過上述構(gòu)建過程，成功建立了基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型。該模型將在后續(xù)的研究中，通過獨(dú)立的測試數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)估，以確定其在肺結(jié)核診斷中的準(zhǔn)確性和可靠性。四、診斷模型的驗(yàn)證與性能評(píng)估4.1模型驗(yàn)證4.1.1內(nèi)部驗(yàn)證內(nèi)部驗(yàn)證是評(píng)估模型穩(wěn)定性和泛化能力的關(guān)鍵步驟，本研究采用十折交叉驗(yàn)證方法對(duì)基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型在訓(xùn)練集內(nèi)進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證。十折交叉驗(yàn)證的具體操作如下：將訓(xùn)練集隨機(jī)劃分為十個(gè)大小相等的子集，在每次驗(yàn)證中，選擇其中一個(gè)子集作為驗(yàn)證集，其余九個(gè)子集作為訓(xùn)練集。使用訓(xùn)練集對(duì)模型進(jìn)行訓(xùn)練，得到訓(xùn)練好的模型后，用驗(yàn)證集對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，記錄模型在驗(yàn)證集上的性能指標(biāo)，如準(zhǔn)確率、敏感度、特異度等。重復(fù)上述過程十次，每次選擇不同的子集作為驗(yàn)證集，最終得到十個(gè)性能指標(biāo)的評(píng)估結(jié)果。通過對(duì)這十個(gè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到模型性能指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以此來評(píng)估模型的穩(wěn)定性和泛化能力。準(zhǔn)確率是指模型正確分類的樣本數(shù)占總樣本數(shù)的比例，其計(jì)算公式為：?????????=\frac{TP+TN}{TP+TN+FP+FN}其中，TP（TruePositive）表示真陽性，即實(shí)際為陽性且被模型預(yù)測為陽性的樣本數(shù)；TN（TrueNegative）表示真陰性，即實(shí)際為陰性且被模型預(yù)測為陰性的樣本數(shù)；FP（FalsePositive）表示假陽性，即實(shí)際為陰性但被模型預(yù)測為陽性的樣本數(shù)；FN（FalseNegative）表示假陰性，即實(shí)際為陽性但被模型預(yù)測為陰性的樣本數(shù)。敏感度，也稱為真陽性率，是指實(shí)際為陽性的樣本中被模型正確預(yù)測為陽性的比例，其計(jì)算公式為：???????o|=\frac{TP}{TP+FN}特異度，即真陰性率，是指實(shí)際為陰性的樣本中被模型正確預(yù)測為陰性的比例，計(jì)算公式為：??1????o|=\frac{TN}{TN+FP}經(jīng)過十折交叉驗(yàn)證，模型在訓(xùn)練集上的準(zhǔn)確率平均值為[X]%，標(biāo)準(zhǔn)差為[X]；敏感度平均值為[X]%，標(biāo)準(zhǔn)差為[X]；特異度平均值為[X]%，標(biāo)準(zhǔn)差為[X]。這些結(jié)果表明，模型在訓(xùn)練集內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，不同劃分方式下的性能指標(biāo)波動(dòng)較小，且具備一定的泛化能力，能夠較為準(zhǔn)確地對(duì)訓(xùn)練集內(nèi)的樣本進(jìn)行分類。4.1.2外部驗(yàn)證為進(jìn)一步檢驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诓煌瑯颖局械脑\斷準(zhǔn)確性，本研究利用獨(dú)立的外部樣本對(duì)構(gòu)建的診斷模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。外部樣本來自于[醫(yī)院名稱3]，共收集了[X]例樣本，其中肺結(jié)核患者[X]例，健康對(duì)照者[X]例。這些樣本在采集時(shí)間、地域、人群特征等方面與訓(xùn)練集和內(nèi)部驗(yàn)證集存在差異，以確保驗(yàn)證的獨(dú)立性和有效性。將外部樣本按照與訓(xùn)練集相同的數(shù)據(jù)預(yù)處理和特征提取方法進(jìn)行處理，然后輸入到已構(gòu)建好的診斷模型中進(jìn)行預(yù)測。計(jì)算模型在外部樣本上的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值等指標(biāo)，評(píng)估模型的診斷準(zhǔn)確性。陽性預(yù)測值是指模型預(yù)測為陽性的樣本中實(shí)際為陽性的比例，計(jì)算公式為：é?3??§é￠??μ????=\frac{TP}{TP+FP}陰性預(yù)測值是指模型預(yù)測為陰性的樣本中實(shí)際為陰性的比例，計(jì)算公式為：é?′??§é￠??μ????=\frac{TN}{TN+FN}外部驗(yàn)證結(jié)果顯示，模型在外部樣本中的敏感度為[X]%，特異度為[X]%，陽性預(yù)測值為[X]%，陰性預(yù)測值為[X]%。通過與內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)模型在外部樣本中的診斷性能與內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果相近，雖然在具體數(shù)值上可能存在一定波動(dòng)，但整體趨勢一致。這表明該模型具有較好的跨樣本診斷能力，在不同來源的樣本中都能保持相對(duì)穩(wěn)定的診斷準(zhǔn)確性，能夠有效地區(qū)分肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者，為模型在實(shí)際臨床應(yīng)用中的推廣提供了有力支持。4.2性能評(píng)估指標(biāo)為全面、客觀地評(píng)估基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型的性能，本研究采用了一系列常用且重要的評(píng)估指標(biāo)，這些指標(biāo)從不同角度反映了模型的診斷能力和可靠性。敏感度，也被稱為真陽性率，是評(píng)估模型對(duì)真實(shí)陽性樣本識(shí)別能力的關(guān)鍵指標(biāo)。其計(jì)算公式為：敏感度=TP/(TP+FN)，其中TP表示真陽性，即實(shí)際為陽性且被模型預(yù)測為陽性的樣本數(shù)；FN表示假陰性，即實(shí)際為陽性但被模型預(yù)測為陰性的樣本數(shù)。敏感度越高，表明模型能夠準(zhǔn)確檢測出更多真正患有肺結(jié)核的患者，避免漏診情況的發(fā)生。例如，若模型的敏感度為90%，意味著在100名實(shí)際患有肺結(jié)核的患者中，模型能夠正確識(shí)別出90名，僅漏診10名。特異度，即真陰性率，用于衡量模型對(duì)真實(shí)陰性樣本的判斷準(zhǔn)確性。計(jì)算公式為：特異度=TN/(TN+FP)，這里TN代表真陰性，即實(shí)際為陰性且被模型預(yù)測為陰性的樣本數(shù)；FP代表假陽性，即實(shí)際為陰性但被模型預(yù)測為陽性的樣本數(shù)。特異度高說明模型能夠準(zhǔn)確排除健康對(duì)照者，減少誤診的可能性。比如，當(dāng)特異度為85%時(shí)，在100名健康對(duì)照者中，模型能夠正確判斷出85名為健康人，誤診為肺結(jié)核患者的僅有15名。準(zhǔn)確率是綜合考慮模型對(duì)所有樣本判斷準(zhǔn)確性的指標(biāo)，它反映了模型正確分類的樣本數(shù)占總樣本數(shù)的比例。計(jì)算公式為：準(zhǔn)確率=(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)。準(zhǔn)確率越高，表明模型在整體上的分類性能越好。例如，若模型的準(zhǔn)確率為88%，表示在所有參與評(píng)估的樣本中，模型能夠正確分類88%的樣本。陽性預(yù)測值體現(xiàn)了模型預(yù)測為陽性的樣本中實(shí)際為陽性的比例，其計(jì)算公式為：陽性預(yù)測值=TP/(TP+FP)。陽性預(yù)測值高意味著當(dāng)模型判斷某樣本為肺結(jié)核患者時(shí)，該樣本真正患病的可能性較大。例如，陽性預(yù)測值為80%，則模型預(yù)測為陽性的樣本中，有80%實(shí)際上是肺結(jié)核患者。陰性預(yù)測值用于評(píng)估模型預(yù)測為陰性的樣本中實(shí)際為陰性的比例，計(jì)算公式是：陰性預(yù)測值=TN/(TN+FN)。陰性預(yù)測值高說明當(dāng)模型判斷某樣本為健康對(duì)照者時(shí)，該樣本確實(shí)為健康人的可信度較高。比如，陰性預(yù)測值為92%，表示模型預(yù)測為陰性的樣本中，92%是真正的健康對(duì)照者。受試者工作特征曲線（ReceiverOperatingCharacteristiccurve，ROC曲線）是一種直觀展示模型在不同分類閾值下敏感度和特異度之間關(guān)系的工具。它以假陽性率（FPR=FP/(FP+TN)）為橫坐標(biāo)，真陽性率（敏感度）為縱坐標(biāo)，通過繪制不同閾值下的點(diǎn)來形成曲線。ROC曲線越靠近左上角，說明模型的性能越好。曲線下面積（AreaUndertheCurve，AUC）是ROC曲線的一個(gè)重要指標(biāo)，它表示模型區(qū)分正樣本和負(fù)樣本的能力。AUC的取值范圍在0.5-1之間，AUC越接近1，表明模型的診斷效能越高；當(dāng)AUC=0.5時(shí)，說明模型的預(yù)測效果與隨機(jī)猜測無異。例如，若模型的AUC為0.9，說明該模型在區(qū)分肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者方面具有較強(qiáng)的能力，能夠較好地將兩者區(qū)分開來。4.3模型性能結(jié)果經(jīng)過內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證，基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型展現(xiàn)出良好的性能表現(xiàn)。在內(nèi)部驗(yàn)證中，模型通過十折交叉驗(yàn)證，準(zhǔn)確率平均值達(dá)到了[X]%，這意味著模型在訓(xùn)練集內(nèi)能夠準(zhǔn)確分類大部分樣本，有效區(qū)分肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者；敏感度平均值為[X]%，表明模型能夠較好地檢測出真正患有肺結(jié)核的患者，降低漏診風(fēng)險(xiǎn)；特異度平均值為[X]%，說明模型對(duì)健康對(duì)照者的判斷準(zhǔn)確性較高，減少誤診情況。在外部驗(yàn)證中，模型在獨(dú)立的外部樣本上依然保持了較好的診斷能力。敏感度為[X]%，特異度為[X]%，陽性預(yù)測值為[X]%，陰性預(yù)測值為[X]%。這些結(jié)果表明，模型不僅在訓(xùn)練集內(nèi)表現(xiàn)出色，在不同來源的樣本中也具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠穩(wěn)定地發(fā)揮診斷作用。為了更直觀地評(píng)估模型的診斷效能，繪制了受試者工作特征（ROC）曲線，并計(jì)算了曲線下面積（AUC）。模型的AUC達(dá)到了[X]，AUC越接近1，代表模型區(qū)分正樣本（肺結(jié)核患者）和負(fù)樣本（健康對(duì)照者）的能力越強(qiáng)。本研究中模型的AUC值較高，說明該模型在肺結(jié)核診斷方面具有較強(qiáng)的判別能力，能夠有效地區(qū)分肺結(jié)核患者和健康人群。與傳統(tǒng)的肺結(jié)核診斷方法相比，基于microRNAs的診斷模型具有顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法敏感度僅為20-40%，而本模型敏感度達(dá)到[X]%，大幅提高了對(duì)肺結(jié)核患者的檢測能力，減少漏診。結(jié)核菌培養(yǎng)雖為診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其培養(yǎng)時(shí)間長達(dá)2-8周，本模型則能快速得出診斷結(jié)果，滿足臨床快速診斷需求。胸部影像學(xué)檢查如X線和CT，在早期或不典型病例中易漏診或誤診，且CT費(fèi)用高、有輻射，而本模型基于血液樣本檢測，操作相對(duì)簡便，成本較低，對(duì)患者無輻射傷害。在分子生物學(xué)檢測方面，傳統(tǒng)PCR技術(shù)易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作人員要求高，本模型通過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理和模型構(gòu)建，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性更高。綜上所述，基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型在性能上表現(xiàn)優(yōu)異，與傳統(tǒng)診斷方法相比具有明顯優(yōu)勢，有望為肺結(jié)核的早期診斷提供一種新的、有效的手段，提高肺結(jié)核的診斷準(zhǔn)確性和效率，對(duì)結(jié)核病的防控具有重要意義。五、模型在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值5.1臨床診斷輔助作用在肺結(jié)核臨床診斷過程中，基于microRNAs的診斷模型具有重要的輔助作用，能為醫(yī)生提供多方面的有效信息，顯著提升診斷的準(zhǔn)確性和效率。在面對(duì)疑似肺結(jié)核患者時(shí)，醫(yī)生往往需要綜合多種檢查結(jié)果來判斷病情。傳統(tǒng)診斷方法存在一定局限性，而本診斷模型可作為一項(xiàng)重要的補(bǔ)充指標(biāo)。例如，對(duì)于一些癥狀不典型、胸部影像學(xué)表現(xiàn)模糊的患者，僅依靠傳統(tǒng)方法難以確診。此時(shí)，通過檢測患者血液樣本中特定microRNAs的表達(dá)水平，將數(shù)據(jù)輸入診斷模型，模型能夠根據(jù)預(yù)設(shè)的算法和參數(shù)，快速分析并輸出診斷結(jié)果，輔助醫(yī)生判斷患者是否患有肺結(jié)核。在實(shí)際臨床案例中，[列舉具體案例]患者因咳嗽、低熱等癥狀就診，胸部X線檢查顯示肺部有模糊陰影，但難以明確是肺結(jié)核還是其他肺部疾病。通過本診斷模型對(duì)其血液樣本進(jìn)行分析，結(jié)果高度提示肺結(jié)核，隨后進(jìn)一步的結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)了模型的診斷，使患者得以及時(shí)確診并接受治療。診斷模型的高準(zhǔn)確性有助于提高診斷的可靠性，減少誤診和漏診情況的發(fā)生。傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法敏感度較低，容易漏診，而結(jié)核菌培養(yǎng)時(shí)間長，在等待結(jié)果期間可能延誤治療。本模型通過對(duì)大量樣本的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，能夠準(zhǔn)確識(shí)別肺結(jié)核患者與健康人群之間的差異，敏感度和特異度較高。研究表明，本模型的敏感度達(dá)到[X]%，特異度達(dá)到[X]%，相比傳統(tǒng)方法有顯著提升。這意味著在實(shí)際應(yīng)用中，模型能夠更準(zhǔn)確地檢測出真正的肺結(jié)核患者，避免漏診；同時(shí)，也能更準(zhǔn)確地排除健康人，減少誤診。對(duì)于一些菌陰肺結(jié)核患者，由于痰液中難以檢測到結(jié)核菌，傳統(tǒng)診斷方法容易漏診，而本模型基于血液樣本檢測，不受痰液結(jié)核菌檢測的限制，能夠提高菌陰肺結(jié)核的診斷率。在臨床實(shí)踐中，將診斷模型與傳統(tǒng)診斷方法相結(jié)合，能夠發(fā)揮更大的優(yōu)勢。例如，先通過胸部影像學(xué)檢查初步篩查出疑似肺結(jié)核患者，再利用本診斷模型對(duì)這些患者進(jìn)行進(jìn)一步檢測，可提高診斷的準(zhǔn)確性和效率。對(duì)于一些難以確診的患者，還可以結(jié)合結(jié)核菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測等方法，綜合判斷病情。通過這種多方法聯(lián)合診斷的方式，能夠?yàn)榛颊咛峁└鼫?zhǔn)確、全面的診斷結(jié)果，為后續(xù)的治療方案制定提供有力依據(jù)，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。5.2潛在經(jīng)濟(jì)效益分析基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出顯著的潛在經(jīng)濟(jì)效益，從多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)為醫(yī)療資源的合理利用和成本控制提供了有力支持。在縮短診斷時(shí)間方面，傳統(tǒng)的結(jié)核菌培養(yǎng)作為肺結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，培養(yǎng)時(shí)間通常需要2-8周，這期間患者不僅承受著疾病的痛苦，還可能因未及時(shí)確診而延誤治療，同時(shí)占用著醫(yī)療資源。而本診斷模型基于血液樣本中microRNAs的檢測，結(jié)合高效的算法分析，能夠在短時(shí)間內(nèi)得出診斷結(jié)果，一般可在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)完成，大大縮短了患者等待診斷的時(shí)間?？焖僭\斷使得患者能夠及時(shí)接受針對(duì)性治療，減少了因診斷延遲導(dǎo)致的病情惡化風(fēng)險(xiǎn)，降低了后續(xù)治療的復(fù)雜性和成本。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，縮短診斷時(shí)間可使患者平均住院天數(shù)減少[X]天，以平均每天住院費(fèi)用[X]元計(jì)算，每例患者可節(jié)省住院費(fèi)用[X]元。對(duì)于大規(guī)模的肺結(jié)核患者群體而言，這將節(jié)省大量的醫(yī)療資源和患者的經(jīng)濟(jì)支出。減少不必要檢查是本診斷模型帶來的另一重要經(jīng)濟(jì)效益。在傳統(tǒng)診斷過程中，對(duì)于疑似肺結(jié)核患者，往往需要進(jìn)行多項(xiàng)檢查，如涂片抗酸染色、胸部X線、CT檢查以及多次的結(jié)核菌培養(yǎng)等。這些檢查不僅耗費(fèi)大量的醫(yī)療資源，也增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。例如，胸部CT檢查每次費(fèi)用約為[X]元，若能通過本診斷模型準(zhǔn)確判斷，減少不必要的CT檢查次數(shù)，將為患者節(jié)省可觀的費(fèi)用。本診斷模型憑借其較高的準(zhǔn)確性，能夠在早期準(zhǔn)確判斷患者是否患有肺結(jié)核，避免了對(duì)非肺結(jié)核患者進(jìn)行不必要的檢查。研究表明，使用該診斷模型后，不必要檢查的減少比例可達(dá)[X]%，有效降低了醫(yī)療成本。在優(yōu)化治療方案方面，本診斷模型也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)診斷方法由于準(zhǔn)確性有限，可能導(dǎo)致部分患者接受不恰當(dāng)?shù)闹委?，如?duì)非肺結(jié)核患者進(jìn)行抗結(jié)核治療，不僅浪費(fèi)醫(yī)療資源，還可能給患者帶來藥物不良反應(yīng)和經(jīng)濟(jì)損失。本診斷模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分肺結(jié)核患者和健康人群，以及不同類型的肺結(jié)核患者，為醫(yī)生制定精準(zhǔn)的治療方案提供依據(jù)。對(duì)于耐藥肺結(jié)核患者，模型能夠通過檢測相關(guān)microRNAs，輔助判斷耐藥情況，幫助醫(yī)生選擇更有效的抗結(jié)核藥物，避免盲目用藥，提高治療效果，減少因治療失敗導(dǎo)致的重復(fù)治療費(fèi)用。通過優(yōu)化治療方案，可使肺結(jié)核患者的治療成功率提高[X]%，平均治療費(fèi)用降低[X]%，同時(shí)減少了患者因治療周期延長而產(chǎn)生的間接經(jīng)濟(jì)損失，如誤工費(fèi)等。綜上所述，基于microRNAs的肺結(jié)核診斷模型在縮短診斷時(shí)間、減少不必要檢查和優(yōu)化治療方案等方面具有顯著的潛在經(jīng)濟(jì)效益，有望為肺結(jié)核的防控帶來積極的經(jīng)濟(jì)影響，在醫(yī)療資源有