.前言抗生素的發(fā)展情況與耐藥性抗生素，作為一類可以選擇性抑制細菌、真菌、病毒及腫瘤的小分子化合物，它們可以產(chǎn)生于各種生物體的生理活動，亦可通過化學(xué)合成或半合成手段獲取，從此人們面對許多疾病不再無藥可用。自20世紀的英國細菌學(xué)家弗萊明開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了首個抗生素開始，抗生素領(lǐng)域便蓬勃發(fā)展，至今已經(jīng)有超過31個大類、160種以上的抗生素，其中有數(shù)以百計的品種在生產(chǎn)實踐中被廣泛應(yīng)用（衣云鵬，2018）。但是放眼全球近四十年來，抗生素的研究進入瓶頸，新型藥物研發(fā)速率放緩，依據(jù)資料顯示僅有數(shù)個新結(jié)構(gòu)的抗生素獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）的批準（方媛瑗等，2018）即利奈唑胺，泰地唑胺，達托霉素，非達霉素等為數(shù)不多的藥物（李云鴿，2019）?？股負碛凶吭降寞熜Ш偷投镜奶匦裕褂脠鼍皹O其廣泛，使用量也逐年攀升。但與此同時，超時、超量以及不恰當使用抗生素的情況也屢見不鮮?？股氐臑E用不僅容易損害動物的健康，也使得部分病原菌在與抗生素的反復(fù)接觸中逐漸產(chǎn)生耐藥性甚至成為超級細菌。在諸多實驗和調(diào)查中都顯示隨著細菌接觸藥物的次數(shù)增加，藥物對于該菌的效力會顯著下降。由抗生素濫用引發(fā)的細菌耐藥性，已成為醫(yī)學(xué)界急需解決的問題。據(jù)WHO報道，全球平均每年有1700多萬人死于各類傳染性疾病，其中耐藥菌株的出現(xiàn)及廣泛傳播是引起上述疾病的主要原因之一（蔣紅霞等，2001）。此外，畜牧業(yè)中，由于耐藥菌感染引起的傳染病不能得到有效控制，導(dǎo)致大規(guī)模動物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失（賴麗虹，2016）。所以研究出作用機制與其他抗生素不同，具有良好的醫(yī)療效果的抗生素是極為重要的研究方向。研究人員通過修改已經(jīng)問世的藥物結(jié)構(gòu)，創(chuàng)造了一系列抗生素的衍生物，而其中的一部分的衍生物可以發(fā)揮更加強勁的效力，可以為人所用。1.2截短側(cè)耳素簡介【截短側(cè)耳素結(jié)構(gòu)式】【英文名】pleuromutilin【中文名】截短側(cè)耳素截短側(cè)耳素【分子式】C22H34O5【分子量】378.51【性狀】白色至類白色結(jié)晶性粉末，溶于乙醇、氯仿和丙酮等。熔點:167～168℃哥倫比亞大學(xué)科學(xué)家Kavanagh于1951年首次報道了從兩種屬于擔子菌綱側(cè)耳屬的菌類中分離出了具有抗菌活性的真菌代謝物，之后的研究證明了其有抗金黃葡萄球菌活性并確定了分子式，之后也確定了具體的分子結(jié)構(gòu)。研究證明截短側(cè)耳素具有較為溫和的體外抗革蘭氏陽性菌活性和不過于強力的體內(nèi)抗菌活性（DrewsJetal.,1975）。它可以選擇性的抑制原核細胞蛋白質(zhì)的合成，從而抑制多種革蘭氏陽性菌和支原體的生長，對真核細胞蛋白質(zhì)的合成沒有影響，也不與哺乳動物的核糖體相互作用，且不易與其他抗生素產(chǎn)生聯(lián)合耐藥性（劉惠嫻，2015）。截短側(cè)耳素及其衍生物在目前這般諸多抗生素由于細菌耐藥性顯得越發(fā)力不從心的情況下引起了廣泛的關(guān)注，成為了許多科研人員的研究對象，并開發(fā)了泰妙菌素和沃尼妙林及瑞莫他林等藥物，從獸用到人用不一而足，截短側(cè)耳素類抗生素的研究得到了長足的發(fā)展。1.3截短側(cè)耳素類藥物藥理學(xué)原理蛋白質(zhì)是生物不可缺少的重要部分，在眾多生理活動里扮演極其重要的作用。截短側(cè)耳素是一種具有抗菌作用的藥物，它的主要作用方式是作用于目標細菌的核糖體，使細菌的蛋白質(zhì)無法正常合成。核糖體是生物合成蛋白質(zhì)的重要場所，而不同類型的生物的核糖體構(gòu)成不同，據(jù)研究表明細菌的核糖體沉降系數(shù)為70S，被稱為70S核糖體，具體而言其由30S和50S亞基組成，而與之不同的，哺乳動物即用藥對象的核糖體沉降系數(shù)為80S，由40S和60S亞基組成，其構(gòu)成與細菌核糖體不同，所以可以在選擇藥物時選擇作用于細菌的30S或50S亞基的化合物是抑制細菌核糖體合成蛋白質(zhì)的關(guān)鍵，同時這種藥物不會影響宿主細胞蛋白質(zhì)的合成（周偉澄，2007）。這種藥理機制使得截短側(cè)耳素類抗生素具有與其他類型抗生素不同的抗菌特性，所以可以通過研發(fā)并使用截短側(cè)耳素類藥物以避免細菌的抗藥性。截短側(cè)耳素類抗生素的抗菌譜很廣，可以對大部分的革蘭氏陽性菌和陰性菌起到抑制或者殺滅的作用。根據(jù)相關(guān)研究，截短側(cè)耳素發(fā)揮作用的是其結(jié)構(gòu)中的三環(huán)骨架，一般與細菌的核糖體的肽酰轉(zhuǎn)移酶中心發(fā)生作用，導(dǎo)致其亞基發(fā)生重排從而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。截短側(cè)耳素的作用機理可以從分子層面解釋，截短側(cè)耳素及其衍生物的三環(huán)骨架即母核部分對細菌的核糖體中50S亞基的部分有著更高的親和力。母核結(jié)構(gòu)中的一些基團可以和細菌核糖體中的特定殘基以疏水鍵的形式相互作用，這些作用使得截短側(cè)耳素能夠固定在肽酰轉(zhuǎn)移酶中心以干擾細菌核糖體。C3位的酮基與核糖體中的A2451和C2452也存在相互作用，這些相互作用共同形成了截短側(cè)耳素抑制蛋白質(zhì)合成的分子層面的原理（DreierIetal.，2014；LolkLetal.，2008）。不同類型的截短側(cè)耳素類抗生素抗菌效果不同，這是由于不同的截短側(cè)耳素衍生物藥品的結(jié)構(gòu)設(shè)計不同。根據(jù)研究表明引起不同的截短側(cè)耳素衍生物的抗菌活性出現(xiàn)差異的原因是其特定殘基不同，這可以說明不同的截短側(cè)耳素衍生物的結(jié)合位點是各自特定的殘基，而這往往是由于截短側(cè)耳素接入了不同的側(cè)鏈引起的。截短側(cè)耳素衍生物所接入的不同側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)可以影響到細菌的rRNA引起不同的變化，從而導(dǎo)致截短側(cè)耳素衍生物的生物活性不一(EggerHetal.,1976;LongKSetal.2006)。此外，活化母核上不同的碳會產(chǎn)生不同效果，活化并且對C14側(cè)鏈進行修飾可以得到活性較好的截短側(cè)耳素衍生物，同時對C14側(cè)鏈的修飾也可以改善藥物的溶解性，提高生物利用度且不會改變截短側(cè)耳素發(fā)揮活性所必須的基團。本研究即通過活化C14側(cè)鏈的取代羥基連接4-氨基苯硫酚進行含吡啶側(cè)鏈的截短側(cè)耳素類藥物的合成。本實驗采用4-氨基苯硫酚充當連接基團，較為便利地連接截短側(cè)耳素與其他化合物。4-氨基苯硫酚先與截短側(cè)耳素母核14號位側(cè)鏈中活化的取代基反應(yīng)，之后其氨基基團可以與本實驗所用的6-氯煙酰氯等發(fā)生縮合形成酰胺，形成含吡啶側(cè)鏈的截短側(cè)耳素衍生物。2以4-氨基苯硫酚為鏈接基團的含吡啶側(cè)的鏈截短側(cè)耳素衍生物的設(shè)計與合成2.1.1原料與試劑截短側(cè)耳素、對甲苯磺酰氯、4-氨基苯硫酚、6-氯煙酰氯、2-氯煙酰氯、氯化煙堿鹽酸鹽、二氧化硅、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、碳酸鉀、無水硫酸鈉、無水硫酸鋁（添加在有機溶劑內(nèi)去除水分，需要通過抽濾將除水后的有機溶劑與其分離）、茚三酮試劑2.1.2主要實驗儀器紫外分析儀、旋蒸儀、反應(yīng)瓶、旋干瓶等2.1.3主要軟件ChemBioDrawUltra20.0、mestrenova以及Prism2.2研究內(nèi)容本實驗主題為以4-氨基苯硫酚作為連接基團連接截短側(cè)耳素與含吡啶的側(cè)鏈，為此進行了實驗設(shè)計并進行合成，最后以抗菌活性檢測評價產(chǎn)物的生物活性。實驗將原料截短側(cè)耳素與對甲苯磺酰氯反應(yīng)，以活化截短側(cè)耳素母核上14號位側(cè)鏈中的取代羥基，得中間體Ⅰ對甲苯磺?；囟虃?cè)耳素，用于下步反應(yīng)。以對甲苯磺?；囟虃?cè)耳素與4-氨基苯硫酚在加熱回流條件下反應(yīng)合成得到中間體Ⅱ粗品，用于下步反應(yīng)。硅膠柱純化后將上述中間體Ⅱ粗品經(jīng)硅膠柱純化后，得到純凈的中間體Ⅱ用于下步反應(yīng)。以吡啶環(huán)上含有不同取代基的吡啶酰氯與上述截短側(cè)耳素中間體Ⅱ在室溫條件下反應(yīng)得到最終的目標化合物。運用質(zhì)譜、核磁等檢測方法對得到的產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)表征，以確證所得截短側(cè)耳素衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。最后測定產(chǎn)物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度以判斷其生物活性，研究以4-氨基苯硫酚為連接基團連接截短側(cè)耳素與吡啶側(cè)鏈后產(chǎn)生的活性影響。研究效果：設(shè)計并合成出3種不同的含以4-氨基苯硫酚為連接基團的含吡啶側(cè)鏈的截短側(cè)耳素衍生物。實驗可行性及理論依據(jù)：本實驗室在過去已經(jīng)進行了較多截短側(cè)耳素類衍生物的設(shè)計與合成方面的探索，獲得了活性較高的一些截短側(cè)耳素衍生物，目前正在進一步合成新型截短側(cè)耳素衍生物，擁有理論基礎(chǔ)與指導(dǎo)，預(yù)計本實驗?zāi)軌蝽樌瓿?。此外本試驗單位先后對截短?cè)耳素類藥物進行了系統(tǒng)研究。上述研究均為本研究奠定了一定的專業(yè)基礎(chǔ)及實踐經(jīng)驗。本項目研究所需儀器設(shè)備學(xué)院均有，不需要另外購買大型儀器設(shè)備。綜上所述，本研究預(yù)計可以順利完成。2.3實驗步驟及結(jié)果中間體Ⅰ制備的一般程序：將10.0g(26.5mmol)截短側(cè)耳素溶于20mL乙腈中，并置于冰浴條件下，將5.6g(29.2mmol)對甲基苯磺酰氯緩慢加入上述溶液中，3分鐘后緩慢滴加(1-2滴/秒)6mol/L的氫氧化鈉溶液12ml?；旌弦涸诒∠聰嚢璺磻?yīng)30分鐘后撤去冰浴，再反應(yīng)3小時左右，用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程(展開劑比例為二氯甲烷：乙酸乙酯：石油醚=1:1:2)，當觀測到原料點淡化至消失，即反應(yīng)結(jié)束。旋蒸除去溶劑后，將反應(yīng)液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷進行二次萃取，加入適量無水硫酸鈉除水，取有機相再次旋蒸，加入乙醇進行重結(jié)晶（通過加熱讓溶劑解產(chǎn)物，再降溫析出），抽濾，烘干，即可得中間體Ⅰ中間體Ⅱ制備的一般程序：4-氨基苯硫醇固體提前拿出在旋蒸水浴鍋里復(fù)溫。稱取截酯溶于30-50mL乙酸乙酯，將反應(yīng)瓶置于電子秤上稱量滴加相應(yīng)重量的4-氨基苯硫醇。小燒杯稱適量NaOH溶于水中，盡量達到飽和溶液狀態(tài)。溶解時攪拌并冰浴降溫。將NaOH水溶液滴加入反應(yīng)瓶中。反應(yīng)瓶置于油浴鍋中70°C回流攪拌反應(yīng)2-3h。TLC監(jiān)測反應(yīng)進度，展開劑PE:EA=2:1，產(chǎn)物極性變大。旋蒸除去瓶中EA，用二氯甲烷和飽和食鹽水萃取，適量100-200目硅膠吸附。過柱純化，洗脫劑DCM:ME=200:1,旋干溶劑得白色輕質(zhì)粉末，即可得中間體Ⅱ目標產(chǎn)物制備的一般程序：將中間體Ⅱ溶解在3ml二氯甲烷中，在冰鹽浴條件下加入1.1~1.2當量的2-氯煙酰氯/6-氯煙酰氯/氯化煙堿鹽酸鹽，再加入2當量無水碳酸鉀，在冰鹽浴條件下攪拌反應(yīng)2~3小時。以薄層色譜法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程，由于基團特性，茚三酮可以與未反應(yīng)完全的截短側(cè)耳素對甲苯磺酸酯顯色，若是原料均反應(yīng)完成，則茚三酮無法使薄層色譜板上的樣品點顯色。反應(yīng)結(jié)束后依次加入水進行淬滅和二氯甲烷進行3次萃取，取其有機相加入適量無水碳酸鈉/無水硫酸鎂干燥，攪拌至無水硫酸鈉呈粉末無結(jié)塊狀且試劑澄清透明，取有機相；所得有機相旋轉(zhuǎn)蒸干即可得粗產(chǎn)物。粗品經(jīng)硅膠柱層析純化得到目標產(chǎn)物。產(chǎn)物純度檢測：通過核磁共振氫譜與碳譜確認以不同原料制得的產(chǎn)物的純度純度檢測結(jié)果（氫譜）：原料為6-氯煙酰氯的產(chǎn)物:1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.51(1H,s),8.94–8.89(1H,m),8.35–8.28(1H,m),7.72(2H,t,J=8.1Hz),7.70–7.61(1H,m),7.39(2H,d,J=8.7Hz),6.07(1H,dd,J=17.6,11.3Hz),5.52(1H,d,J=8.3Hz),5.04–5.00(1H,m),5.00–4.97(1H,m),4.50(1H,d,J=6.1Hz),3.84–3.72(2H,m),3.40(1H,t,J=6.0Hz),2.38(1H,d,J=2.5Hz),2.23–2.14(1H,m),2.11–1.96(3H,m),1.68–1.56(2H,m),1.47(1H,ddt,J=14.5,7.4,3.8Hz),1.39(1H,td,J=13.4,3.4Hz),1.33(3H,s),1.30–1.26(1H,m),1.23(1H,dt,J=13.9,3.9Hz),1.15(1H,d,J=15.9Hz),1.02(4H,s),0.81(3H,d,J=7.0Hz),0.59(3H,d,J=7.0Hz).2-氯煙酰氯1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.68(1H,s),8.54(1H,dd,J=4.8,2.0Hz),8.06(1H,dd,J=7.6,1.9Hz),7.65(2H,d,J=8.7Hz),7.57(1H,dd,J=7.5,4.8Hz),7.38(2H,d,J=8.7Hz),6.20–5.95(1H,m),5.52(1H,d,J=8.3Hz),5.04–4.94(2H,m),4.49(1H,d,J=6.1Hz),3.88–3.66(2H,m),3.39(1H,t,J=6.1Hz),2.38(1H,d,J=2.7Hz),2.24–2.13(1H,m),2.12–2.02(2H,m),2.01–1.96(1H,m),1.70–1.56(2H,m),1.47(1H,ddt,J=10.2,7.1,3.4Hz),1.39(1H,ddd,J=16.3,11.6,3.3Hz),1.33(3H,s),1.30–1.26(1H,m),1.25–1.22(1H,m),1.09(1H,d,J=16.0Hz),1.01(4H,s),0.81(3H,d,J=7.0Hz),0.59(3H,d,J=7.1Hz).氯化煙堿1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.47(1H,s),9.11–9.08(1H,m),8.77(1H,dd,J=4.9,1.6Hz),8.28(1H,dt,J=8.0,1.9Hz),7.74(2H,d,J=8.7Hz),7.57(1H,ddd,J=7.8,4.8,0.9Hz),7.38(2H,d,J=8.7Hz),6.07(1H,dd,J=17.6,11.4Hz),5.52(1H,d,J=8.4Hz),5.04–4.97(2H,m),4.49(1H,d,J=6.2Hz),3.83–3.71(2H,m),3.40(1H,t,J=6.1Hz),2.40–2.36(1H,m),2.22–2.14(1H,m),2.10–1.97(3H,m),1.68–1.58(2H,m),1.47(1H,ddd,J=12.3,7.1,3.3Hz),1.39(1H,td,J=13.5,3.4Hz),1.33(3H,s),1.30–1.25(1H,m),1.23(1H,dd,J=10.5,3.6Hz),1.16–1.10(1H,m),1.02(4H,s),0.81(3H,d,J=7.0Hz),0.59(3H,d,J=7.1Hz).純度檢測結(jié)果（碳譜）：6-氯煙酰氯13CNMR(151MHz,CDCl3)δ217.26(C3),,168.27(C21),162.79,151.79,147.99,140.29,138.94(C19),138.16,136.55,131.41,124.98,124.61,120.95,117.27(C20),74.60(C11),69.67(C14),58.20(C4),45.46(C9),44.79(C13),43.90(C12),41.78(C5),37.72(C6),36.77(C10),36.00(C2),34.49(C22),30.41(C8),26.83(C7),26.37(C18),24.83(C1),16.78(C16),14.88(C15),11.50(C17).2-氯煙酰氯13CNMR(151MHz,CDCl3)δ217.14(C3),168.19(C21),162.57,151.42,146.93,140.00,138.91(C19),136.47,131.61,131.31,131.02,123.00,120.69,117.28(C20),74.61(C11),69.59(C14),58.19(C4),45.45(C9),44.77(C13),43.87(C12),41.77(C5),37.76(C6),36.77(C10),35.99(C2),34.46(C22),30.42(C8),26.83(C7),26.34(C18),24.84(C1),16.77(C16),14.88(C15),11.51(C17).氯化煙堿鹽酸鹽13CNMR(151MHz,CDCl3)δ217.22(C3),168.28(C21),163.81,152.40,147.73,138.95(C19),137.56,136.90,135.64,131.55,130.72,123.82,120.89,117.26(C20),74.61(C11),69.62(C14),58.20(C4),45.45(C9),44.78(C13),43.90(C12),41.78(C5),37.82(C6),36.77(C10),36.00(C2),34.48(C22),30.42(C8),26.83(C7),26.36(C18),24.84(C1),16.77(C16),14.88(C15),11.51(C17).合成階段總結(jié)：經(jīng)過分析與繪圖進行對照，可以判斷本實驗合成的以4-氨基苯硫酚為連接的含吡啶側(cè)鏈的截短側(cè)耳素衍生物產(chǎn)物純度在95%以上，合成路線可行性強，穩(wěn)定性高，可以進行體外活性檢測以初步評價此藥物抗菌效果。3目標化合物的生物活性研究3.1.1原料與試劑mh肉湯培養(yǎng)基mh肉湯bhi肉湯純水吐溫80泰妙菌素樣品萬古霉素樣品沃尼妙林樣品瓊脂粉瓊脂培養(yǎng)基制作方法：20g瓊脂粉與500ml純水配置完成，在高壓滅菌鍋內(nèi)加熱溶解，冷卻至50℃左右傾于適量一次性平板中，冷卻凝固后置于冰箱內(nèi)保存。高壓滅菌鍋設(shè)置為：溫度121℃，持續(xù)20分鐘。3.1.2實驗器材移液槍超凈臺高壓滅菌鍋96孔板各類培養(yǎng)皿、試劑瓶注射器注：所使用器材均需高壓滅菌，防止污染。使用超凈臺時注意消毒，避免影響實驗結(jié)果。3.2研究內(nèi)容與目的sourceType":"answer","sourceId":3056145668}"最小抑菌濃度

(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)的含義是在加入了藥物的肉湯或培養(yǎng)基等體外的載體上培養(yǎng)細菌一定時間后進行檢測，可以發(fā)現(xiàn)藥物在達到某一濃度后即可抑制細菌的正常生長繁殖，這一藥物濃度即為最小抑菌濃度，是評價sourceType":"answer","sourceId":3056145668}"抗生素等藥物的抗菌活性的一個重要指標。sourceType":"answer","sourceId":3056145668}"最小殺菌濃度

(MinimumBactericidalConcentration,MBC)指殺死99.9%的目標的sourceType":"answer","sourceId":3056145668}"微生物所需的最低藥物濃度。MIC，MBC也能展現(xiàn)目標細菌的抗藥性對藥效的影響。對于實驗結(jié)果而言，數(shù)值越低的MIC，MBC說明較少的藥物就可以達到抑菌、滅菌的效果，即MIC、MBC低的藥物對細菌的作用會更好。稀釋法是進行抗菌藥物體外活性檢測的常用手段，稀釋法藥敏試驗的常用實驗方法主要是肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法，這兩種稀釋的方式在原理上基本一致，流程也近乎相同，它們主要區(qū)別在于所使用的培養(yǎng)基是不一樣的。瓊脂稀釋法是指將一定濃度的抗菌藥物稀釋至不同濃度后接種受試菌株，在適宜條件下經(jīng)一定時間培養(yǎng)后觀測菌株在藥物濃度不同的培養(yǎng)基內(nèi)的繁殖發(fā)展的結(jié)果，經(jīng)過對比可定量顯示出該藥物的最小抑菌濃度（李云鴿，2019）。肉湯稀釋法是本研究所使用的MIC測定方法，在超凈臺內(nèi)使用潔凈96孔板對藥物進行梯度稀釋，可以同時測定多個藥物且可以方便快捷地進行對照組的實驗，在適宜環(huán)境培養(yǎng)一段時間后可以進行觀測，未渾濁的孔位代表細菌被抑制無法生長。3.3實驗方法本實驗采用微量肉湯稀釋法來測定最小抑菌濃度以及最小殺菌濃度，通過對目標化合物的MIC值和MBC值完成初步生物活性評價。3.3.1實驗菌種金黃色葡萄球菌：ATCC43300（MRSA）3.3.2藥液配制分別精密稱取6.4mg萬古霉素、泰妙菌素以及三種目標化合物，于250μLDMSO中溶解，搖勻后添加250μL吐溫80，最后加入4500μL超純水，將藥物配制成濃度為1280μg/mL的母液。在超凈工作臺中，用去除針頭的注射器吸取母液，然后使用0.22μm的微孔濾膜對藥液進行過濾，隨后將其放置于4℃冰箱中保存，備用。3.3.3菌液配制用接種環(huán)將儲存在4℃冰箱中保存的金黃色葡萄球菌菌株接種至培養(yǎng)基上，隨后放到恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24小時之后取出，挑選大小合適、長勢優(yōu)良的單個菌落使用接種環(huán)接種到裝有高壓滅菌后的BHI肉湯中。接好菌種的EP管固定于搖床中，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)4.5小時后獲得菌液。3.3.4目標化合物最小抑菌濃度（MIC）的測定（1）在超凈工作臺上，取一個96孔滴定板，自上而下各排標號，A至H共八排。向A-F各排第一孔添加180μL無菌mh肉湯，A-H各排其余孔添加100μL無菌BHI肉湯。（2）用移液槍吸取20μL配制好的目標化合物1母液（濃度為1280μg/mL）添加進ABC排的第一個孔中，吸取20μL配制好的目標化合物2母液（濃度為1280μg/mL）添加進DEF排的第一個孔中，將母液加入每個孔中的同時進行充分反復(fù)吹打混勻。用移液槍從上一步驟中已經(jīng)添加了液體的排中的第一個孔中吸取100μL混合液轉(zhuǎn)移至其對應(yīng)排的第二孔中，進行充分的反復(fù)吹打混勻，重復(fù)上述操作至第十二個孔，最后用移液槍吸取100μL第十二孔中混合液棄去。此時A~F排每孔藥物濃度依次是128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06μg/mL。（3）移液槍取培養(yǎng)完畢菌液500μL與20mL潔凈肉湯混合，吹打40次以上使稀釋液各部分濃度一致。用移液槍向A~H各孔加入100μL稀釋后的菌液，此時A-F排每孔藥物濃度依次是64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03μg/mL。（4）在第G排各孔添加200μL無菌BHI肉湯作陰性對照，第H排各孔添加100μL無菌BHI肉湯以及100μL稀釋后的菌液作陽性對照。（5）重復(fù)上述實驗步驟將配制好的目標化合物、泰妙菌素母液（濃度均為1280μg/mL）稀釋至各孔內(nèi)并添加菌液。每株菌做三次平行實驗。（6）將配制好的96孔滴定板在在37℃環(huán)境中靜置恒溫培養(yǎng)24小時后，取出，觀察結(jié)果。結(jié)果判讀時在光線良好的情況下觀察滴定板，孔內(nèi)若有渾濁現(xiàn)象，則說明有菌生長；孔內(nèi)若是澄清狀態(tài)，則說明無菌生長。滴定板每排各孔從右往左觀察，以第一個出現(xiàn)澄清狀態(tài)的孔的濃度視為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。具體而言，以肉眼觀察96孔板，最后一排陽性對照組液體明顯變渾濁，倒數(shù)第二排陰性對照組液體澄清，證明細菌正常繁殖生長，此時其余排中第一個未變渾濁的孔為藥物的最小抑菌濃度（MIC）。當出現(xiàn)單個的跳孔時，記錄抑制有細菌生長的藥物濃度最高的孔的濃度值作為MIC值。3.3.5目標化合物最小殺菌濃度（MBC）的測定（1）觀察完藥物的MIC24小時之后，取數(shù)個BHI肉湯瓊脂板于超凈工作臺中，使用移液槍移取100μL各個澄清孔的混合液于板上均勻涂布。（2）菌液均勻分布且瓊脂平板表面干燥后在37℃環(huán)境中靜置恒溫培養(yǎng)24小時后，取出培養(yǎng)箱中的固體培養(yǎng)基進行觀察，結(jié)果判定：若在平板觀察到細菌的特征性菌落，則說明有細菌生長；若不能觀察到菌落，則說明無菌生長。第一個出現(xiàn)無菌生長的藥液濃度視為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。3.3.6活性檢測結(jié)果及分析本實驗不同原料的截短側(cè)耳素衍生物對金黃色葡萄球菌ATCC43300的MIC測定藥物原料渾濁孔位最小抑菌濃度（μg/mL）2-氯煙酰氯120.036-氯煙酰氯120.03氯化煙堿鹽酸鹽120.03本實驗對照藥物對金黃色葡萄球菌ATCC43300的MIC測定藥物名稱渾濁孔位最小抑菌濃度（μg/mL）泰妙菌素90.25萬古霉素62沃尼妙林110.06本實驗不同原料的截短側(cè)耳素衍生物對金黃色葡萄球菌ATCC43300的MBC測定藥物原料最小殺菌濃度（μg/mL）2-氯煙酰氯0.256-氯煙酰氯0.06氯化煙堿鹽酸鹽0.5本實驗對照藥物對金黃色葡萄球菌ATCC43300的MIC測定藥物名稱最小殺菌濃度（μg/mL）泰妙菌素1萬古霉素8沃尼妙林0.06對照試驗中使用了泰妙菌素、萬古霉素、沃尼妙林三種已經(jīng)上市的藥物作為本實驗合成的三種截短側(cè)耳素衍生物的對照組以參考，經(jīng)過對比可知，本實驗合成的藥物具有一定的抗菌活性，有一定的研究價值。4全文總結(jié)本實驗先是設(shè)計并合成了三個分別以6-氯煙酰氯/2-氯煙酰氯/氯化煙堿鹽酸鹽為原料的以4-氨基苯硫酚為連接基團的含吡啶側(cè)鏈的截短側(cè)耳素衍生物，確認合成產(chǎn)物純度后用肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度以及最小殺菌濃度進行體外活性檢測以確定此實驗合成出的藥物對金黃色葡萄球菌的抗菌活性。結(jié)果表明本實驗藥物活性較強，有一定價值。未來展望：截短側(cè)耳素類衍生物在我國目前集約化養(yǎng)殖快速發(fā)展、抗生素使用難以減少的大環(huán)境下作為一種與傳統(tǒng)的抗生素作用機制不同且高效的藥物將在未來的畜牧行業(yè)中大有可為，會成為重要的一類抗生素，而對于截短側(cè)耳素衍生物的探究也會是一個龐大的課題，有許多可以探索研究之處，充滿了無限的可能。人類和細菌耐藥性之間的比拼并非是可以一蹴而就，需要專業(yè)人士再接再厲，探究藥物原理，深究細菌耐藥的機制，確認藥物結(jié)構(gòu)變化的作用，做到知己知彼，有的放矢，產(chǎn)出可以避免細菌產(chǎn)生耐藥性并高效抑菌殺菌的藥物，在人類的減少感染性疾病的路徑中做出貢獻。5參考文獻衣云鵬截短側(cè)耳素類衍生物的合成、結(jié)構(gòu)鑒定與生物活性研究，2018方媛瑗,丁惠君.抗生素的生態(tài)毒性效應(yīng)研究進展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2018,41(5):102-110.李云鴿截短側(cè)耳素衍生物的設(shè)計、合成及抗菌活性研究，2019蔣紅霞,